Salinität abhängigen Toxizität Assay von Silbernanokolloide Verwendung von Medaka-Eier

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die salzgehaltsabhängige Toxizität von Chemikalien für Wasserorganismen zu testen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Ökotoxikologie zu beantworten, wie z. B. die Bewertung der Toxizität für Süßwasser-, Brackwasser- und Meerwasserbedingungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Medaka niemals gebeten werden, die Toxizität von Chemikalien in verschiedenen Salzgehalten zu testen.

Darüber hinaus erstrecken sich die Implikationen dieser Technik auf andere Therapien oder Diagnosen der Toxizität von Chemikalien. Die Herstellung von kommerziellen Silber-Nanokolloiden in Lösung mit verschiedenen Salzgehalten wird im Textprotokoll behandelt. Genauso wie die Medaka-Kultivierung und das Sammeln von Eiern.

Beginnen Sie mit dem Spülen von sechs Sammlungen von Medaka-Eiern der Stufe 21, dreimal in Testlösung. Tun Sie dies mit ERMs in einer anderen Konzentration für jeden Satz Eizellen. Übertragen Sie nun von jeder gespülten Sammlung 15 Eier in eine andere Vertiefung mit Testlösung in einer Kunststoffplatte mit sechs Vertiefungen.

Richten Sie dieses Experiment in dreifacher Ausfertigung ein und waschen Sie jede Gruppe separat. Wickeln Sie die Platten in Folie ein und brüten Sie sie bei 25 Grad Celsius im Dunkeln aus. Bis die Eier schlüpfen, oder 14 Tage lang, je nachdem, was früher eintritt.

Beobachten Sie die Eier während der Inkubation täglich auf biologische Veränderungen. Und für eventuelle tote Eier. Ändern Sie täglich die Testlösung und machen Sie die Beobachtungen.

Zählen Sie am sechsten Beobachtungstag die Herzfrequenz jedes Embryos über 15 Sekunden. Messen Sie auch am sechsten Tag den Durchmesser der Augen jedes Embryos unter jeder Versuchsbedingung mit einem Mikrometer. Wann immer die Embryonen zu Larven schlüpfen, messen Sie ihre gesamte Körperlänge mit einem Mikrometer.

Zählen Sie auch über die 14 Tage die Gesamtzahl der geschlüpften Eier. Um die Bioakkumulation von Silber zu messen, sammeln Sie am sechsten Tag die Chorionen der Eier mit der Standardmethode. Die dechorionierten Eier können genauso analysiert werden wie die SNC-Lösung, wie im folgenden Abschnitt beschrieben.

Um das lösliche Silber aus jeder SNC-Lösung zu isolieren, filtern Sie zunächst das Gemisch aus Kolloiden und löslichem Silber mit einer Drei-Kilodalton-Membran heraus. Drehen Sie dann den geladenen Filter 10 Minuten lang bei 14.000 G in einer gekühlten Zentrifuge herunter.

Messen Sie ab 50 Mikrolitern des Filtrats die Silberkonzentration mittels ICP-MS-Analyse. Laden Sie das Aliquot in ein 50-Millileter-Teflonbecherglas und geben Sie zwei Milliliter hochreine Salpetersäure in das Becherglas. Dann die Mischung auf einer heißen Platte bei 110 Grad Celsius erhitzen.

Lassen Sie die Lösung nach etwa drei Stunden Erhitzen fast austrocknen. Sobald das Becherglas abgekühlt ist, lösen Sie die organischen Feststoffe vollständig auf. Geben Sie zwei Milliliter hochreine Salpetersäure und 0,5 Milliliter Wasserstoffperoxid in das Becherglas.

Dann die Mischung erneut erhitzen, bis sie fast wieder ausgetrocknet ist. Lösen Sie nun den restlichen Rückstand in vier Millilitern eines Prozents hochreiner Salpetersäure, die in Reinstwasser hergestellt wird. Übertragen Sie die Lösung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Wiederholen Sie den Vorgang des Auflösens der restlichen Feststoffe im Teflonbecherglas zwei weitere Male und kühlen Sie die drei Auffangteile in einem einzigen Röhrchen ab. Messen Sie nun die Silberkonzentration in der Probe mit ICP-MS. Verwenden Sie das vom Hersteller empfohlene Protokoll, um die Proben zu analysieren.

Achten Sie darauf, interne und externe Standards zu verwenden. Der Einfluss des Salzgehalts auf die SNC-Toxizität war leicht zu erkennen. Die Induktion von Deformität oder Tod war eindeutig salzabhängig.

Es wurden verschiedene physiologische Messungen durchgeführt. Die Herzfrequenz wurde nicht beeinflusst, bis der Salzgehalt 30 X ERM erreichte. Die Körperlänge war bei einem Salzgehalt von 15 und 30 X ERM signifikant kürzer.

Der Augendurchmesser sank ebenfalls, was mit der Körperlänge übereinstimmte. Das Schlüpfen war bei 15 x ERM weniger wahrscheinlich und trat nur bei zwei Prozent der Eier bei 30 x ERM auf. Unter den experimentellen Lösungen bildeten sich mit zunehmender Salzkonzentration leichter wasserlösliche Metallkomplexe.

Die Untersuchung der Metallkomplexe in den Embryonen nach sechs Tagen zeigte, dass sie in den Embryonen mit zunehmender Konzentration in der Lösung zunahmen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den pH-Wert der Testbedingungen anzupassen, da die Freisetzung von Silberionen durch saure Bedingungen erleichtert wird.