Ein Mausmodell für Laser-induzierten CNV

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Kennzeichen der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration oder einer MD in einem einfach zu untersuchenden Tiermodell nachzubilden. Diese Methode kann verwendet werden, um verschiedene Facetten der neovaskulären A-MD-Forschung zu untersuchen, einschließlich der Frage, wie genetische Veränderungen oder pharmazeutische Behandlungen die Krankheit beeinflussen können oder wie sich die Krankheit unter verschiedenen bildgebenden Verfahren manifestieren kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie, wenn sie einmal beherrscht wird, leicht zu reproduzieren ist, so dass Experimente schnell und effizient durchgeführt werden können.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil ihnen die feine Geschicklichkeit und Koordination fehlt, um erfolgreich zu sein, die sich beide mit der Übung verbessern. Um die Position der Laserstation vorzubereiten, schalten Sie den Laser und die Spaltlampe an einem leicht zugänglichen Ort ein, schalten Sie den Laser ein und stellen Sie ihn auf die vorgegebenen Parameter ein. Hier wird die Einstellung 75 Mikrometer, Spotgröße, 100 Milliwatt Leistung und 100 Millisekunden Dauer verwendet.

Platzieren Sie dann die Anästhesie, den Tierwärmer, die Tücher und die Augentropfen in Reichweite des Laserbedieners. Nachdem Sie die erste Maus betäubt haben, legen Sie sie für etwa drei bis fünf Minuten auf den Tierwärmer. Führen Sie eine Zehenkneifung durch, um eine vollständige Betäubung zu gewährleisten.

Verwenden Sie dann ein gerolltes Taschentuch, um eine nasale Aspiration oder ein Abperlen der Flüssigkeit zu verhindern. Geben Sie einen 30-Mikroliter-Tropfen Tetracainhydrochlorid in jedes Auge. Warten Sie zwei Minuten, bis die Lösung einwirkt.

Tragen Sie anschließend einen Tropfen topisches tropisches Hilfsmittel auf jedes Auge auf, um die Pupillen zu erweitern. Und warten Sie zwei Minuten, bis die Lösung wirkt. Platzieren Sie nun schnell die Maus auf der Mausbühne und setzen Sie dann die Bühne auf die Kinnauflage der Spaltlampe.

Schalten Sie die Spaltlampe ein und stellen Sie sie auf die niedrigste Lichthelligkeit ein. Beurteilen Sie die Pupillenerweiterung der Maus. Wenn die Pupille keine Erweiterung von 2,5 bis drei Millimetern erreicht hat.

Legen Sie die Maus wieder in den Tierwärmer oder verabreichen Sie nach der Pupillenerweiterung einen zusätzlichen Tropfen Tropic Aide. Richten Sie die Maus so auf der Plattform aus, dass sie horizontal senkrecht zum Spaltbalken liegt. Drehen Sie die Maus leicht, so dass sie nicht in einem Winkel von etwa 170 Grad steht.

Positionieren Sie die Maus so nah wie möglich an der Spaltlampe, während Sie die Stabilität der Plattform beibehalten und dem Bediener genügend Platz für feinmotorische Manipulationen lassen. Sobald die Maus richtig positioniert ist, tragen Sie einen Tropfen künstliche Tränenlösung auf eine 25 Millimeter x 25 Millimeter große Glasabdeckfolie auf. Geben Sie außerdem einen Tropfen dieser Lösung auf das nicht zielgerichtete Auge der Maus, um eine Austrocknung zu verhindern.

Fassen Sie eine Ecke des Deckblatts zwischen Daumen und Zeigefinger und wickeln Sie die restlichen drei Finger um die Maus, um sowohl das Tier als auch die Hand des Bedieners zu stützen und zu stabilisieren. Drücken Sie dann vorsichtig auf die Abdeckung. Schieben Sie es auf das Auge der Maus, um die Hornhaut abzuflachen.

Positionieren Sie den Deckglas senkrecht zum Laserstrahlengang, um eine Streuung oder Reflexion des Strahls zu vermeiden. Schauen Sie durch die Spaltlampe und stellen Sie mit der freien Hand den Fokus ein, bis die Netzhaut ins Blickfeld kommt. Die Netzhaut sollte hellgelb bis rot erscheinen. Mit deutlichen roten Blutgefäßen bewegen Sie den Kopf der Maus oder das Deckglas langsam und vorsichtig, bis der Sehnerv sichtbar ist.

Der Sehnerv ist gelb und von ihm gehen mehrere Blutgefäße aus. Schalten Sie dann den Laserfokussierstrahl ein und bewegen Sie ihn so, dass er auf das retinale Pigmentepithel oder RPE des Augenhintergrunds fokussiert. Wenn der Fokussierstrahl oval oder unscharf zu sein scheint, stellen Sie den Fokus der Spaltlampe oder das Deckglas ein.

Wenn der Fokussierstrahl entsprechend eingestellt ist, verwenden Sie den Fußauslöser, um die Laserverabreichung zu starten. Unmittelbar nach der Laserverabreichung sollte sich eine Blase bilden. Läsionen mit trüben Rändern oder Augen mit blutenden Läsionen sollten von der Analyse ausgeschlossen werden. Achten Sie darauf, die Blasenbildung und einen klaren, scharf definierten kreisförmigen Bereich zu beobachten, der auf eine fokussierte Laserverbrennung hinweist.

Läsionen, die keine Blase erzeugen, induzieren CNV möglicherweise nicht angemessen. Erzeugen Sie zusätzliche Läsionen an allen gewünschten choroidalen Neovaskularisations- oder CNV-Positionen. Schalten Sie den Laser in den Standby-Modus, wenn er nicht verwendet wird, und notieren Sie in einem Labornotizbuch den Ort und das Ergebnis jeder Laserverabreichung.

Wiederholen Sie die Laserverabreichung für das zweite Auge der Maus mit einem frischen Deckblatt und der anderen Hand, um die Maus zu stabilisieren. Schalten Sie nach Abschluss aller Verabreichungen den Laser und die Spaltlampe aus, entsorgen Sie das Deckglas und setzen Sie die Maus auf das Tier. Makroskopisch wärmer.

Untersuchen Sie das Auge auf Hornhautoberflächen oder Kataraktverletzungen. Bringen Sie die Maus nach der Wiederherstellung wieder in ihren Käfig zurück. CNVs, quantifiziert durch Analyse von flach sitzenden Adertrauben nach Immunfluoreszenzfärbung.

Die Fit-c-Dextran-Markierung erfolgte über Perfusion unmittelbar vor der Tiertötung. Es folgte die Flächenquantifizierung mittels Thresholding in Bild J.Hier postmortale Immunfärbung mit dem Endothelzellmarker. Es wurde eine ISO-Selektion GS IB vier durchgeführt, gefolgt von einer Bildgebung mittels konfokaler Mikroskopie.

Es wurden 3D-Rekonstruktionen der CNV-Läsion auf FOSS und Seitenansicht erstellt. Die optische Kohärenztomographie wurde ebenfalls verwendet, um die CNV-Läsionen in vivo sichtbar zu machen. Hier ist ein Schnittbild der Netzhaut mit einer gelb eingekreisten CNV-Läsion zu sehen.

Es ist auch ein en FOSS-Bild der Läsion zu sehen, das gelb eingekreist ist. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 10 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sicherzustellen, dass das Tier richtig betäubt ist, und Ihre Hände so zu positionieren, dass es gestützt und stabil ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Fokus vermitteln können. Laserverbrennungen zur Induktion von CNV, die anschließend auf verschiedene Weise untersucht werden können.