Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Menge jeder Phosphoinositidspezies in Zellen unter verschiedenen genetischen und Umweltbedingungen zu messen, um die Funktion und Regulation von Phosphoinositid zu verstehen. Phosphoinositid-Lipide steuern Zellfunktionen wie Migration, Replikation und Gedächtnistransport. Diese Methode identifiziert genetische und Umweltbedingungen, die sich auf Phosphoinositide auswirken, und erweitert unser Wissen über ihre Regulation und Funktion.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine genaue, gleichzeitige Messung aller Phosphoinositide in den Zellen ermöglicht. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Regulation von Phosphoinositiden in Hefen geben kann, kann sie auch auf kultivierte Säugetierzellen angewendet werden. Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, werden aufgrund der vielen Schritte, die für die Beschriftung, Verarbeitung und Analyse erforderlich sind, Schwierigkeiten haben.

Wir empfehlen, zuerst ohne die radioaktive Markierung zu üben. Zu Beginn züchten Sie eine 20-Milliliter-Flüssigkultur des Hefestamms SEY6210 in einem vollständigen synthetischen Medium bei 30 Grad Celsius unter ständigem Schütteln bis zur Mitte der logarithmischen Phase. Als nächstes werden insgesamt 10 bis 14 OD der Hefezellen in ein 12-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden überführt und fünf Minuten lang bei 800 mal G zentrifugiert.

Dekantieren Sie das Medium. Und suspendieren Sie das Pellet in 2 Millilitern inositolfreiem Medium. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut.

Und dann das Pellet in 440 Mikrolitern inositolfreiem Medium wieder suspendieren. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie nach der Inkubation 60 Mikroliter Tritium-markiertes Myo-Inositol hinzu und züchten Sie die Zellen für weitere ein bis drei Stunden bei 30 Grad Celsius unter ständigem Schütteln.

Die Zellsuspension wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das 500 Mikroliter 9%ige Perchlorsäure und 200 Mikroliter säuregewaschene Glasperlen enthält. Mischen Sie, indem Sie das Röhrchen wiederholt umdrehen und dann fünf Minuten lang auf Eis inkubieren. Wirbeln Sie das Rohr anschließend 10 Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit durch.

Übertragen Sie dann das Lysat mit einer Gelladespitze in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, um ein Ansaugen der Glasperlen zu vermeiden. Zentrifugieren Sie anschließend das Röhrchen und verwerfen Sie den Überstand. Das Pellet wird in einem Milliliter eiskaltem 100 Millimolar EDTA beschallt, bis es vollständig dispergiert ist, und erneut zentrifugieren.

Nach dem Zentrifugieren wird das EDTA aus dem Röhrchen mit dem radioaktiv markierten Pellet aspiriert. Fügen Sie 50 Mikroliter Wasser hinzu und beschallen Sie, um das Pellet wieder zu suspendieren. Bereiten Sie ein frisches Deacylierungsreagenz gemäß dem Textprotokoll vor.

Geben Sie dann 500 Mikroliter des Deacylierungsreagenzes in das Röhrchen und beschallen Sie es, um es zu mischen. Die Probe wird 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Übertragen Sie die Probe anschließend für 50 Minuten in einen Heizblock bei 53 Grad Celsius.

Geben Sie die Probe anschließend in eine Vakuumzentrifuge und lassen Sie sie mindestens drei Stunden trocknen. Suspendieren Sie das Pellet erneut, indem Sie es in 300 Mikrolitern Wasser beschallen und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend wird die Probe in einer Vakuumzentrifuge für mindestens drei Stunden vollständig getrocknet.

Geben Sie nach dem Trocknen 450 Mikroliter Wasser in das Rohr und suspendieren Sie das Pellet durch Beschallen, bis es vollständig dispergiert ist. Bereiten Sie das frische Extraktionsreagenz gemäß dem Textprotokoll vor. Geben Sie 300 Mikroliter Extraktionsreagenz hinzu und wirbeln Sie sie fünf Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit auf.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen zwei Minuten lang bei 18000 mal G und pipettieren Sie die untere wässrige Schicht vorsichtig in ein neues Röhrchen. Anschließend wird die endgültige wässrige Fraktion durch Vakuumzentrifugation mindestens drei Stunden lang getrocknet. Anschließend wird das Pellet durch Beschallung von 50 Mikrolitern Wasser vollständig dispergiert und die Probe bei 20 Grad Celsius gelagert.

Bestimmen Sie schließlich die Radioaktivität der Probe, indem Sie zwei Mikroliter bis vier Milliliter Szintillationsflüssigkeit in ein 6-Milliliter-Szintillationsfläschchen aus Polyethylen geben. Erfassen Sie den CPM des Fläschchens mit einem Flüssigszintillationszähler bei offenem Fenster. Um das HPLC-System für die Trennung der Tritium-markierten Glycero-Inositide einzurichten, bereiten Sie zunächst die Puffer A und B sowie die Chromatographiesäule gemäß dem Textprotokoll vor.

Als nächstes werden 10 Millionen CPM der Probe in ein Zwei-Milliliter-Injektionsfläschchen geladen, das mit einem federbelasteten 250-Mikroliter-Einsatz ausgestattet ist, und Wasser für ein Gesamtvolumen von 55 Mikrolitern hinzugefügt. Verschließen Sie das Fläschchen mit einem Schraubverschluss, der mit einem PTFE-Silikonseptum ausgestattet ist, und legen Sie es zusammen mit einem Wasserrohling in ein ähnliches Fläschchen in die Auto-Probenahmeschale des HPLC-Systems. Programmieren Sie mit der Software auf dem HPLC-System ein Elutionsprotokoll.

Ein Prozent Puffer B für fünf Minuten, ein bis 20 Prozent B für vierzig Minuten, 20 bis 100 Prozent B für zehn Minuten, 100 % B für fünf Minuten, 100 bis ein Prozent B für zwanzig Minuten und dann ein Prozent B für zehn Minuten. Stellen Sie die Fördermenge der Pumpe über 90 Minuten auf 1,0 Milliliter pro Minute und die Druckgrenze auf 400 bar ein. Richten Sie anschließend ein Nachweisprotokoll auf dem Durchflussszintillator ein, das 60 Minuten lang läuft, mit einer Durchflussrate der Szintillationsflüssigkeit von 2,5 pro Minute und einer Verweilzeit von 8,57 Sekunden.

Als nächstes programmieren Sie eine automatisierte Injektionssequenz auf der HPLC, die mit dem Wasserblindwert beginnt, der das Äquilibrierungsprotokoll ausführt, gefolgt von der radioaktiv markierten Probe auf dem Elutionsprotokoll. Bevor das Äquilibrierungsprotokoll abgeschlossen ist, erstellen Sie eine Chargensequenz auf dem Durchflussszintillator, um alle Proben mit dem Nachweisprotokoll zu messen, das durch das Elutionsprotokoll ausgelöst wird. Um die HPLC-Daten zu analysieren, öffnen Sie zunächst die Rohdatendatei für jede Probe mit der Chromatographen-Quantifizierungssoftware.

Vergrößern Sie die Ansicht auf der Registerkarte Chromatogramme, um die kleineren Peaks unter Beibehaltung der Zeitauflösung zu dehnen. Verwenden Sie das Werkzeug ROI hinzufügen, um jeden Peak für die Analyse hervorzuheben, und identifizieren Sie dann die Peaks basierend auf ihrer Elutionszeit. Verwenden Sie die Registerkarte "Regionentabelle", um den Bereich der einzelnen Peaks zu lokalisieren und aufzuzeichnen.

Notieren Sie sich gleichzeitig die Start- und Endzeit jedes Peaks. Führen Sie als Nächstes eine Hintergrundsubtraktion für jeden Peak durch, indem Sie einen an den Peak angrenzenden Bereich hervorheben, der sich über denselben Zeitraum erstreckt. Subtrahieren Sie mit der Tabellenkalkulationssoftware die Anzahl der Zählungen für diese Region von der Anzahl des entsprechenden Peaks.

Normalisieren Sie die Fläche jedes Peaks gegen den elterlichen glyzerierten Inositol-Peak und erfassen Sie den Prozentsatz des elterlichen Phosphatidylinositols. Normalisieren Sie dann jeden der Peaks in jeder experimentellen Bedingung gegen die Kontrollbedingung und drücken Sie aus, wie die Endfalte im Vergleich zur Kontrolle zunimmt. Exportieren Sie die Dateien, indem Sie auf Datei und Speichern unter klicken und das CSV-Format auswählen.

Öffnen Sie abschließend die CSV-Datei in einem Tabellenkalkulationsprogramm, um die Daten zu plotten. Die Analyse der radioaktiv markierten Hefephosphoinositide wurde mittels HPLC durchgeführt. Da Hefezellen nur vier Phosphoinositide erzeugen, kann eine Auflösung mit einer einstündigen Doppelgradienten-Elutionsmethode erreicht werden.

Der glycerierte Inositol-Peak, der bei acht bis neun Minuten lag, überschattete das Signal aller anderen phosphorylierten Spezies. Daher ist es notwendig, den Teil der Spur zu vergrößern, der die anderen Peaks enthält, bevor die radioaktiven Signale integriert werden. Wildtyp-, ATG18-deletierte und VAC14-deletierte Hefestämme wurden mit dieser HPLC-Methode auf Veränderungen von Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphat untersucht.

Es wurde gezeigt, dass die ATG18-deletierte Mutante das meiste Phosphatidylinositol 3, 5-Bisphosphat produzierte und die VAC14-deletierte Mutante am wenigsten. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Wachstums- und Markierungsbedingungen basierend auf dem spezifischen Hefestamm oder den Zelltypen zu optimieren.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z. B. GFP-fusionierte Biosensoren, verwendet werden, um die HPLC-Flussszintillation zum Nachweis von Phosphoinositiden zu ergänzen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Phosphoinositide durch HPLC-gekoppelte Strömungszintillation radiomarkiert, extrahiert und misst. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Radioaktivität und organischen Lösungsmitteln äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung und eine angemessene Schulung getroffen werden sollten.