Vergleichende Analyse von Human Growth Hormone im Serum Mit SPRi, Nano-SPRi und ELISA-Assays

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, das diagnostische Potenzial der direkten und amplifizierten Oberflächenplasmonenresonanztomographie (SPRi-Assays) beim Nachweis von Biomarkern im Serum zu bewerten und direkt mit dem kommerziell erhältlichen Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit zu vergleichen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in einem biomedizinischen Bereich zu beantworten, wie z. B. die Hervorhebung des frühen Stadiums einer Krankheit und die Bereitstellung von Mitteln zur Überwachung der therapeutischen Wirksamkeit. Der Hauptvorteil von SPRi besteht darin, dass es eine markierungsfreie Echtzeitüberwachung und Visualisierung biomolekularer Wechselwirkungen ermöglicht, indem Änderungen des Brechungsindex in der Nähe der Sensoroberfläche aufgezeichnet werden.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose des hGH-Spiegels im Serum, da endogenes hGH mit zahlreichen medizinischen Erkrankungen in Verbindung gebracht wird, die das Wachstum und die Entwicklung des Menschen beeinträchtigen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Vorbereitung der Oberflächenchemie des Biochips schwer zu erlernen sind und jeder Fehler die Ergebnisse immens beeinflussen kann. Nach der Vorbereitung von Lösungen und Proteinproben gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie 120 Milliliter stabilisierte Piranha-Lösung, um den Goldchip durch Beschallung bei 50 Grad Celsius für 90 Minuten zu reinigen.

Spülen Sie den Chip mit Wasser ab und beschallen Sie ihn fünf Minuten lang mit Wasser. Spülen Sie den Chip dann mit Ethanol ab und trocknen Sie ihn mit einem Stickstoffstrahl. Legen Sie den Goldchip für 30 Minuten in eine UV-Ozonkammer, um alle Verunreinigungen zu entfernen.

Als nächstes fügen Sie 150 Milligramm 11-Mercaptoundecansäure zu 20 Millilitern Ethanol in ein Reagenzglas hinzu, das eine Kunststoffkappe enthält, um den Chip zu stützen, und einen Rührstab, um die Lösung homogen zu mischen. Legen Sie den Chip in das Reagenzglas und verschließen Sie es. Dann stellen Sie die Röhre bei 50 Watt und 50 Grad Celsius fünf Minuten lang in die Mikrowelle.

Spülen Sie den Chip mit Ethanol ab und weichen Sie ihn fünf Minuten lang in Ethanol ein. Wiederholen Sie das Spülen mit Wasser und lassen Sie es fünf Minuten lang einweichen. Geben Sie 150 Milligramm 1-Ethyl-3-carbodiimid in 20 Milliliter Wasser in ein Reagenzglas, das einen Rührstab enthält.

Übertragen Sie den Chip in das Reagenzglas und stellen Sie ihn wie gerade gezeigt in die Mikrowelle. Spülen Sie den Chip mit Wasser ab und weichen Sie ihn fünf Minuten lang in Wasser ein. Geben Sie dann 150 Milligramm N-Hydroxysuccinimid zu 20 Milliliter Wasser in ein Reagenzglas mit einem Rührstab

Geben Sie den Chip in das Reagenzglas, verschließen Sie ihn mit einer Kappe und stellen Sie ihn in die Mikrowelle. Nachdem Sie den Chip wie zuvor gespült und in Wasser eingeweicht haben, geben Sie 250 mikromolare Polyethylenglykol in 20 Millilitern Wasser in ein Reagenzglas mit einem Rührstab. Den Chip und die Mikrowelle hinzufügen, dann abspülen und wie zuvor mit Wasser einweichen.

Bereiten Sie 15 Mikrogramm pro Milliliter Anti-rhGH-Antikörperlösung und Anti-IgG als Negativkontrolle vor und geben Sie jeweils 10 Mikroliter in eine separate Vertiefung in einer 384-Well-Platte. Entwerfen Sie das Fleckenmuster im Microarrayer und markieren Sie den Chip mit einem 500-Mikrometer-Stift mit Teflonspitze mit den Antikörpern. Inkubieren Sie den gefleckten Chip zwei Stunden lang bei Raumtemperatur und 75 % Luftfeuchtigkeit.

Nach dem Einrichten des SPRi-Experiments und dem Blockieren des Chips gemäß dem Textprotokoll wird eine rhGH-Lösung mit den folgenden Konzentrationen in PBS hergestellt, die 10 % Serum und ein Milligramm pro Milliliter BSA enthält. Es ist wichtig, die Art des blockierenden Moleküls hervorzuheben, das in diesem Schritt ausgewählt wurde. Denn das Ziel ist es, die unspezifischen Wechselwirkungen zu minimieren.

Bereiten Sie eine Zwei-zu-Eins-Lösung her, indem Sie einen Mikroliter von sechs mikromolaren Biotin-markierten Anti-rhGH-Nachweisantikörpern zu drei Mikrolitern eines mikromolaren Streptavidin-beschichteten Nahinfrarot-Quantenpunkts in einem 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen. Injizieren Sie 150 Mikroliter hGH-dotierte Humanserumlösung in die Injektionsschleife. Auf einen starken Anstieg des Signals folgt ein langsamer Abfall des nicht spezifisch gebundenen Serums, das von der Oberfläche abgespült wird.

Sobald sich das Signal stabilisiert hat, verwenden Sie eine Lösung aus 450 Millimolar Natriumchlorid, die dem Laufpuffer zugesetzt wird, um die Oberfläche zu waschen. Die Lösung aus Anti-rhGH-Nachweisantikörpern und Quantenpunkten mit Laufpuffer auf eine Konzentration von 10 Nanomolar verdünnen und in die Durchflusszelle injizieren. Importieren Sie die Daten in ein Datenanalyseprogramm.

Zeichnen Sie dann das SPRi-Signal über die Zeit auf und bestimmen Sie die Differenz zwischen den Anti-rhGH- und den negativen Kontrollantikörperspots nach der hohen Salzwäsche. Um den ELISA durchzuführen, bereiten Sie nach der Vorbereitung der Reagenzien, Antikörper-beschichteten Vertiefungen und Standards gemäß dem Textprotokoll die Proben des rhGH-Hormons in 10% Humanserum in den folgenden Konzentrationen vor. Geben Sie 50 Mikroliter jedes Standards, jeder Kontrolle und jeder Probe in dreifacher Ausfertigung in jede Vertiefung.

Verschließen Sie dann die Vertiefungen und inkubieren Sie bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln über Nacht. Nehmen Sie die Platte am nächsten Tag aus dem Shaker und lassen Sie sie auf Zimmertemperatur kommen. Erwärmen Sie das Anti-rhGH-HRP, den Konjugatpuffer, den Waschpuffer, das Chromogentetramethylbenzidin oder TMB und stoppen Sie das Reagenz auf Raumtemperatur.

Um die Arbeitsreagenzien herzustellen, verwenden Sie einen konjugierten Puffer, um eine 40-fache Verdünnung von Anti-rhGH HRP herzustellen. Verwenden Sie destilliertes Wasser, um den Waschpuffer 200x zu verdünnen. Geben Sie 50 Mikroliter Anti-rhGH HRP-Konjugat in jede Vertiefung.

Verschließen Sie die Vertiefungen und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Dekantieren Sie die Lösung aus den Vertiefungen, drehen Sie die Platte um und klopfen Sie das saugfähige Gewebe trocken. Geben Sie 200 Mikroliter Waschpuffer in jede Vertiefung, bevor Sie ihn dekantieren und erneut trocken klopfen.

Wiederholen Sie den Waschgang dreimal. Es ist wichtig, auf die 96-Well-Platte zu klopfen, um Zusatzstoffe zu entfernen, da es nicht effektiv ist, sich auf die Pipette zu verlassen. Geben Sie anschließend innerhalb von 15 Minuten nach dem Waschschritt 100 Mikroliter Chromogen in jede Vertiefung

Bei Raumtemperatur im Dunkeln 30 Minuten lang unter leichtem Schütteln inkubieren. Die farblosen Lösungen werden blau. Geben Sie 100 Mikroliter des Stoppreagenzes in jede Vertiefung

Die Lösungen färben sich von blau nach gelb. Verwenden Sie ein Plattenlesegerät bei 450 Nanometern, um die Absorption jeder Vertiefung sofort abzulesen. Zeichnen Sie abschließend die Standardkurve für die bereitgestellten Standards und dann die optische Dichte des rhGH in 10%-Serumproben im Vergleich zur Konzentration jeder Probe.

In diesem Video wurde die Leistung von SPRi und Nano-SPRi mit ELISA zum Nachweis von rhGH verglichen. Diese Abbildung stellt die Titrationskurve von rhGH-Spikes in 10%igem Humanserum dar und wird gegen die erhaltene OD bei 450 Nanometern aufgetragen. Es wurde eine gute lineare Reaktion beobachtet, und die Nachweisgrenze wurde auf ein Nanogramm pro Milliliter festgelegt.

Hier wurde der Nachweis von rhGH mit SPRi untersucht. Jeder Punkt auf der Konzentrationsgradientenkurve stellt den Durchschnittswert der Reflektivitätsdifferenz dar, der aus drei kinetischen SPRi-Kurven für jede Konzentration berechnet wird. Die Nachweisgrenze (Limit of Detection, LoD) wurde auf 3,61 Nanogramm pro Milliliter festgelegt.

Um die Empfindlichkeit des SPRi-Biosensors zu erhöhen, wurden nacheinander Nano-Enhancer in den Sensor eingebracht. In diesem Experiment verstärkten die Nanoverstärker die Reaktion des Biosensors auf bis zu 7,9 %, jedoch mit minimaler Signaländerung zur Steuerung. Die Praktikabilität des Nano-SPRi-Biosensors wurde durch Messung des rhGH-Bereichs von 30.000 bis 0,25 Pikogramm pro Milliliter bewertet.

Der LoD wurde mit 9,2 Pikogramm pro Milliliter berechnet, und der Variationskoeffizient betrug 20 %. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde für den direkten Nachweis und in zwei Stunden für Nano-SPRi durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Bedingungen für jeden Schritt zu optimieren, und danach können die Ergebnisse in kürzerer Zeit leicht reproduziert werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können nach einem SPRi-Experiment weitere Methoden wie Multi-Tuff- und Mastrak-Analysen direkt auf dem Chip durchgeführt werden, um Ihnen zusätzliche Einblicke in das eingefangene Molekül zu liefern.

Nach ihrer Entwicklung soll diese Technik Forschern auf dem Gebiet der medizinischen Diagnostik den Weg ebnen, den Nachweis mehrerer Biomarker gleichzeitig zu erforschen, die mit Krebs, neurologischen und kardiovaskulären Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen SPRi-, einen Nano-SPRi- und ELISA-Assay für den Nachweis des hGH-Spiegels im menschlichen Serum einrichten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Reagenzien äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Schutzbrillen getroffen werden sollten.