Eine Strategie zur Validierung der Rolle der Kallose-vermittelten Plasmodesmal Gating im Tropic Antwort

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Gene zu screenen, die an der Callose-vermittelten plasmodesmalen Gating während der tropischen Reaktion beteiligt sind. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Pflanzenentwicklungsbiologie zu beantworten, z. B. welche unbekannten Gene die Zell-zu-Zell-Signalübertragung durch Plasmodesmata während der tropischen Reaktion steuern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einfach ist, auch funktioniert und sich wiederholen kann.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Handhabung der etiolierten Hypokotyle von Arabidopsis ohne Beschädigung während des gesamten Prozesses eine Herausforderung darstellt. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmal, als wir die Regel von GSL8, einer Glukosesynthase im plasmosmodesmalen Gating, etablierten. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die im Audio erwähnten Verfahren die kritischen Schritte nicht erklärt haben, die schwierig auszuführen sind, da sie eine spezielle Einrichtung und Handhabung erfordern.

Bereiten Sie Murashige und Skoog oder MS medium einen Tag vor dem Experiment vor. Autoklavieren Sie es und füllen Sie quadratische 125-Millimeter-Platten mit 50 Millilitern Medium pro Platte. Am nächsten Tag die mit 1,1 % Natriumhypochlorit sterilisierten Samen auf halbgetrockneten Platten tupfen.

Tupfen Sie die Samen aus einer 1-Millimeter-Mikropipettenspitze mit 200 Mikrolitern Wasser ab. Ordnen Sie die Samen in fünf Reihen im Abstand von 1,8 Zentimetern an, wobei die Samen in den Reihen mindestens 0,1 Zentimeter voneinander entfernt sind. Lassen Sie etwas Wasser verdunsten, bevor Sie die Platten mit chirurgischem Klebeband abdecken und versiegeln.

Wickeln Sie dann die Teller in Folie ein und legen Sie sie in eine Schachtel. Inkubieren Sie die Box drei Tage lang bei vier Grad Celsius. Nach drei Tagen Kältebehandlung die Kiste mit den Samen drei Tage lang auf 22 Grad Celsius bringen.

Nach weiteren drei Tagen überprüfst Du in einem dunklen Raum den Keimstatus der Samen unter grünem Licht. Normalerweise werden drei Tage alte Col-0-etiolierte Sämlinge bis zu 1,6 Zentimeter lang. Analysieren Sie unter grünem Licht die veränderte phototrope und gravitrope Reaktion.

Wählen Sie mit einem sterilisierten Pickel ähnlich große Sämlinge mit geradem, vertikalem Wachstum aus. Heben Sie die Sämlinge vorsichtig aus dem untersten Teil ihres Hypokotyls an, ohne andere Teile zu berühren. Übertragen Sie dann die ausgewählten Sämlinge vorsichtig auf eine frische MS-Agarplatte.

Richten Sie auf der neuen Platte die Haken der Sämlinge auf die gleiche Weise aus. Wählen Sie mindestens 20 Sämlinge jedes genetischen Hintergrunds aus, um jede Reihe zu erstellen, und erstellen Sie von jeder Platte ein Duplikat. Jede Platte enthält zwei Genotypen in zwei Reihen.

Um die phototrope Reaktion zu überprüfen, positionieren Sie die Platten in einer Blackbox, so dass die Sämlinge vertikal ausgerichtet sind. Lassen Sie eine Seite der Schachtel bis zum Rand der Platten offen. Inkubieren Sie dann die Box in einer Pflanzenwachstumskammer mit einseitigem weißem Licht.

Um die gravitropische Reaktion zu überprüfen, wickeln Sie die Platten mit Folie ein und legen Sie sie in eine schwarze Box, so dass die Sämlinge horizontal stehen. Zu verschiedenen Zeitpunkten, in der Regel beginnend bei 90 Minuten und bis zu 12 Stunden, werden die Platten bei schlechten Lichtverhältnissen abgebildet. Verwenden Sie ein Scanner-Set, um JPEG-Bilder mit 600 DPI zu erfassen.

Um den Biegewinkel der Sämlinge zu messen, laden Sie ihre Bilder in die ImageJ-Software. Verwenden Sie das Lupenwerkzeug, um die Ansicht zu vergrößern, und scrollen Sie zu einem Sämling, den Sie analysieren möchten. Verwenden Sie dann das Winkelwerkzeug, um den Winkel zu messen, in dem der Sämling gebogen wird.

Um dies zu tun, doppelklicken Sie mit der linken Maustaste auf den ursprünglichen Hypokotyl-Wachstumsrichtungspunkt A und ziehen Sie die Maus auf den Biegeinitiierungspunkt B. Zeichnen Sie dann mit einem Linksklick die erste Linie. Ziehen Sie nun die Maus von Punkt B zum Biegeende, Punkt C, und verwenden Sie einen Linksklick, um die zweite Linie zu zeichnen, die einen Winkel A bildet.Der wahre Biegewinkel ist Winkel B, der gleich 180 Grad minus Winkel A ist.Messen und notieren Sie nun Winkel A, indem Sie M auf der Tastatur drücken. Die Ergebnisdatei wird separat geöffnet.

Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, um den Rest der Sämlinge zu messen, und messen Sie den durchschnittlichen Winkel von zwei verschiedenen Hintergründen mithilfe der Datensatztabellendatei. Die Vorbereitung der HPTS-Agaroseblöcke, die für diesen Assay benötigt werden, ist im Textprotokoll beschrieben. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Pflanzenproben.

In diesem Beispiel werden Mutanten mit einer veränderten Plasmodesmata-Größenausschlussgrenze analysiert. Erstellen Sie zunächst eine Plattform für den Assay. Platzieren Sie einen Objektträger für das Mikroskop auf einer neuen MS-Mediumplatte.

Als nächstes schneiden Sie die Sämlinge von MS-Platten mit drei Tage alten etiolierten Sämlingen mit einer scharfen chirurgischen Schere vorsichtig von der Basis des Hakens ab und übertragen sie auf das Deckglas. Übertragen Sie mindestens fünf Sämlinge pro genetischem Hintergrund. Richten Sie die Sämlinge so aus, dass nur 0,5 Zentimeter Hypokotyl von der Exzisionsposition auf dem Deckobjektträger verbleiben und der Rest des Hypokotyls das Medium berührt.

Lege dann einen HPTS-Agaroseblock auf die herausgeschnittenen Sämlinge, so dass der herausgeschnittene Bereich in Kontakt mit dem HPTS-Block ist. Stellen Sie sicher, dass der Kontakt hergestellt wurde. Lassen Sie den Block fünf Minuten lang auf den Hypokotylen sitzen.

Übertragen Sie dann die Hypokotyle in eine 10 Millimeter große Petrischale mit doppelt destilliertem Wasser und waschen Sie sie 15 Minuten lang unter Schütteln. Übertragen Sie als Nächstes die gewaschenen Setzlinge auf eine Folie. Platzieren Sie jede Mutante neben einem Steuerelement, um direkte Vergleiche anzustellen.

Bedecken Sie die Hypokotyle mit 100 bis 150 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser und tragen Sie einen Objektträger auf. Analysieren Sie nun den Objektträger mit konfokaler Mikroskopie, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie für diesen Assay frisch zubereiteten Farbstoff, der weniger als zwei Tage alt ist und im Dunkeln aufbewahrt wird.

Um die De-novo-Callose-Synthese zu hemmen, fügen Sie dem Farbstoff 1,5 Millimolar 2-Desoxy-D-Glukose hinzu. Beginnen Sie diesen Assay mit der Auswahl von drei Tage alten etiolierten Sämlingen für die Callose-Färbung, mit oder ohne tropische Reaktion. Schneide die Sämlinge mit einer dünnen chirurgischen Schere aus dem Hakenbereich ab.

Übertragen Sie die Sämlinge dann mit der Spitze eines Zahnstochers in eine kleine Petrischale, die zwei Milliliter Färbepuffer enthält. Inkubieren Sie die Sämlinge im Färbepuffer im Dunkeln zwei Stunden lang unter ständigem Schütteln bei 30 U/min. Waschen Sie die Sämlinge nach dem Färben zwei Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser, um den überschüssigen Fleckenpuffer zu entfernen.

Nach dem Waschen wählen Sie mindestens fünf Sämlinge jedes Hintergrunds für die konfokale Analyse aus. Messen Sie die Intensität des Callose-Signals mit der ImageJ-Software. Öffnen Sie die bereits im JPEG-Format gespeicherte konfokale Mikroskopiedatei in der Bildgebungssoftware.

Ziehen Sie anschließend mit dem rechteckigen Auswahlwerkzeug den Cursor über das Bild und wählen Sie den zu untersuchenden Bereich aus. Messen und notieren Sie dann die numerischen Werte für die Signalintensität, indem Sie M drücken.Die Ergebnisdatei wird separat geöffnet. In der Ergebnisdatei gibt der Begriff "Mittelwert" die Signalintensität des ausgewählten Bereichs an, nicht den Mittelwert mehrerer Bereiche.

Analysieren Sie das Signal nacheinander auf diese Weise für jeden Sämling. Wiederholen Sie den obigen Schritt, um den Rest der Sämlinge zu messen, und messen Sie den durchschnittlichen Winkel zweier verschiedener Hintergründe mithilfe der Datensatztabellendatei. Unter Verwendung der beschriebenen Protokolle wurden Dexamethason-induzierbare RNAi-Linien von AtGSL8 analysiert.

DsGSL8-Sämlinge wiesen deutlich Mängel in Bezug auf Phototropismus und Gravitropismus auf. Sie zeigten keine Biegung unter dem Einfluß einer der beiden Kräfte. Veränderungen in der symplasmatischen Bewegung zeigten, dass die HPTSA-Farbstoffbewegung bei dsGSL8-RNAi-Knockdowns wesentlich umfangreicher war als bei beiden Kontrollen.

Callose ist einer der wichtigsten Regulatoren der Plasmodesmata-Größenausschlussgrenze, und AtGSL8 ist eine bekannte Plasmodesmata-Callose-Synthase. Daher wurde eine Callose-Anilinblau-Färbung durchgeführt. In der Kontrolle sammelte sich Callose nach sechs Stunden an, wie durch gelbe Pfeile markiert.

Nach sechs Stunden wiesen die Mutanten jedoch anhaltend niedrige Plasmodesmata Callose-Spiegel auf. Diese Abwesenheit der Callose-Synthese war bereits drei Stunden nach dem Phototropismus messbar geringer. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein schnelles Screening von Genen bei der variantenkontrollierenden plasmodesmalen Gatung aufgrund der tropischen Reaktion durch Modulation reiner Kallose durchführen können.

Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in etwa sechs Stunden nach dreitägiger Keimung der Arabidopsis-Sämlinge durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass die Sämlinge beim Umsetzen nicht beschädigt werden. Außerdem ist es wichtig, während des Belastungsassays einen ordnungsgemäßen Kontakt zwischen dem Agar und dem Hypokotyl herzustellen.

Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Entwicklungsbiologie zur Erforschung von Genen, neuen Genen, die eine Rolle bei der Kontrolle der symplasmatischen Leitfähigkeit während des Tropismus spielen