Eine Studie der Komplexierung von Quecksilber (II) mit Dicysteinyl Tetrapeptide durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Komplexe aus Quecksilber- und Dicysteinylpeptiden unter verschiedenen Reaktionsstöchiometrien herzustellen und die verschiedenen Komplexe, die durch Elektrospray-Ionisation und Oribitrap-Massenspektrometrie gebildet werden, zu charakterisieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bezüglich der Komplexierungstendenzen von Quecksilber- und Thiolverbindungen zu beantworten, was das rationale Design von Chelatbildnern zur Sequestrierung von Quecksilberionen verbessern wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Analyse von Metallionenkomplexen mit vernachlässigbarer Fragmentierung ermöglicht.

Andere beinhalten ein ausgeprägtes Verteilungsmuster der Quecksilberisotopen. Einfache Zuweisung der Ladung und Analyse von überlappenden Peaks durch Tandem-Massenspektrometrie. Obwohl diese Methode Einblicke in Quecksilberpeptidkomplexe bietet, kann sie auch auf andere Komplexe angewendet werden, insbesondere auf Metallionen, die in verschiedenen Isotopenformen vorliegen.

Entgasen Sie einen fünf Millimolar großen Ammoniumformiatpuffer 10 Minuten lang unter einem Vakuumsystem und spülen Sie ihn mit Argon. Wiederholen Sie dies zweimal und lagern Sie die Lösung unter Argon. Am Tag der Verwendung die Pufferlösung vor Gebrauch durch einen 0,2-Mikron-Filter filtrieren.

Zur Herstellung von Quecksilberchloridlösungen wiegen Sie 0,2375 Gramm Quecksilberchlorid ab. In 25 Millilitern fünf millimolaren Ammoniumformiatpuffer auflösen, um eine 0,035 molare Quecksilberchloridlösung herzustellen. Fügen Sie 0,214 Milliliter der Quecksilberchloridlösung zu 9,785 Millilitern Fünf-Millimolar-Ammoniumformiat-Puffer hinzu, um eine 0,75 Millimolare Lösung zu erhalten.

Bedecken Sie die resultierende Lösung mit Argongas. Als nächstes fügen Sie 225 Mikroliter einer fünf millimolaren CGGC-Stammlösung zu 1,275 Millilitern fünf millimolaren Ammoniumformiat-pH-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 hinzu, um eine 0,75 millimolare CGGC-Lösung zu erhalten. Bereiten Sie dann ein Verhältnis von 1 zu 0,5 Quecksilber zu CGGC-Lösung vor, indem Sie 255 Mikroliter fünf Millimolare Ammoniumformiat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben.

Geben Sie dann 30 Mikroliter 0,75 millimolare Quecksilberchloridlösung in das Röhrchen. Wirbeln Sie die Lösung 10 Sekunden lang ein. Geben Sie dann 15 Mikroliter 0,75 millimolare CGGC-Lösung in das Röhrchen.

Wirbeln Sie die Lösung weitere 10 Sekunden vor und lassen Sie sie dann 10 Minuten lang stehen, bevor sie in das Massenspektrometer injiziert wird. Zur Vorbereitung des ESI-Massenspektrometers (MS) ziehen Sie 100 Mikroliter Kalibrierstandards in eine 500-Mikroliter-Glasspritze. Legen Sie die Spritze in die Spritzenhalterung der MS-Pumpe.

Befestigen Sie den Schlauch und injizieren Sie ihn in das Massenspektrometer. Richten Sie den Dateinamen für die Ausführung ein, indem Sie das Dateisymbol auswählen und den Dateinamen eingeben. Wählen Sie die Schaltfläche Daten erfassen im Datenerfassungsmodul aus und sammeln Sie 150 Scans.

Analysieren Sie das Chromatogramm, um die Kalibrierstandards zu überprüfen, indem Sie das Datenverarbeitungsmodul der Software öffnen. Gehen Sie dann zum Dateimenü und wählen Sie Öffnen, gefolgt von der Datei im Dialogfeld. Stellen Sie sicher, dass die Peaks im Chromatogramm mit den Masse-Ladungs-Verhältnissen der Standards korrelieren.

Reinigen Sie die 500-Mikroliter-Glasspritze, indem Sie 500 Mikroliter Methanol in HPLC-Qualität aufziehen und dann in ein Becherglas geben. Ziehen Sie 500 Mikroliter Methanol in HPLC-Qualität in die Glasspritze auf und spülen Sie das System. Wählen Sie das Methoden-Setup-Modul der Software aus, um die Parameter einzustellen.

Wählen Sie das Menü für den Scan-Modus, identifizieren Sie das FTMS des Analysators und klicken Sie dann auf OK. Klicken Sie sich anschließend durch die verschiedenen Symbole auf der Seite mit dem Spektrum der Echtzeitansicht, um die Parameter so einzustellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Um den Puffer zu betreiben, geben Sie 500 Mikroliter Fünf-Millimola-Ammoniumformiat-Puffer in die 500-Mikroliter-Glasspritze.

Setzen Sie es in die Spritzenhalterung der MS-Pumpe ein und lösen Sie den Schlauch. Lassen Sie den Puffer ein bis zwei Minuten lang durch den Schlauch laufen. Richten Sie den Dateinamen für die Ausführung ein, indem Sie das Dateisymbol auswählen und den Dateinamen eingeben.

Wählen Sie die Schaltfläche "Daten erfassen" im Modul aus, und sammeln Sie 150 Scans. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführung stoppen, um die Erfassung zu stoppen, nachdem 150 Scans gesammelt wurden. Öffnen Sie anschließend das Datenbrowser-Modul, gehen Sie zum Menü Datei und wählen Sie Öffnen, gefolgt von der Datei im Dialogfeld.

Stellen Sie sicher, dass bei der Massenüberladung 483, 683, 1163 und 1363 keine Peaks vorhanden sind, die den Peptid- oder Quecksilberionen-Peptidkomplexen ähneln. Führen Sie die Lösung mit einem Verhältnis von 1 zu 0,5 Quecksilber zu CGGC durch, indem Sie 250 Mikroliter der Probe in die Spritze geben. Legen Sie die Spritze in die Spritzenhalterung der MS-Pumpe.

Bringen Sie den Schlauch an und grundieren Sie das Gerät. Wenn Sie 150 Datenscans erfasst haben, öffnen Sie das Browsermodul, gehen Sie zum Dateimenü und wählen Sie Öffnen. Wählen Sie dann die Datei im Dialogfeld aus.

Stellen Sie sicher, dass das Chromatogramm Peaks enthält, einschließlich des Peaks für das CGGC-Peptid allein. Ein kritischer Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, sicherzustellen, dass die Analyten aus dem vorherigen Lauf vor jeder Analyse des Reaktionsgemisches vollständig entfernt werden. Die Minimierung der Probenkontamination durch verschleppte Analyten wird durch eine gründliche Reinigung der Injektionsleitung gewährleistet.

Waschen Sie die Spritze, indem Sie 500 Mikroliter Ammoniumformiatpuffer aspirieren und dann den Puffer in ein Becherglas geben. Wählen Sie dann die Abfalltaste am MS und spülen Sie den Schlauch dreimal mit 500 Mikrolitern Ammoniumformiatpuffer. Waschen Sie die Spritze weiter, indem Sie 500 Mikroliter Methanol aspirieren und in ein Becherglas geben.

Spülen Sie den Schlauch einmal mit 500 Mikrolitern Methanol. Wählen Sie dann die Schaltfläche Lastdetektor auf dem MS aus. Nachdem Sie 500 Mikroliter Ammoniumformiatpuffer in die Spritze gegeben haben, setzen Sie die Spritze in die Spritzenhalterung der MS-Pumpe ein. Bringen Sie den Schlauch an und grundieren Sie das Gerät.

Wählen Sie einen Dateinamen für den Pufferlauf wie zuvor aus und erfassen Sie 150 Scans, bevor Sie auf die Schaltfläche Ausführung stoppen klicken. Öffnen Sie das Datenbrowser-Modul, um zu überprüfen, ob das Chromatogramm keine Peaks aus dem vorherigen Quecksilber- bis CGGC-Lauf enthält. Wiederholen Sie den Analysevorgang für die verbleibenden CGGC-Proben.

Zur Herstellung eines Verhältnisses von 1 zu 0,5 Quecksilber zur CEEC-Lösung geben Sie 255 Mikroliter fünf Millimolar Ammoniumformiat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 30 Mikroliter 0,75 millimolare Quecksilberchloridlösung in das Röhrchen. Nachdem Sie die Lösung 10 Sekunden lang vortexiert haben, geben Sie 15 Mikroliter einer 0,75 millimolaren CEEC-Lösung in das Röhrchen.

Wirbeln Sie die Lösung für weitere 10 Sekunden ein. Lassen Sie die Lösung 10 Minuten lang stehen, bevor Sie das Massenspektrometer injizieren. Wiederholen Sie das Analyseverfahren mit MOEL-Proben und Reaktionsgemischen aus Quecksilber-Ionen und MOEL.

Dargestellt ist ein repräsentatives Massenspektrum. Nach 10 Minuten sind die verschiedenen Arten von Quecksilberpeptidkomplexen für das Reaktionsgemisch von einem bis 0,5 Quecksilber zu CGGC sichtbar, zusammen mit einem Peptidpeak von 339,08 und einem Peptiddimer von 677,15. Wie im vorherigen Spektrum beobachtet, enthält das Eins-zu-Eins-Reaktionsgemisch von Quecksilber zu CGGC einige ähnliche Peaks.

Zum Beispiel gibt Peak 539.03 den Eins-zu-Eins-Komplex aus Quecksilber und Peptid an. Die vergrößerte Ansicht zeigt das charakteristische Quecksilber-Isotopenmuster, das den sieben wichtigsten natürlich vorkommenden Quecksilberisotopen entspricht. Ebenfalls beobachtet wurde ein bis zwei Quecksilber-zu-CGGC-Komplex, wie er zuvor für Quecksilberdicysteinyl-Tripeptid berichtet wurde.

Dieser Komplex kommt in allen drei Reaktionsgemischen von Quecksilber und CGGC vor. Es konnte leicht anhand eines eindeutigen Quecksilber-Isotopenmusters mit einem Monoisotopen-Peak bei 877 analysiert werden. Ist das Quecksilber jedoch im Überschuss, wie in dem Reaktionsgemisch von 1 bis 0,5 Quecksilber zu CGGC, wird ein zusätzlicher Quecksilber-zu-CGGC-Komplex von zwei bis zwei nachgewiesen.

Diese Quecksilber-Isotopensignatur entspricht einem Zwei-Quecksilber-Komplex, der mit Hilfe des chemischen Programms berechnet wurde. Die theoretische protonierte Monoisotopenmasse entspricht einem Massenüberladungswert von 1077, was der neunte Peak im beobachteten Isotopencluster ist. Dargestellt ist ein repräsentatives Spektrum, das verschiedene Quecksilber- bis CEEC-Komplexe zeigt.

Von Interesse sind die überlappenden Peaks, die mit Quecksilber-zu-CEEC-Addukten in der Plus-Eins-Ladung verbunden sind, die einen monoisotopischen Peak bei 883 zeigen. Und in der Plus-Zwei-Ladung mit einem berechneten monoisotopischen Spitzenwert von 1765. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Ihre Puffer zu entgasen und die Leitung gründlich zu spülen, um Verschleppungsanalyten zu vermeiden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Protonen-, Kohlenstoff-13- und Quecksilber-199-Kernspinresonanzspektroskopie oder Potentiometrie verwendet werden, um eine genauere Bestimmung der Inhaltskomplexe in der Lösungsphase zu ermöglichen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, verschiedene Quecksilberkomplexe und ihre unterschiedlichen Quecksilber-Isotopenverteilungsmuster und Ladungsformationen mittels Orbitrap-Massenspektrometrie mit Elektrospray-Ionisation zu analysieren sowie überlappende Peaks durch Tandem-MS-Analyse zu unterscheiden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Quecksilberlösungen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten.