Name: Ein Mausmodell für Laser-induzierten CNV (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Lernen Sie die laserinduzierte CNV-Induktion in Mäusen für AMD-Forschung. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht schnelle Experimente zur Untersuchung genetischer und pharmazeutischer Einflüsse auf die Neovaskularisation.

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Die Autoren danken Jonathan Chou, MD für seine Unterstützung bei der Vorbereitung und Bearbeitung des endgültigen Manuskripts und Wenzhong Liu für die OCT-Daten. Wir möchten uns auch für die Unterstützung durch den Macula Society Research Grant (AAF), die Unterstützung durch einen uneingeschränkten Zuschuss an die Northwestern University von Research to Prevent Blindness, Inc., New York, NY, USA, und die Unterstützung durch NIH-EY019951 bedanken.

Alle Tiere werden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden der Pflege und Verwendung von Labortieren Ausgabe 2013 behandelt, der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklärung für die Verwendung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research, und wie von der Institutional Animal zugelassen Pflege und Verwendung Komitee für Northwestern University. Hinweis: Das folgende Verfahren kann vollständig mit einem Bediener durchgeführt werden; ist es jedoch wesentlich effizienter mit zwei Operatoren durchgeführt mit den Aufgaben entsprechend aufgeteilt. 1. Bereiten Bahnhof Laser und Pre-Laser <ol><li> Positionieren Sie den Laser und Spaltlampe, wo sie leicht zugänglich sein. Schalten Sie Laser und stellen vor, bestimmten Parameter (zB 75 um Punktgröße, 100 mW Leistung, 100 ms Dauer). ACHTUNG: Stellen Sie sicher, Betreiber trägt alle Tier-und Laserschutz persönliche Schutzausrüstung und zugehörige Laser-Sicherheitsschilder befinden sich außerhalb des Verfahrens Raum angezeigt. <ol><li> Vor dem Einsatz von Versuchstieren, finden Sie ideale Parameter mit Hilfe einer Eich, nicht-experimentellen Maus. Laser-Parameter auf dem Laser abhängen. Ideal Parameter werden von der niedrigsten Laserleistungseinstellung, die konsequent verursacht &quot;Blase&quot; Bildung, wenn richtig scharf definiert. Video starten zB der Läsion mit der richtigen &quot;Blase&quot; Bildung. </li></ol></li><li> Bereiten Sie den Pre-Laserstation, so dass Anästhesie, Tierwärmer, Gewebetücher, und alle Augentropfen (Tropicamid, Tetracain und künstliche Tränen) sind leicht zu erreichen, um Bediener. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass Tier wärmer wird vorgewärmt, um Temperatur (37 ° C) vor der Injektion Anästhetikum in erste Maus, um Anästhesie induzierte Hypothermie vermeiden, zu korrigieren. </li></ol></li><li> Platzieren Sie die Maus auf der Bühne wärmeren so Wärme zu halten und warm bleiben, wenn Laser-Verfahren beginnt. </li></ol> 2. Maus Anästhesie und Pre-Laser-Vorbereitung <ol><li> Vor spritzening Anästhesie, inspizieren die Augen makroskopisch, um sicherzustellen, es hat keine Missbildungen oder Anomalien, die Hornhautklarheit (zB Katarakt) zu verringern. </li><li> Wiegen Sie die Maus. </li><li> Nehmen Sie Gewicht, Geschlecht, und Tier ID-Nummer. </li><li> Verwenden Gewicht, berechnen Sie entsprechende Menge an Narkosemittel auf Basis von Richtlinien, die von Institution gegeben (zB 100 mg / kg Ketamin-Hydrochlorid, 10 mg / kg Xylazin ODER Tribromethanol 250 mg / kg zu verwenden; für eine 20 g-Maus injiziert 0,20 ml Xylazin / Ketamin-Cocktail OR 0,25 ml Tribromethanol). Haben Sie eine Tabelle von vorberechneten Dosierungen pro Gewicht in Schritten von 1 g, um Rechenfehler zu reduzieren. </li><li> Scruff Maus und injizieren Narkose intraperitoneal auf Berechnungen in Schritt 2.4 basiert. </li><li> Platzieren Sie die Maus über Tier wärmer und warten Sie, bis der Maus vollständig durch die Überprüfung der Pedalreflex über toe Prise (ca. 3-5 min) anästhesiert. </li><li> Rollen Sie oben einen Gewebe zu wischen und zu schützen Nasenbereich die Maus, um zu verhindern aspiratIonenflüssigkeits roll-off. Roll-Maus auf die Seite und einen Tropfen (etwa 30 ul) Tetracainhydrochlorid in jedes Auge für die Lokalanästhesie. Warten Sie 2 Minuten für die Lösung zu übernehmen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.7 mit einem Tropfen topische Tropicamid zur Pupillenerweiterung. Alternativ können Sie Phenylephrinhydrochlorid (2,5%) für die Dilatation. </li><li> Warten Sie 2 Minuten nach Lösungen zu übernehmen; halten Tier auf wärmere während dieser Zeit. </li><li> Nach entsprechender Zeit abgelaufen ist, schnell die Maus an der Maus Bühne und platzieren Sie die Bühne, auf Kinnstütze der Spaltlampe. </li><li> Schalten Sie Spaltlampe auf die niedrigste Lichthelligkeit und überprüfen Sie den Grad der Pupillenerweiterung. Wenn Schüler nicht ausreichend geweitet (ungefähr 2,5-3 mm), Rück Maus, um Tier wärmer und warten. Alternativ zu verwalten einen Tropfen Tropicamid. Nach Augen ausreichend erweitert, um Laser-Prozedur fort. </li></ol> 3. Laser Procedure Hinweis: Stellen Sie sicher, andere personen im Zimmer Schutzbrille tragen, wenn weg von Laser-geschützten Spaltlampe Okular <ol><li> Anpassen der Positionierung der Maus auf der Mausstufigen, so dass sie sich hervorragend zur Visualisierung des Sehnervs (siehe 3.1.2) positioniert ist. <ol><li> Richten Sie die Maus auf der Halterung so dass es horizontal liegt, senkrecht zur Lampenträger geschlitzt, mit dem Kopf auf der einen Seite und Schwanz am anderen. Ideal Maus Platzierung machen Sehnerv Visualisierung viel einfacher, wenn Deckglas aufgebracht wird. </li><li> Leicht drehen Sie die Maus, damit es zu einem ~ 170 ° Winkel mit dem Kopf näher an Laser Betreiber ist. </li><li> Stellen Sie sicher, dass Maus ist so nahe wie möglich in der Lage Spaltlampe, aber immer noch, wo sie stabil und in dem die Hand des Bedieners wird genügend Platz für die Feinmanipulation haben ist. </li></ol></li><li> Nachdem die Maus ist ideal positioniert, einen Tropfen künstliche Tränenflüssigkeit auf einem 25 mm x 25 mm Deckglas. <ol><li> Geben Sie einen Tropfen künstliche Tränenflüssigkeit auf Maus opposite eye - dies stellt sicher, Auge hydratisiert und helfen Verzögerung Kataraktbildung. </li></ol></li><li> Halten Ecke des Deckglases zwischen Daumen und Zeigerfinger; Position, so daß das Glas zwischen den Spitzen der beiden Fingern gequetscht. </li><li> Sanft wickeln Sie die übrigen drei Finger um den Körper des Tieres für die Unterstützung und Stabilisierung der Hand. Position der Hand, so dass das Deckglas leicht auf das Auge des Maus platziert werden. <ol><li> Achten Sie darauf, dass das Handgelenk auf einer festen Oberfläche, um Zittern der Hand zu reduzieren stabilisiert. </li></ol></li><li> Sobald stabile Position erreicht ist, drücken Sie vorsichtig Deckglas (mit Tropfen künstliche Tränen noch eingehalten) auf das Auge des Maus. <ol><li> Sicherzustellen, dass das Deckplättchen möglichst senkrecht zu dem Laserstrahl, um Laserstrahlstreuung oder Reflexion zu verhindern positioniert. Das Deckglas wirkt wie eine Kontaktlinse, die Hornhaut zu glätten. </li></ol></li><li> Schauen Sie durch Spaltlampe und mit der freien Hand Knie konzentrieren until Netzhaut kann visualisiert werden. Die Netzhaut wird ein hellgelbes / rote Farbe je nach Standort sichtbar gemacht haben, werden verschiedene, rot Gefäße sichtbar sein. </li><li> Langsam und vorsichtig manipulieren Mauskopf und / oder Deckglas, bis die Visualisierung des Sehnervs. Der Sehnerv wird in der Farbe gelb mit mehreren Schiffen strahlenförmig von ihm zu sein. </li><li> Sobald Betreiber Visualisierung der Sehnerv bestätigt, schalten Sie Laser Fokussierstrahl. </li><li> Sobald Laserstrahl eingeschaltet wurde, zu manövrieren Laserfokussierungsstrahl in die gewünschte Position (etwa 1 Scheibendurchmesser vom Sehnerv). </li><li> Konzentrieren Laserstrahls auf dem RPE des Augenhintergrundes. Ein korrektes Fokussieren wird durch mit den schärfsten und klarsten Laserstrahl erreicht. Wenn Zielstrahl sieht oval oder unscharf, Kniespaltlampe Fokus oder Wiederposition Deckglas. </li><li> Sobald der Zielstrahl auf RPE konzentriert, zu initiieren Laser Verabreichung unter Verwendung des Lasers Fuß Auslöser. <ol><li> Achten Sie darauf, Netzhautgefäße zu verhindern, zu vermeiden Augeninnen ermorrhage. </li></ol></li><li> Uhr für das Auftreten einer Blase unmittelbar nach Laser Verabreichung. Der Umriss des Laserschuss sollte klar und nicht in irgendeiner Weise verschwommen sein. <ol><li> Wenn die Laserschuss nicht in Blasenbildung führen, oder den Bereich des Aufpralls sieht trübe (trübes Aussehen mit schlecht definierten Kreisgrenze gegen klare, scharf definierte Grenze für eine erfolgreiche Wirkung) oder wenn Blutung nach der Laser Verwaltung gesehen, weiß nicht sind diese Läsionen für eine spätere Analyse. </li></ol></li><li> Die Schritte 3.10-3.12 für alle gewünschten Positionen CNV (gewöhnlich 3, 6, 9 und 12 Uhr-Positionen in der Umgebung des Sehnervs). Wenn Laser Induktionen in annähernd gleichen Abstand von Sehnerv aufgetragen sollte Refokus nicht notwendig sein. Jedoch aufgrund der starken Krümmung der Maus Auge und kleinen Variationen, die in der Netzhaut bestehen kann, Refokussierung des Strahls erforderlich zwischen aufeinanderfolgenden Laser Behörden sein. </li><li> Nehmen Sie in einem Notizbuch die Lage und Folge der each Laserschuss Verwaltung und Ergebnis (erfolgreich, dunstig, Blutungen, etc.) jedes verabreicht Schuss für das Auge. Achten Sie darauf, um den Laser im Stand-by-Modus bei Nichtgebrauch zu platzieren. </li><li> Wiederholen von 3,1 bis 3,14 für die Maus andere Auge, falls erforderlich, mit der anderen Hand zur Stabilisierung und ein neues Deckglas. </li><li> Nachdem alle gewünschten Laserschüsse verabreicht werden, schalten Sie Laser und Spaltlampen. </li><li> Entsorgen Sie Deckglas und Ort der Maus an wärmeren für die Erholung von der Anästhesie. Makroskopisch inspizieren Auge für Verletzungen und einen Tropfen künstliche Tränenflüssigkeit, um das Auge zu halten hydratisiert und möglicherweise verhindern, dass künftige Kataraktentwicklung. Sobald die Maus wieder aus der Narkose, um Käfig zurück. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td></td><td> AVERTIN </td><td> AVERTIN </td><td> AVERTIN </td><td> XYL / KET </td><td> XYL / KET </td></tr><tr><td> Maus-Gewicht (g) </td><td> Dosis (mg / kg) </td><td&gt; Lösungskonzentration (mg / ml) </td><td> Narkosedosis (ml) </td><td> Dosis (mg / kg) </td><td> Narkosedosis (ml) </td></tr><tr><td> 15 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,1875 </td><td> 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> 16 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2 </td><td> 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin </td><td> 0,16 </td></tr><tr><td> 17 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2125 </td><td> 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin </td><td> 0,17 </td></tr><tr><td> 18 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,225 </td><td> 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin </td><td> 0,18 </td></tr><tr><td> 19 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2375 </td><td> 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin </td><td> 0.19 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,25</td><td> 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> 21 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2625 </td><td> 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin </td><td> 0,21 </td></tr><tr><td> 22 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,275 </td><td> 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin </td><td> 0,22 </td></tr><tr><td> 23 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2875 </td><td> 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin </td><td> 0,23 </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,3 </td><td> 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin </td><td> 0,24 </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,3125 </td><td> 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> 26 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,325 </td><td> 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin </td><td> 0.26 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 250 </td><td&gt; 20 </td><td> 0,3375 </td><td> 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin </td><td> 0.27 </td></tr><tr><td> 28 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,35 </td><td> 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin </td><td> 0,28 </td></tr><tr><td> 29 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,3625 </td><td> 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin </td><td> 0.29 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,375 </td><td> 100 mg / kg Ketamin; 10 mg / kg Xylazin </td><td> 0,3 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: XyIKet Dosierungstabelle.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Es gibt mehrere Faktoren, die Laser-Lieferung und resultierende CNV Läsionsentwicklung nach erfolgreicher Laserinduktion beeinflussen können. Diese Faktoren sollten für kontrollierte und um die zuverlässigsten Ergebnisse müssen vereinheitlicht werden. Der wichtigste dieser Faktoren sind Mausauswahl (Genotyp, Alter und Geschlecht), Anästhesieauswahl und Lasereinstellungen. Die spezifische Maus-Modell verwendet werden, können eine signifikante Wirkung auf den Verlauf der CNV Entwicklung. Das a...

Der altersbedingten Makuladegeneration (AMD) ist eine der Hauptursachen von Blindheit bei Personen im Alter von über 50 1-3. AMD kann in zwei Formen eingeteilt werden: atrophische (&quot;trocken&quot;) AMD und neovaskulären (&quot;wet&quot;) AMD. Ersteres wird durch geographische Atrophie des retinalen Pigmentepithel (RPE), Choriokapillaris und Photorezeptoren gekennzeichnet, während diese durch die Invasion der abnormen Gefäßen aus der Aderhaut in die äußeren Netzhautschichten gekennzeichnet Undichtigkeit verursachen, Blutungen, und Fibrose und schließlich was zu Blindheit 1,2. Der beiden Formen, Konten neovaskulärer AMD für die Mehrheit der Sehverlust 1. Glücklicherweise ist dieses Formular mit zahlreichen wirksamen pharmakologischen Management-Optionen, während sein Pendant atrophische derzeit hat kein nachweislich medizinische Behandlungen 3. Da darüber hinaus der neovaskulären Form wurde leicht in einem Tiermodell neu kapituliert, hat es mehr allgemein zugänglich, grundlegende A gewesenMD Forschung Erforschung der zugrunde liegenden Pathomechanismen, um neue Therapien 4 zu entwickeln. Die erste Tiermodell der experimentellen CNV (CNV) wurde durch Ryan et al. in nicht-menschlichen Primaten 5. Dieses Modell induzierten Ruptur der Bruch-Membran mittels Laser-Photokoagulation, die eine lokale Entzündungsreaktion, was zu Angiogenese ähnlich wie bei neovaskulärer AMD gesehen verursacht. Die histopathologischen Progression der Angiogenese post-Laserinduktions wurde festgestellt, neovaskulärer AMD, die das Modell der Gültigkeit 6 bestätigt imitieren. Primaten bieten die ähnlichste Anatomie den Menschen, aber leider sind teuer zu erhalten, kann nicht leicht genetisch manipuliert werden können, und eine langsame zeitliche Verlauf der Progression der Erkrankung. 7 Im Gegensatz dazu sind auch im Nagetiermodell sehr viel kostengünstiger zu erhalten, kann genetisch mit relativer Leichtigkeit gehandhabt werden, und haben eine viel schnellere COURSE der Krankheitsprogression (Versuche kann auf einer Zeitskala von Wochen statt Monate durchgeführt werden). Diese Versuche sollten nur in pigmentierten Nagetieren durchgeführt werden, da es sehr schwierig ist, bei Albino Tieren visualisieren. Die Maus Laser-induzierten CNV-Modell, die zuerst von der Campochiaro Gruppe in den späten 90er Jahren 10 entwickelt, hat sich zu der dominierende Tiermodell in der Mehrzahl der neueren Studien 11-16 sein. Aufgrund der komplexen und noch immer unklar Pathogenese der CNV, hat der Laser-Modell in allen Aspekten der feuchten AMD Forschung reichen von der Untersuchung der molekularen Mechanismen der Fahrt Angiogenese zur Bewertung neuer Behandlungsmodalitäten für zukünftige Anwendung beim Menschen angewendet. B. Sakurai et al. und Espinosa-Heidmann et al. verwendet das Lasermodell, um die Wirkung von Makrophagen auf die Entwicklung der CNV unter Verwendung transgener Mäuse und pharmakologische Behandlungen Verarmungs 15, 16 zu untersuchen. Giani et al. und Hoerster et al. gebrauchte optischen Kohärenztomographie (OCT), die dem Bild das laserinduzierte CNV in dem Bemühen, das Fortschreiten der CNV zu charakterisieren und vergleichen Sie die histopathologischen Befunden den Feststellungen auf OCT-Bildgebung 12,17 gesehen. Schließlich haben Studien mit intravitreale Injektion von anti-angiogene Mittel als Voraussetzung für Studien am Menschen eingesetzt worden und waren von entscheidender Bedeutung bei der Entwicklung der ersten Generation im Management der neovaskulären AMD heute 10,18,19 verwendet Anti-VEGF-Agenten. Alternative Modelle für experimentelle CNV nutzen zu chirurgischen Methoden zur CNV induzieren. Dieses Verfahren beinhaltet die Injektion pro-angiogene Substanzen (zB rekombinante virale Vektoren überexprimierenden VEGF, subretinalen Injektion von RPE-Zellen und / oder Polystyrolkügelchen), um die erhöhte Expression von VEGF in neovaskulären AMD gesehen imitieren, mit dem Ziel, wodurch die Angiogenese 8,20. , Liefert diese Methode jedoch eine drastisch geringere Inzidenz von Gefäßneubildung; Diese Studien zeigten, dass CNVC57 / BL6-Mäusen tritt in 31% der Injektionen gegen die ~ 70% Erfolgsrate in der Laser-Photokoagulation Verfahren in der gleichen Mäusestamm 8,14 gesehen. Aus diesen Gründen und angesichts der Vorteile der Verwendung von Nagetieren im Vergleich zu nicht-menschlichen Primaten, hat sich die Maus-Modell der Laser-induzierten CNV sich zum Standard-Tiermodell CNV für die meisten neovaskulärer AMD Studie Versuche 8. Die Maus-Auge ist ein winziges, empfindliche Gewebe, mit zu arbeiten. Manövrieren des Auges auf die Netzhaut zu visualisieren ist schwierig und erfordert viel Übung, bis Meisterschaft erreicht. Diese Aufgabe wird durch die Tatsache, dass es mit der dominanten und nicht-dominanten Hand gelernt werden kompliziert. Darüber hinaus, nachdem die feinen Bewegungen erforderlich, um die Netzhaut zu visualisieren gelernt wurden, die Koordination zwischen beiden Händen und dem Fußpedal Betrieb des Lasers sind wichtig. In diesem Artikel haben wir versucht, die Herausforderungen des Lernens alle physikalische Manipulationen in der Laser-induzierten CNV proc eingebunden zu destillierenEDURE in eine Führung, die helfen würden Betreiber zu erreichen schnellen Erfolg mit diesem Modell.

<table><tbody><tr><td>532 nm (grün) Argon-Ophthalmologielaser</td><td>IRIDEX</td><td>GLx</td><td>jeder ophthalmologische 532 nm (grün) Argonlaser kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Spaltlampe</td><td>Carl Zeiss</td><td>30SL-M</td><td>jede Spaltlampe kann verwendet werden, solange sie mit dem Laser kompatibel ist</td></tr><tr><td>Tribromethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402-25G</td><td>wird zur Herstellung von Anästhetikum</td></tr><tr><td>tert-Amylalkohol</td> verwendet <td>Sigma</td><td>152463-1L</td><td>wird zur Herstellung von Anästhetika verwendet</td></tr><tr><td>Braunglasfläschchen + Septen</td><td>Wheaton</td><td>WH-223696</td><td>Tribromethanol-Aufbewahrungstücher</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td>Sonstiges&nbsp;</td></tr><tr><td>1% Tropicamid</td><td>Falcon Pharmaceuticals</td><td>RXD2974251</td><td>Pupillenerweiterung</td></tr><tr><td>0,5% Tetracainhydrochlorid</td><td>Alcon</td><td>&nbsp; 0065-0741-12</td><td>topische Anästhesie</td></tr><tr><td>künstliche Tränen</td><td>Alcon</td><td>&nbsp; 58768-788-25</td><td></td></tr><tr><td>Hydratations-Wärmetherapiepumpe (zur Erwärmung von Tieren)</td><td>Kent Scientific</td><td>HTP-1500</td><td>zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur von Tieren</td></tr><tr><td>Warmhaltekissen</td><td>Kent Scientific</td><td>TPZ-0510EA</td><td>hält die Körpertemperatur von Tieren</td></tr><tr><td>aufrecht 30 G Insulinnadeln</td><td>BD</td><td>328418 IP-Anästhesie-Injektionswaage</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Amerikanische Waage</td><td>AWS-1KG-BLK</td><td>Maus Wiegen</td></tr><tr><td>Deckglas (25 mm x 25 mm)</td><td>VWR</td><td>48366089</td><td>Abflachung der Hornhaut zur Visualisierung der Netzhaut von Mäusen</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>aus der Institution</td><td>aus</td><td>der Anstaltsanästhesie</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>aus der Institution</td><td></td> aus der <td>Anstaltsanästhesie</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>für die volumetrische Rekonstruktion</td></tr><tr><td>verwendet ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>für die Bildanalyse</td></tr></tbody></table>

ein mausmodell für laser-induzierten cnv

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

Das Maus-Laser-induzierte choroidale Neovaskularisation (CNV) Modell war ein entscheidendes Hauptstützmodell für die neovaskuläre altersbedingte Makuladegeneration (AMD) Forschung. Durch die gezielte Laserverletzung des RPE und der Bruch-Membran induziert das Verfahren die Angiogenese und modelliert die charakteristische Pathologie, die bei neovaskulärer AMD beobachtet wird. 
Zuerst in nicht-menschlichen Primaten entwickelt, wurde das laserinduzierte CNV-Modell in vielen anderen Spezies implementiert, von denen die jüngste die Maus ist. Mausexperimente sind vorteilhaft kostengünstiger, Experimente können in einem viel schnelleren Zeitrahmen durchgeführt werden und sie ermöglichen die Verwendung verschiedener transgener Modelle. Die Miniaturgröße des Mausauges stellt jedoch eine besondere Herausforderung bei der Durchführung des Eingriffs dar. Die Manipulation des Auges zur Visualisierung der Netzhaut erfordert das Üben feiner Geschicklichkeit sowie die gleichzeitige Hand-Auge-Fuß-Koordination, um den Laser zu bedienen. Sobald das Modell jedoch beherrscht ist, kann es angewendet werden, um viele Aspekte der neovaskulären AMD zu untersuchen, wie z. B. molekulare Mechanismen, die Auswirkungen genetischer Manipulationen und die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung. 
Das laserinduzierte CNV-Modell ist zwar nützlich, aber kein perfektes Modell der Krankheit. Das Wildtyp-Mausauge ist ansonsten gesund, und die chorioretinale Umgebung ahmt die pathologischen Veränderungen bei der menschlichen AMD nicht nach. Darüber hinaus spiegelt die verletzungsinduzierte Angiogenese nicht die gleichen Signalwege wider wie die Angiogenese, die in einem altersbedingten und chronischen Krankheitszustand wie bei AMD auftritt.
Trotz seiner Unzulänglichkeiten ist das laserinduzierte CNV-Modell eine der besten Methoden, die derzeit verfügbar sind, um die schwächende Pathologie der neovaskulären AMD zu untersuchen. Seine Umsetzung hat zu einem tieferen Verständnis der Pathogenese der AMD geführt und zur Entwicklung vieler der derzeit verfügbaren AMD-Therapien beigetragen.

Die Quantifizierung der CNV Läsionen können durch die Analyse von Flach montiert Aderhaut mit Immunfluoreszenzfärbung, die CNV Schiffe kennzeichnen durchgeführt werden. Die beiden am häufigsten verwendeten Methoden der Gewebepräparation sind FITC-Dextran Kennzeichnung, über Perfusion unmittelbar vor dem Tieropfer oder Post-mortem-Immunfärbung mit einem Endothelzellen-Markierung. Beide dieser Verfahren wurden bereits im Detail beschrieben worden 13,14,21; Figuren 1 und 2 zeige...

Hier präsentieren wir das Maus-Laser-induzierte choroidale Neovaskularisation (CNV) Protokoll, ein experimentelles Modell, das die vaskulären Kennzeichen der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration (AMD) nachbildet. Einmal gemeistert, kann es zuverlässig und effektiv CNV als Modellsystem induzieren, um verschiedene experimentelle Maßnahmen zu testen.

Ein Mausmodell für Laser-induzierten CNV

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die charakteristischen Merkmale der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration oder a MD in einem leicht zu untersuchenden Tiermodell nachzubilden. Diese Methode kann verwendet werden, um verschiedene Aspekte der Forschung zur neovaskulären A MD zu untersuchen, einschließlich der Auswirkungen genetischer Veränderungen oder pharmazeutischer Behandlungen auf die Erkrankung sowie des Erscheinungsbilds der Erkrankung unter verschiedenen bildgebenden Verfahren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie, einmal beherrscht, leicht reproduzierbar ist und somit eine schnelle und effiziente Durchführung von Experimenten ermöglicht.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da ihnen die erforderliche Feinmotorik und Koordination fehlen, die sich jedoch mit der Übung verbessern. Um die Laserstation vorzubereiten, schalten Sie den Laser und die Spaltlampe ein, an denen er leicht zugänglich ist, und stellen Sie den Laser auf die vorbestimmten Parameter ein. Hier werden die Einstellungen 75 Mikrometer, Spotgröße, 100 Milliwatt Leistung und 100 Millisekunden Dauer verwendet.Stellen Sie als Nächstes die Anästhesie, die Tierwärmeplatte, Tücher und Augentropfen so bereit, dass der Laserbediener sie leicht erreichen kann. Nachdem die erste Maus anästhesiert wurde, legen Sie sie etwa drei bis fünf Minuten lang auf die Tierwärmeplatte. Führen Sie einen Zehenquetschtest durch, um die vollständige Anästhesie zu überprüfen.Danach mit einem aufgerollten Papiertuch verhindern, dass Flüssigkeitsablauf in die Nase gelangt. Geben Sie einen 30-Mikroliter-Tropfen Tetracainhydrochlorid in jedes Auge. Warten Sie zwei Minuten, bis die Lösung wirkt.Als Nächstes einen Tropfen topisches Tropic Aide auf jedes Auge auftragen, um die Pupillen zu weiten. Zwei Minuten warten, bis die Lösung wirkt. Danach die Maus schnell auf die Mäusehalterung setzen und die Halterung anschließend auf die Kinnstütze der Spaltlampe stellen.Schalten Sie die Spaltlampe ein und stellen Sie sie auf die niedrigste Helligkeit ein. Beurteilen Sie die Pupillenerweiterung der Maus. Wenn die Pupille keine Erweiterung von 2,5 bis drei Millimetern erreicht hat.Bringen Sie die Maus zurück auf die Tierwärmeplatte oder verabreichen Sie nach der Pupillenerweiterung einen weiteren Tropfen Tropicamid. Positionieren Sie die Maus auf der Plattform so, dass sie horizontal senkrecht zum Spaltstrahl liegt. Drehen Sie die Maus leicht, sodass sie nicht in einem Winkel von etwa 170 Grad steht.Wenn der Kopf näher zum Laserbediener ausgerichtet ist, positionieren Sie die Maus so nah wie möglich an der Spaltlampe, wobei die Plattformstabilität gewahrt bleibt und genügend Platz für den Bediener bleibt, um feinmotorische Handgriffe durchzuführen. Sobald die Maus korrekt positioniert ist, geben Sie einen Tropfen künstliche Tränenlösung auf ein 25 Millimeter mal 25 Millimeter großes Deckglas. Geben Sie außerdem einen Tropfen dieser Lösung auf das nicht behandelte Auge der Maus, um Austrocknung zu verhindern.Halten Sie eine Ecke der Deckglasplatte zwischen Daumen und Zeigefinger fest und umschließen Sie mit den übrigen drei Fingern die Maus, um sowohl das Tier als auch die Hand des Bedieners zu stützen und zu stabilisieren. Drücken Sie dann vorsichtig das Deckglas auf das Auge der Maus, um die Hornhaut zu glätten.Platzieren Sie die Deckglasplatte senkrecht zum Laserstrahlengang, um Streuung oder Reflexion des Strahls zu vermeiden. Blicken Sie durch die Spaltlampe und stellen Sie mit der freien Hand den Fokus so lange ein, bis die Netzhaut sichtbar wird. Die Netzhaut sollte hellgelb bis rot erscheinen, mit deutlich sichtbaren roten Blutgefäßen. Bewegen Sie langsam und vorsichtig den Kopf der Maus oder das Deckglas, bis der Sehnerv beobachtet werden kann.Der Sehnerv erscheint gelb mit mehreren Blutgefäßen, die strahlenförmig von ihm ausgehen. Schalten Sie dann den Laserfokussierstrahl ein und justieren Sie ihn so, dass er auf das retinale Pigmentepithel oder RPE des Augenhintergrundes fokussiert ist. Wenn der Fokussierstrahl oval oder unscharf erscheint, stellen Sie die Fokussierung des Spaltmikroskops oder die Deckglasposition nach.Wenn der Fokussierstrahl korrekt eingestellt ist, verwenden Sie den Fußschalter, um die Laserapplikation zu starten. Unmittelbar nach der Laserapplikation sollte sich eine Blase bilden. Läsionen mit verschwommenen Rändern oder Augen mit hämorrhagischen Läsionen sollten von der Analyse ausgeschlossen werden. Achten Sie darauf, dass sich eine Blase bildet und ein klar abgegrenzter, scharf umrissener kreisförmiger Bereich sichtbar ist, der auf eine fokussierte Laserverbrennung hinweist.Läsionen, die keine Blase bilden, induzieren möglicherweise keine angemessene choroidale Neovaskularisation. Erzeugen Sie zusätzliche Läsionen an allen gewünschten Positionen für die choroidale Neovaskularisation (CNV). Schalten Sie den Laser, wenn er nicht verwendet wird, in den Standby-Modus und dokumentieren Sie Ort und Ergebnis jeder Laserapplikation in einem Laborbuch.Wiederholen Sie die Laserapplikation am zweiten Auge der Maus mit einer neuen Deckglasabdeckung und der gegenüberliegenden Hand, um die Maus zu stabilisieren. Nach Abschluss aller Applikationen schalten Sie den Laser und die Spaltlampe aus, entsorgen das Deckglas und stellen die Maus auf das Tier. Makroskopisch wärmer.Untersuchen Sie das Auge auf Verletzungen der Hornhautoberfläche oder des Linsentrübungsgrades. Nach der Erholung das Mäuschen in seinen Käfig zurückbringen. Die CNV werden durch Analyse flach montierter Choroide nach immunfluoreszenter Färbung quantifiziert.Die Markierung mit c-Dextran erfolgte unmittelbar vor der Tötung des Tieres durch Perfusion. Anschließend erfolgte die Flächenquantifizierung mittels Schwellenwertanalyse in ImageJ. Danach wurde eine postmortale Immunfärbung mit dem Endothelzellmarker ISO-Selectin GS IB vier durchgeführt, gefolgt von der Bildaufnahme mittels konfokaler Mikroskopie.3D-Rekonstruktionen der CNV-Läsion in der FOSS- und Seitenansicht wurden erstellt. Zur Visualisierung der CNV-Läsionen in vivo wurde ebenfalls die optische Kohärenztomographie eingesetzt. Hier ist ein Querschnittsbild der Retina dargestellt, wobei eine CNV-Läsion gelb umkreist ist.Eine en FOSS-Aufnahme der Läsion wird ebenfalls gezeigt, die mit einem gelben Kreis hervorgehoben ist. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 10 Minuten durchgeführt werden. Während des Vorgehens ist es wichtig sicherzustellen, dass das Tier ordnungsgemäß anästhesiert ist, und die Hände so zu positionieren, dass es gestützt und stabil liegt.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Fokus einstellt. Mithilfe von Laserbrennungen kann eine CNV induziert werden, die anschließend auf verschiedene Weise untersucht werden kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Das Glaukom ist eine der Hauptursachen für Blindheit in der Welt. Erhöhten Augeninnendruck ist ein Hauptrisikofaktor. Laserkoagulation induzierte okulärer Hypertension ist eine der etablierten Tiermodell. Dieses Video zeigt, wie okulärer Hypertension durch Argon Laser-Photokoagulation bei Ratten zu induzieren.

Laser-induzierte chronische Ocular Hypertension Modell auf SD-Ratten

Chronische Augenhypertension induziert wird mittels Laserkoagulation der Trabekelnetzwerk in Maus Augen. Der Augeninnendruck (IOP) wird für mehrere Monate nach der Laser-Behandlung erhöht. Die Abnahme der Sehschärfe und Kontrastempfindlichkeit von Versuchstieren werden anhand des optomotor Test.

Ein Laser-induzierten Maus-Modell der chronischen Ocular Hypertension zu Sehfehler Charakterisierung

Neovaskularisation (NV) der Hornhaut können mehrere optische Pathologien erschweren. Mit Hilfe eines kontrollierten, alkali Verbrennungen Modell kann ein quantifizierbarer Höhe der Hornhaut NV für mechanistische Studie der Hornhaut NV und Bewertung von möglichen Therapien für neovaskulären Erkrankungen hergestellt werden.

Eine Alkali-brennen Verletzungsmodell der Hornhaut Neovaskularisation bei der Maus

Hier präsentieren wir Ihnen die Nützlichkeit der längs in-Vivo Bildgebung bei der Nachbereitung der morphologischen Veränderungen der laserinduzierten choroidale Neovaskularisation bei Mäusen.

In Vivo Multimodale Bildgebung und Analyse der laserinduzierten choroidale Neovaskularisation Mausmodell

Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für den retinalen Venenverschluss unter Verwendung von Rose Bengal und einem lasergesteuerten retinalen Bildgebungsmikroskopsystem mit Empfehlungen zur Maximierung der Reproduzierbarkeit in gentechnisch veränderten Stämmen.

Optimierung des Mausmodells mit retinalen Venenverschlüssen zur Begrenzung der Variabilität

Hier beschreiben wir eine in vivo bildgebende Technik mittels optischer Kohärenztomographie, um die Diagnose und quantitative Messung der Retinopathie bei Mäusen zu erleichtern.

Anwendung der optischen Kohärenztomographie auf ein Mausmodell der Retinopathie

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Implantation und Beurteilung des Melanoms in der murinen Aderhaut mittels optischer Kohärenztomographie.

Implantation und Beurteilung des Melanoms in der Aderhaut der Maus mittels optischer Kohärenztomographie

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die durch Alkaliverbrennungen induzierte Hornhautneovaskularisation bei Mäusen. Die Methode generiert ein reproduzierbares und kontrollierbares Hornhauterkrankungsmodell, um die pathologische Angiogenese und die damit verbundenen molekularen Mechanismen zu untersuchen und neue pharmakologische Wirkstoffe zur Verhinderung der Hornhautneovaskularisation zu testen.

Ein Mausmodell für Hornhautneovaskularisation durch Alkaliverbrennung

Derzeit ist die Fluoreszenzangiographie (FA) die bevorzugte Methode zur Identifizierung von Leckagemustern in Tiermodellen der choroidalen Neovaskularisation (CNV). FA liefert jedoch keine Informationen über die Gefäßmorphologie. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Indocyaningrün-Angiographie (ICGA) zur Charakterisierung verschiedener Läsionstypen von laserinduzierter CNV in Mausmodellen.

Charakterisierung der Gefäßmorphologie der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration durch Indocyaningrün-Angiographie

Indocyaningrün-Angiographie (ICGA oder) durch Schwanzveneninjektion durchgeführt, bietet hochwertige ICGA Zeitverlauf Bilder, Anomalien in der Maus Aderhaut zu charakterisieren.

Erkennen von Fehlbildungen in Aderhautgefäßsystem in einem Maus-Modell der Altersbedingte Makuladegeneration durch Zeitverlauf Indocyaningrün-Angiographie

Lernen Sie die laserinduzierte CNV-Induktion in Mäusen für AMD-Forschung. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht schnelle Experimente zur Untersuchung genetischer und pharmazeutischer Einflüsse auf die Neovaskularisation.

Ein Mausmodell für Laser-induzierten CNV

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