Eine Strategie zur Validierung der Rolle der Kallose-vermittelten Plasmodesmal Gating im Tropic Antwort

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Gene zu screenen, die an der Callose-vermittelten Plasmodesmen-Gating während der tropischen Antwort beteiligt sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie der Pflanzen zu beantworten, beispielsweise welche unbekannten Gene die Zell-zu-Zell-Kommunikation über Plasmodesmen während der tropischen Antwort steuern. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie einfach, ebenfalls funktionsfähig und wiederholbar ist.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da das sorgfältige Handling der etiolierten Hypokotyle von Arabidopsis während des gesamten Verfahrens ohne Beschädigung herausfordernd ist. Wir hatten ursprünglich die Idee zu dieser Methode, als wir die Rolle von GSL8, einer Glucosylsynthase bei der Regulation der Plasmodesmen, etablierten. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die im Audio genannten Verfahren die kritischen Schritte, die aufgrund spezieller Ausrüstung und Handhabung schwer durchführbar sind, nicht erläutern.

Bereiten Sie ein Tag vor dem Experiment das Murashige-und-Skoog-Medium oder MS-Medium vor. Autoklavieren Sie es und füllen Sie 125-Millimeter-Quadratplatten mit jeweils 50 Milliliter Medium. Am nächsten Tag geben Sie sterilisierte Samen, die mit 1,1 % Natriumhypochlorit behandelt wurden, als Tropfen auf halbtrockene Platten.

Tragen Sie mit einer 1-Millimeter-Mikropipettenspitze 200 Mikroliter Wasser als Tropfen auf die Samen auf. Ordnen Sie die Samen in fünf Reihen im Abstand von 1,8 Zentimetern an, wobei die Samen innerhalb der Reihen mindestens 0,1 Zentimeter voneinander entfernt sein sollten. Lassen Sie etwas Wasser verdunsten, bevor Sie die Platten mit chirurgischem Klebeband abdecken und versiegeln.

Dann die Platten in Folie einwickeln und in einen Karton stellen. Den Karton drei Tage lang bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach dreitägiger Kältebehandlung den Karton mit den Samen drei Tage lang bei 22 Grad Celsius lagern.

Nach weiteren drei Tagen im Dunkeln überprüfen Sie unter grünem Licht den Keimungsstatus der Samen. Normalerweise wachsen drei Tage alte etiolierte Col-0-Sämlinge bis zu 1,6 Zentimeter lang. Analysieren Sie unter grünem Licht die veränderte phototrope und gravitrope Antwort.

Wählen Sie mit einem sterilisierten Bestäuber Keimlinge ähnlicher Größe mit geradem, vertikalem Wachstum aus. Heben Sie die Keimlinge vorsichtig am untersten Teil ihres Hypokotyls an, ohne andere Teile zu berühren. Überführen Sie die ausgewählten Keimlinge anschließend vorsichtig auf eine frische MS-Agarplatte.

Auf der neuen Platte orientieren Sie die Haken der Keimlinge in der gleichen Weise. Wählen Sie mindestens 20 Keimlinge jedes genetischen Hintergrunds, um jede Zeile zu bilden, und erstellen Sie eine Kopie jeder Platte. Jede Platte enthält zwei Genotypen in zwei Reihen.

Um die phototrope Reaktion zu überprüfen, platzieren Sie die Platten in einer schwarzen Box, sodass die Keimlinge vertikal ausgerichtet sind. Lassen Sie eine Seite der Box an der Kante der Platten offen. Inkubieren Sie dann die Box in einer Pflanzenwachstumskammer mit einseitigem weißem Licht.

Um die gravitropische Reaktion zu überprüfen, wickeln Sie die Platten mit Folie ein und legen Sie sie in eine schwarze Box, sodass die Keimlinge horizontal liegen. Bilden Sie die Platten zu mehreren Zeitpunkten, üblicherweise beginnend nach 90 Minuten und bis zu 12 Stunden, unter schwachen Lichtverhältnissen ab. Verwenden Sie einen Scanner, der auf die Aufnahme von JPEG-Bildern mit 600 DPI eingestellt ist.

Um den Biegungswinkel der Sämlinge zu messen, laden Sie deren Bilder in die ImageJ-Software. Verwenden Sie das Vergrößerungswerkzeug, um heranzuzoomen, und blättern Sie zu einem Sämling, der analysiert werden soll. Verwenden Sie anschließend das Winkelwerkzeug, um den Winkel zu messen, in dem der Sämling gebogen ist.

Führen Sie dazu einen Doppelklick mit der linken Maustaste auf den ursprünglichen Punkt A der Hypokotylwachstumsrichtung aus und ziehen Sie die Maus bis zum Biegungsanfangspunkt B. Zeichnen Sie dann mit einem Klick auf die linke Maustaste die erste Linie. Ziehen Sie anschließend die Maus vom Punkt B zum Ende der Biegung, Punkt C, und zeichnen Sie mit einem Klick auf die linke Maustaste die zweite Linie, wodurch ein Winkel A entsteht. Der tatsächliche Biegungswinkel ist Winkel B, der gleich 180 Grad minus Winkel A ist. Messen und notieren Sie nun Winkel A, indem Sie die Taste M auf der Tastatur drücken. Die Ergebnisdatei öffnet sich separat.

Wiederholen Sie den vorherigen Schritt für die Messung der restlichen Keimlinge und messen Sie den durchschnittlichen Winkel für zwei verschiedene Hintergründe mithilfe der Datensatz-Tabellendatei. Die Herstellung der HPTS-Agarose-Blöcke, die für diesen Assay benötigt werden, ist im Textprotokoll beschrieben. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Pflanzenproben.

In diesem Beispiel werden Mutanten mit einer veränderten Größenausschlussgrenze der Plasmodesmen analysiert. Erstellen Sie zunächst eine Plattform für den Assay. Legen Sie eine Mikroskop-Deckglas auf eine neue MS-Medium-Platte.

Als Nächstes schneiden Sie mit einer scharfen chirurgischen Schere die dreitägigen etiolierten Sämlinge von MS-Platten vorsichtig an der Basis der Hakenkrümmung ab und überführen sie auf das Deckglas. Überführen Sie mindestens fünf Sämlinge pro genetischem Hintergrund. Richten Sie die Sämlinge so aus, dass nur 0,5 Zentimeter des Hypokotyls ab der Schnittstelle auf dem Deckglas verbleiben und der Rest des Hypokotyls das Medium berührt.

Danach einen HPTS-Agarose-Block auf die ausgeschnittenen Sämlinge legen, sodass der ausgeschnittene Bereich mit dem HPTS-Block in Kontakt steht. Sicherstellen, dass der Kontakt hergestellt ist. Den Block fünf Minuten lang auf den Hypokotylen belassen.

Überführen Sie dann die Hypokotyle in eine 10 mm große Petrischale, die doppelt destilliertes Wasser enthält, und waschen Sie sie unter Schütteln 15 Minuten lang. Danach überführen Sie die gewaschenen Keimlinge auf einen Objektträger. Stellen Sie jeden Mutanten neben eine Kontrolle, um direkte Vergleiche anzustellen.

Bedecken Sie die Hypokotyle mit 100 bis 150 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser und legen Sie eine Deckglas auf. Analysieren Sie nun die Probe mittels konfokaler Mikroskopie, wie im textlichen Protokoll beschrieben. Verwenden Sie für diesen Test frisch zubereitete Farblösung, die weniger als zwei Tage alt ist und im Dunkeln aufbewahrt wurde.

Um die de novo-Callose-Synthese zu hemmen, 1,5 Millimolar 2-Desoxy-D-glucose zum Farbstoff hinzufügen. Beginnen Sie diesen Assay mit der Auswahl dreitägiger etiolierter Sämlinge für die Callose-Färbung, mit oder ohne tropische Reaktion. Schneiden Sie die Sämlinge mit einer dünnen chirurgischen Schere aus ihrem Hakenbereich heraus.

Danach die Sämlinge mit der Spitze eines Zahnstochers in eine kleine Petrischale überführen, die zwei Milliliter Färbe-Puffer enthält. Inkubieren Sie die Sämlinge zwei Stunden im Dunkeln bei kontinuierlichem Schütteln mit 30 U/min im Färbe-Puffer. Nach der Färbung die Sämlinge zweimal zwei Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser waschen, um überschüssigen Färbe-Puffer zu entfernen.

Nach dem Waschen mindestens fünf Sämlinge jedes Hintergrunds für die konfokale Analyse auswählen. Die Intensität des Callose-Signals mit der ImageJ-Software messen. Die bereits im JPEG-Format gespeicherte Datei der konfokalen Mikroskopie in der Bildverarbeitungssoftware öffnen.

Als Nächstes verwenden Sie das rechteckige Auswahlwerkzeug, ziehen den Cursor über das Bild und wählen den zu untersuchenden Bereich aus. Danach messen und notieren Sie die numerischen Werte für die Signalintensität, indem Sie die Taste M drücken. Die Ergebnisdatei öffnet sich separat. In der Ergebnisdatei bezeichnet der Begriff „Mean“ die Signalintensität des ausgewählten Bereichs, nicht den Mittelwert mehrerer Bereiche.

Einzeln nacheinander das Signal auf diese Weise für jede Sämling analysieren. Den oben beschriebenen Schritt zur Messung der übrigen Sämlinge wiederholen und den durchschnittlichen Winkel von zwei verschiedenen Hintergründen mithilfe der Datensatz-Tabellendatei bestimmen. Mithilfe der beschriebenen Protokolle wurden Dexamethason-induzierbare RNAi-Linien von AtGSL8 analysiert.

Die DsGSL8-Sämlinge wiesen deutliche Defekte in der Phototropie und Gravitropie auf. Sie zeigten keine Biegung unter dem Einfluss einer dieser Kräfte. Veränderungen in der symplastischen Bewegung zeigten, dass die Bewegung des HPTSA-Farbstoffs in dsGSL8-RNAi-Reduktionen deutlich umfangreicher war als in den Kontrollen.

Callose ist einer der wichtigsten Regulatoren der Größenausschlussgrenze von Plasmodesmen, und AtGSL8 ist eine bekannte Callose-Synthase an Plasmodesmen. Daher wurde eine Anilinblaufärbung für Callose durchgeführt. In der Kontrolle reicherte sich Callose nach sechs Stunden an, wie durch gelbe Pfeile markiert.

Jedoch wiesen die Mutanten nach sechs Stunden nach wie vor niedrige Kallosewerte in den Plasmodesmen auf. Das Fehlen der Kallosesynthese war bereits drei Stunden nach der Phototropie messbar geringer. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine schnelle Gen-Screening-Methode für Varianten durchführt, die die Plasmodesmenregulation aufgrund tropischer Reaktionen durch alleinige Modulation von Kallose steuern.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie innerhalb von etwa sechs Stunden durchgeführt werden, nachdem die Arabidopsis-Keimlinge drei Tage lang gekeimt wurden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, die Keimlinge beim Umpflanzen nicht zu beschädigen. Außerdem ist es wichtig, während des Beladungsassays einen geeigneten Kontakt zwischen dem Agar und dem Hypokotyl herzustellen.

Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik der Entwicklungsbiologie den Weg, um Gene, neue Gene, zu erforschen, die eine Rolle bei der Steuerung der symplastischen Leitfähigkeit während der Tropismusentwicklung spielen.