Name: DNA Elektroporation, Isolierung und Imaging von Muskelfasern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Lernen Sie DNA-Elektroporation und Isolierung von Muskelfasern bei Mäusen für Proteinlokalisationsstudien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung reifer Muskelfasern ohne transgene Tiere.

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Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health NS047726, NS072027 und AR052646 unterstützt gewährt.

Die Methoden in dieser Studie wurden im ethischen Übereinstimmung mit der Northwestern University Feinberg School of Medicine Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt genehmigten Richtlinien. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um das Leiden zu minimieren. 1. Experimentelles Verfahren zur in vivo Elektroporation des M. flexor digitorum brevis (FDB) Muskelbündel in Maus- <ol><li> Design Plasmide zur Expression in vivo einen Promotor verwendet, bekannt, in Säugetierzellen zu exprimieren (zB Cytomegalovirus, CMV) oder im Muskel (zB Muskelkreatinkinase, MCK) 6,7. Größere Plasmide können auf den unteren Ebenen zum Ausdruck bringen. Der CMV-Promotor wurde umfassend 6,7 verwendet. </li><li> Reinige Plasmide aus E. coli mit Endotoxin-freien Bedingungen den Anweisungen des Herstellers. Löse das Plasmid in sterile, endotoxinfrei TE Puffer bei 2-5 &amp; mgr; g Plasmid / ul. </li><li> Verdünnen und aliquotieren das Plasmid zu einem concentration von 20 ug DNA in 10 ul sterilem endotoxinfreiem TE (2 ug / ul) Puffer pro Injektion in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie eine aliquote Menge pro Injektion. </li><li> Verdünnen Sie die Lager von Hyaluronidase, um mit sterilem Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium 1x (PBS - / -) was eine Endkonzentration von 8 Einheiten. Aliquot 10 ul verdünnt Hyaluronidase pro Injektion in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Betäuben die Maus mit 2,5% Isofluran, bis sediert und reagiert nicht mehr bis zum Schwanz oder Zehen Kneifen. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf einem Heizkissen oder Wärmetisch zur normalen Körpertemperatur zu halten. </li><li> Reinigen Sie die Fußballen der Maus mit einer alternierenden Anwendung einer Povidon-Iod-Peeling und Alkohol dreimal unter Verwendung eines Prep-Technik von der Nadel Website Ursprung und strahlende nach außen. Diese Technik hält die Nadel Website in einem aseptischen Zustand, Minimierung Erreger Einführung. </li><li> Spritzen Sie die Fußballen von the Maus mit 10 ul 1x-Hyaluronidase-Lösung (2 mg / ml = 8 Einheiten) zwischen der Haut und den Muskel unter Verwendung einer sterilen 1 ml-Spritze. Hyaluronidase verdaut Komponenten der extrazellulären Matrix zu effizienteren Eintrag der Plasmid in Muskelfasern ermöglichen. Geben Sie an der Basis der Ferse und vorab die Nadel in Richtung der Zehen. Langsam lassen Sie die Flüssigkeit, wenn die Nadel zurückgezogen wird. Die Injektionsstelle unter die Haut dehnt sich und beginnen, rosa drehen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.6 und 1.7 auf der kontralateralen Fuß. </li><li> Trennen Sie die Anästhesie und die Maus wieder in den Käfig. Lassen Sie die Maus, um in vollem Umfang von der Anästhesie erholen. </li><li> Warten Sie 2 Stunden. </li><li> Wiederholen Sie die betäubende und Fuß Sterilisationsverfahren, die Schritte 1.5 und 1.6. </li><li> Spritzen Sie die verdünnte Plasmid-DNA in den Fußballen auf die gleiche Weise wie die Hyaluronidase. Sicherzustellen, dass das maximale Volumen beträgt 20 &amp; mgr; l oder weniger. Für Dual-Plasmid-Expressions injizieren 20 ug jedes Plasmids mit einem maximalen Volumen von 20 &amp;# 181; l oder weniger. </li><li> Wiederholen Sie den Plasmid-Injektion auf der kontralateralen Fußballen oder verwenden Sie den kontralateralen Fuß für Steuereinspritzungen. </li><li> Auf dem Fuß, die zunächst eingespritzt wurde, heben Sie die Haut von der Unterstreichung Muskel mit feinen Pinzette und legen Sie eine 27 G-Nadel durch die Kugeln der Haut in der Nähe der Zehen in einer Position senkrecht zu der heilen Zehenlinie des Fußes. Nehmen Sie einen zweiten sterilen 27 G-Nadel und legen Sie sie horizontal durch die Haut an der Ferse. Ort Nadeln parallel zueinander ~ 1 cm auseinander. </li><li> Verwenden Krokodilklemmen, Klemmelektroden zu den parallelen Nadeln dafür, dass die Nadeln nicht miteinander in Berührung kommen. Die Verwendung von Modelliermasse können die Klammern zu befestigen. </li><li> Verbinden Elektroden zu einem elektrischen Stimulator. </li><li> Elektroporieren den Muskel durch Anwenden 20 Impulse, 20 msec Dauer / jedes bei 1 Hz, bei 100 V / cm. Die Zehen können mit Stimulation zucken. </li><li> Wiederholen Sie die Stimulationsverfahren auf der kontralateralen Fuß, falls erforderlich. </li><li>Nadeln zu entfernen. Wischen Sie den Fußballen Povidoniod Gestrüpp. </li><li> Schalten Sie die Anästhesie. Bringen Sie die Maus, um die Erholung Käfig und Überwachungstätigkeit. Wenn das Verfahren wurde durchgeführt, wie erwartet, sollte das Tier normale Gehfähigkeit innerhalb von 30 Minuten wieder zu erlangen und zeigen keinen Unterschied in der Gehfähigkeit oder Aktivitätsniveau von vor der Einspritzverhalten. Daher werden keine post-Verfahren Analgetika nötig. Bei der Wiederherstellung, bringen Sie das Tier zum Tiergehege. Achtung: Die Proteinexpression kann so früh wie 48 Stunden nach der Elektroporation untersucht werden. Allerdings, mehr vollständige Wiederherstellung nach der Elektroporation zu ermöglichen, ziehen wir die Isolierung und Untersuchung von Muskelfasern 7 - 14 Tage nach der Elektroporation 10. Expression untersucht werden, solange 4 Wochen nach der Elektroporation werden. </li></ol> 2. Experimentelles Verfahren zur Isolierung des M. flexor digitorum brevis (FDB) Fibers <ol><li> Thaw Kollagenase. Für jede FDB Bündel bereiten zwei Vertiefungen in einer 12-Well-Gewebekulturplatte. In einer gut hinzufügen, 1 ml vorgewärmtes Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium sowie Rinderserumalbumin (DMEM + BSA) und in der anderen auch 1 ml vorgewärmten Ringers Lösung. Darüber hinaus fügen Sie frisches 10 ml 1x Ringers Lösung für die 35 mm Sylgard Gericht. </li><li> Opfern das Tier durch CO 2 oder Narkosegas Inhalation, gefolgt durch Genickbruch oder eine andere Methode, um den Tod zu gewährleisten. </li><li> Entfernen Sie die Hinterfüße oberhalb des Sprunggelenks mit einem sauberen Rasierklinge und tauchen in 1x Ringer-Lösung in den 35 mm Sylgard Gericht. </li><li> Pin einen Fuß eng, Sohle nach oben, auf die Sylgard Gericht mit 30 G Nadeln durch jede der 5 Zehenspitzen und am Knöchel. </li><li> Beginnend am Knöchel, schnippeln die Haut gerade an der Seite des Fußes entlang der Haaransatz in Richtung der Zehen, darauf achten, nicht nick die Muskeln unter der Haut. Wiederholen Sie auf der anderen Seite des Fußes. </li><li> Halten Sie die Haut an der Unterseite des oberen Sprunggelenks mit feinen Pinzette, schneiden Sie die Haut über der Ferse. </li><li> Anheben der HautKlappe mit einer Pinzette, zeigen Sie mit einer Schere in Richtung auf die Haut, um nicht nick der Muskel. Snip die zugrunde liegende Bindegewebe, die Haut effektiv zu entfernen. </li><li> So entfernen Sie die FDB Muskelbündel schneiden die großen Sehne an der Ferse, um die Sehne vom Knochen zu befreien. Halten Sie die Sehne mit einer Pinzette, sezieren die FDB Bündel von der großen weißen Sehne sorgfältig Entfernen von Bindegewebe mit einer Schere auf die FDB angebracht. Wenn man es richtig macht das Bündel leicht abheben der zugrunde liegenden Sehnen enthüllt hellen weißen Sehnen, die zu den einzelnen Ziffern. Schneiden Sie die FDB an den Sehnen in der Nähe von den Zehen zu befreien das Bündel aus dem Fuß. </li><li> Legen Sie die gesamte Muskelbündel in der auch das DMEM + BSA. </li><li> Wiederholen Sie auf der kontralateralen Fuß. </li><li> Sobald alle FDB Muskeln isoliert, fügen Sie 100 ul von Kollagenase in jede Vertiefung DMEM + BSA und Muskeln. </li><li> Überprüfen Sie den Erfolg der Elektroporation auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop vor dem Aufschluss. Wenn getan properly, nach oben von 90% Transfektionseffizienz erzielt werden. </li><li> Inkubieren der Platte in einer befeuchteten, 37 ° C-Inkubator bei 10% CO 2 für ca. 1 Std. Die Inkubationszeit kann je nach Krankheitsmodell und Hintergrund und die Menge von Kollagenase variieren. </li><li> Nach 1 Stunde sorgfältig überweisen Sie den FDB-Bundle zum Brunnen, die nur Ringerlösung. </li><li> Man reibt die FDB Bündels in der gut mit der Ringer-Lösung unter Verwendung einer 1 ml Pipette. Schneiden Sie das Ende der Pipettenspitze mit einem sauberen Rasierklinge, so dass das Bündel kann leicht durch die Pipettenspitze passieren. Verreiben Sie vorsichtig die Muskeln (~ 15-mal) so dass die Bündel, um sich parallel zu der Spitze vorbei und. Intakten Fasern werden in die Ringer-Lösung fallen ab. Wenn Fasern nicht leicht fallen aus dem Bündel, legen Sie die Muskeln wieder in Kollagenase-Lösung. </li><li> Teller der isolierten Fasern auf dem Teller ~ 500 ul pro Platte. </li><li> Erlauben der Muskel in der Vertiefung für 15 Minuten zu verdauen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.152,17 bis das Bündel in der Größe abnimmt und die Mehrheit der Fasern aus dem Bündel (üblicherweise insgesamt 2-3 mal) dissoziiert. Sobald dissoziiert der Muskel leicht durch eine 1 ml Pipettenspitze gelangt. </li><li> Lassen Fasern zu befestigen, um die Schale für mindestens 15 min. Frisch Ringers-Lösung kann in Abhängigkeit von Zeitbeschränkungen an der Platte aufgenommen werden, um restliche Kollagenase verdünnen oder verändert. Hinweis: Die Fasern sind nun bereit für die Bildgebung. </li></ol> 3. Versuchsdurchführung zur Visualisierung von Laserinduzierte Membranschädigung mit konfokale Mikroskopie <ol><li> Lastfasern unmittelbar vor dem Gebrauch mit 300 ul von 2,5 uM FM 1-43 FM 4-64 Farbstoff in Ringers Lösung Bildgebung. Generell Bildfasern 15 min bis 2 h nach der Isolierung. Allerdings können Fasern bis zu 24 Stunden nach der Isolierung abgebildet werden. </li><li> Setzen Sie den Glasboden Teller auf einem konfokalen Mikroskop mit einem UV-Laser und einem 60X / 63X Ziel ausgestattet. </li><li> Suchen Sie eine Faser. Stellen Sie sicher, die Faser fest verbundenin die Schale durch Antippen der Mikroskopbasis. Fasern, die bei der Spaltung beschädigt wurden auszuschließen. Beschädigte Fasern können Membran Blasen, Aufnahme hoher FM Farbstoff, Locke enthalten oder biegen intensiv. </li><li> Um Membranschäden auf der Faser zu induzieren, positionieren Sie den Sarkolemma im Zentrum des Abbildungsfenster mit einem Feld weg von Kernen. Konzentrieren Sie sich auf die Sarkolemma mit der FM-Farbstoff-Kanal, so dass das Sarkolemm ist extrem scharf. </li><li> Setzen Sie den ROI Fadenkreuz auf dem Sarkolemma Verwendung des FM 4-64 Kanal. </li><li> Bestrahlen einer 1 Pixel Punkt bei 80% Leistung für 3 Sekunden (~ 350 nm x 350 nm-Bereich). FM Farbstoff wird die Zelle an der Stelle der Verletzung geben. Leistung und Zeit eingestellt werden kann zur Erhöhung oder Verringerung der Fläche Insult. </li><li> Machen Sie Bilder von der Faser vor Beschädigungen, zum Zeitpunkt der Beschädigung, alle 2 Sek post-Schäden, danach alle 10 Sekunden bis zu 5 min. Timing kann je nach Bedarf eingestellt werden. Einzelne Bilder können zum Zeitraffer-Filme in Bild J. umgewandelt werden </li><li> Wiederholen Sie die Schritte3,3 bis 3,7 auf bis zu 3 Fasern pro Gericht. </li></ol>

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<li>Marg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcolemmal+repair+is+a+slow+process+and+includes+EHD2%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2.</a> Traffic. 13, 1286-1294 (2012).</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>Defour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin+regulates+cell+membrane+repair+by+facilitating+injury-triggered+acid+sphingomyelinase+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion.</a> Cell Death Dis. 5, e1306(2014).</li>
</ol>

Es gibt keine Interessenkonflikte.

Die Verwendung der Elektroporation zur fluoreszenzmarkierten Proteine ​​in vivo zu untersuchen ist besonders für die Untersuchung von Muskeln aufgrund der Abwesenheit von geeigneten Zellinie Modelle, die die gesamte Zellstruktur des Muskels originalgetreu geeignet. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Elektroporation und hochauflösende konfokale Mikroskopie, detaillierte Darstellung von Protein-Lokalisierung und Translokation nach der Laser Verwundung bereitzustellen. Diese Methode lässt sich...

Einzelne Muskelfasern sind groß, hoch organisierte Syncytial-Zellen. Es gibt einige Zellkulturmodelle für Muskel; jedoch haben diese Modelle als ihre wichtigste Einschränkung, dass sie nicht vollständig zu reifen Muskelfasern unterscheiden. Beispielsweise werden die C2C12 und L6-Zelllinien von Mäusen und Ratten, jeweils 1-4 abgeleitet sind. Unter den Bedingungen der Serumentzug, die einkernigen &quot;Myoblasten-like&quot; Zellen aufhören Proliferation, Zellzyklus Entzug zu unterziehen, und geben Sie in die myogenen Programm bildet kernige Zellen mit Sarkomere, die so genannte Myotuben. Bei längerer Kulturbedingungen kann Myotuben Kontraktionseigenschaften aufweisen und &quot;zucken&quot; in der Kultur. Menschlichen Zelllinien wurden auch jetzt 5 etabliert. Neben diesen immortalisierten Zellinien können einkernige Myoblasten aus Muskel- und unter den gleichen Bedingungen von Serumentzug wird Myotuben Form isoliert werden. Diese Zelllinien und Primär Myoblastenkulturen sind hoch verwendenvoll, da sie die mit Plasmiden transfiziert oder transduziert mit Viren und zur Basiszelle biologische Prozesse zu untersuchen. Allerdings sind diese Zellen, selbst wenn veranlasst, Myotuben zu bilden, fehlt vielen der wichtigsten Merkmale von reifen Muskel Organisation. Insbesondere sind Myotuben viel kleiner als einzelnen reifen Muskelfasern und nicht über die normale Form der Muskelfasern. Kritisch Myotuben fehlt Quer (T-) Tubuli, die membranartige Netzwerk für effiziente Ca 2+ Freisetzung der gesamten myoplasm erforderlich. Eine alternative Methode zur primären Myoblasten oder myogenen Zelllinien bringt mit reifen Muskelfasern. Transgenese verwendet werden, um die Expression von markierten Proteinen herzustellen, jedoch ist dieses Verfahren kostenintensiv und zeitraubend ist. In vivo Elektroporation von Maus-Muskel wurde als ein bevorzugtes Verfahren zu seiner Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit 6-10 entstanden. Verfahren zur in vivo Elektroporation und effiziente Isolierung von Muskelfasern have für die Maus flexor digitorum brevis (FDB) Muskel 6 optimiert. Die Verfahren können leicht durchgeführt werden und sind minimal-invasive in vivo-Expression von Plasmiden zu induzieren. Dieser Ansatz wird jetzt mit hochauflösenden bildgebenden Verfahren einschließlich Bildgebung nach der Laser Störung des Sarkolemma 6,7 kombiniert. Die Kombination von Fluoreszenzfarbstoffen und die Expression von Fluoreszenz-markierten Proteine ​​können verwendet werden, um zellbiologische Prozesse in reifen Muskelfasern zu überwachen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td>Dissektionsmedien Verdünnung: 50 ml +100 g BSA-Kollagenase</td></tr><tr><td>, Typ II</td><td>Life Technologies</td><td>17101-015</td><td>Faseraufschluss Verdünnung: 160 mg / 4 ml DMEM (Bestand 40 mg/ml aliquot)</td></tr><tr><td>Falcon 12-Well-Schalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>877229</td><td>Faseraufschlussringer</td></tr><tr><td>Lösung</td><td></td><td></td><td>Faseraufschluss und Bildgebung Verdünnung: 146 mM NaCl 5 mM&nbsp; &nbsp; KCl 2 mM&nbsp; &nbsp; CaCl2 1 mM&nbsp; &nbsp; MCl2 10 mM HEPES pH7,4 in H2O</td></tr><tr><td>1 ml Pipetten</td><td>Axygen</td><td>T-1000-C-R</td><td>Aufschluss</td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>Personna</td><td>94-120-71</td><td>Aufschluss</td></tr><tr><td>Precision Glide 30 g Nadel</td><td>BD Biosciences</td><td>305128</td><td>Dissektion</td></tr><tr><td>1x PBS (-/-)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>Dissektion</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-366-794</td><td>Sezierzange</td></tr><tr><td></td><td>FST by Dumont</td><td>#5/45</td><td>Präparierzange</td></tr><tr><td></td><td>Roboz</td><td>RS-4913</td><td>Präparierzange</td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>500260</td><td>Dissektion</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Dissektion media Verdünnung: 100 mg/50 ml DMEM</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm</td><td>Schalen Fisher Scientific</td><td>08772B</td><td>Dissektion - wird verwendet, um den Sylgard</td></tr><tr><td>Clay</td><td></td><td></td><td>Elektroporation</td></tr><tr><td>Stimulator zu halten&nbsp;</td><td>Grass</td><td>s88x</td><td>Elektroporation</td></tr><tr><td>Klemmen</td><td>Radio Shack</td><td>270-356</td><td>Elektroporation</td></tr><tr><td>Triadine</td><td>Aplicare</td><td>82-220</td><td>Elektroporation</td></tr><tr><td>Precision Glide 27 G Nadel</td><td>BD Biosciences</td><td>305136</td><td>Elektroporation</td></tr><tr><td>Simulator</td><td>Grass</td><td>SIU-V</td><td>Elektroporation</td></tr><tr><td></td><td>Gaze Covidien</td><td>2146</td><td>Elektroporation</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>Injektion Verdünnung: Fügen Sie 160 ul PBS (1x) zu 40 & Mikro hinzu; l 5x Schaft</td></tr><tr><td>1 cc U-100 Insulinspritze (28G1/2) &nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>329420</td><td>Injektion</td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td>Injektion</td></tr><tr><td>35 mm Glasboden Mikrotiterschüssel</td><td>MaTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Mikroskopie</td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Life Technologies</td><td>T-13320</td><td>Mikroskopie Verdünnung: Endgültig 2,5 μg/ml</td></tr><tr><td>FM 1-43</td><td>Life Technologies</td><td>T-35356</td><td>Mikroskopie Verdünnung: Endgültige 2,5 μg/ml</td></tr><tr><td>endotoxinfreies Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Plasmid-Aufreinigung</td></tr></tbody></table>

dna elektroporation, isolierung und imaging von muskelfasern

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Reifer Muskel hat eine einzigartige Struktur, die für die Bildgebung lebender Zellen zugänglich ist. Darin beschreiben wir das experimentelle Protokoll zur Expression fluoreszenzmarkierter Proteine im Musculus flexor digitorum brevis (FDB). Die Bedingungen wurden optimiert, um eine große Anzahl hochwertiger Myofasern bereitzustellen, die das elektroporierte Plasmid exprimieren und gleichzeitig Muskelschäden minimieren. Bei der Methode werden fluoreszierende Tags auf verschiedenen Proteinen verwendet. Die Kombination dieser Expressionsmethode mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie ermöglicht die Bildgebung lebender Zellen, einschließlich der Bildgebung nach laserinduzierten Schädigungen. Fluoreszenzfarbstoffe in Kombination mit der Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Proteinen geben Aufschluss über die Grundstruktur des Muskels und seine Reaktion auf Reize.

Elektroporation ist eine minimal invasive Technik, die effizient stellt gereinigte Plasmid-DNA in der flexor digitorum brevis (FDB) Muskelbündel (Figur 1A). Sieben Tage nach der Transfektion fluoreszenzmarkierten Proteins in isolierter Muskelfasern (1B) visualisiert. Isolated Fasern werden dann ausgestrichen und für die Bildgebung vorbereitet auf einem konfokalen Mikroskop. Fasern können laserinduzierte Schädigung unterzogen werden. FM Farbstoff kann ver...

Dieses Protokoll verwendet Elektroporation, um fluoreszenzmarkierte Proteine in Muskelfasern von Mäusen einzuführen und zu exprimieren. Nach der Wiederherstellung nach der Elektroporation werden die Fasern isoliert. Einzelne Fasern werden dann mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie abgebildet, um die Muskelstruktur sichtbar zu machen.

DNA Elektroporation, Isolierung und Imaging von Muskelfasern

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Myofasern aus dem Musculus flexor digitorum brevis von Mäusen zu isolieren, sodass das Sarkolemma anschließend durch Laserverletzung geschädigt werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Proteinfunktion und -lokalisation in ausgereiften Myofasern untersucht werden kann, ohne transgene Mäuse erzeugen zu müssen. Diese Methode kann angepasst werden, um pharmazeutische Wirkstoffe und andere Methoden der Zellverletzung zu testen.Beginnen Sie mit dem Auftauen der Kollagenase-Lösung. Bereiten Sie anschließend zwei Vertiefungen einer 12-Loch-Platte vor. Geben Sie für jede zu isolierende Faser in einer Vertiefung ein Milliliter vorgewärmtes DMEM plus BSA und füllen Sie die andere Vertiefung mit einem Milliliter vorgewärmter 1×-Ringer-Lösung.Bereiten Sie außerdem eine 35-Millimeter-Zigarrenschale mit 10 Milliliter frischem 1x Ringerlösung vor. Nachdem Sie die Füße des transfizierten Tieres entfernt haben, befestigen Sie einen Fuß straff mit der Sohle nach oben in der Zigarrenschale mithilfe von 30-Gauge-Nadeln durch die Spitzen jedes der fünf Zehen sowie am Knöchel. Bereiten Sie jeden Fuß wie folgt vor.Zuerst die

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben detaillierte Verfahren für die effiziente Transfektion von Plasmid-DNA in die Fasern der Fußmuskulatur von lebenden Mäusen mittels Elektroporation und der nachfolgenden Darstellung der Proteinexpression mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie.

DNA Transfektion von Säuger Skelettmuskulatur mit In Vivo Elektroporation

Dieses Video zeigt die Isolierung einzelner Myofasern aus entnommenem Maus-Musculus Extensor Digitorum Longus (EDL). Die isolierten Myofasern können kultiviert werden, um die Aktivität von Myofaser-assoziierten Muskelstammzellen zu untersuchen.

Myofaserisolierung: Eine Technik zur Gewinnung einzelner Myofasern aus entnommenen Mausmuskeln Extensor Digitorum longus (EDL)

Isolierung und Kultivierung von Muskelfasern ist der...

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Zebrafische sind ein Schwellensystem zur Modellierung menschlichen Erkrankungen der Skelettmuskulatur. Wir beschreiben eine schnelle und effiziente Methode, um Skelettmuskel Muskelfasern aus embryonalen Zebrafisch-Larven und zu isolieren. Dieses Verfahren ergibt eine hohe Dichte myofiber Vorbereitung für Untersuchung von einzelnen Skelettmuskelfasermorphologie, Protein subzelluläre Lokalisierung und Muskelphysiologie.

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

Wir beschreiben eine neuartige experimentelle Technik, die nennen wir Minimal Invasive Muskel einbetten (MIME), basiert auf dem Beweis Skelettmuskelgewebe lebensfähige myogen Zellen enthält, die Spender-Zell-vermittelten Myogenesis bei implantiert erleichtern können Ein Host-Muskel.

Minimal-Invasive Muskel einbetten (MIME) - eine neuartige experimentelle Technik, Spender-Zell-vermittelten Myogenesis zu erleichtern

Skelettartiger Muskel Differenzierung ist ein sehr dynamischer Prozess, der besonders auf nukleare Positionierung stützt. Hier beschreiben wir eine Methode um Kerne Bewegungen von live Cell Imaging während Myoblast Differenzierung und Myotube Bildung verfolgen und eine quantitative Charakterisierung der Kerne Dynamik durch Extrahieren von Informationen aus automatisches Tracking durchzuführen.

Nutzung von Live Imaging Track Kerne während Myoblast Differenzierung und Fusion

Hier wird ein Protokoll zur Bewertung der kontraktilen Eigenschaften von gestreiften Muskelmyofibrils mit Nano-Newton-Auflösung vorgestellt. Das Protokoll verwendet ein Setup mit einer Interferometrie-basierten optischen Kraftsonde. Dieses Setup erzeugt Daten mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis und ermöglicht die Beurteilung der kontraktilen Kinetik von Myofibrils.

Isolieren von Myofibrils von Skelettmuskelbiopsien und Bestimmung der Kontraktilenfunktion mit einem Nano-Newton Resolution Force Transducer

Hier schlagen wir eine Methode vor, um einzelne Muskelfasern in frühen postnatalen Entwicklungsstadien aus dem homozygoten Mutanten Lamin-Mausmodell, einem sehr schweren Modell für Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD), effizient zu erhalten.

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

In diesem Protokoll wird eine In-vitro-Kultivierungs- und Funktionsanalysemethode für Muskelstammzellen beschrieben, die die meisten ihrer Wechselwirkungen mit ihrer endogenen Nische bewahrt.

Single Myofiber Culture Assay zur Beurteilung der Funktionalität adulter Muskelstammzellen ex vivo

Wir beschreiben ein Protokoll zur Gewinnung enzymatisch dissoziierter Fasern unterschiedlicher Länge und Art aus sechs Muskeln erwachsener Mäuse: drei davon bereits beschrieben (Flexor digitorum brevis, Extensor digitorum longus, soleus) und drei von ihnen erstmals erfolgreich dissoziiert (Extensor hallucis longus, Peroneus longus, Peroneus digiti quarti).

Intakte kurze, mittlere und lange Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen gewonnen wurden: Jenseits des Flexor Digitorum brevis

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung intakter einzelner Muskelfasern aus dem oxidativen Soleus und die Einrichtung hochgereinigter Myoblastkulturen, die aus diesen Fasern gewonnen wurden. Das optimierte Verfahren liefert zuverlässig etwa 300–500 intakte Myofasern pro Maus, was nachgelagerte molekulare und zelluläre Analysen ermöglicht.

Einzelfaser-Isolationstest zur Beurteilung des oxidativen Myofaserverhaltens

Lernen Sie DNA-Elektroporation und Isolierung von Muskelfasern bei Mäusen für Proteinlokalisationsstudien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung reifer Muskelfasern ohne transgene Tiere.

DNA Elektroporation, Isolierung und Imaging von Muskelfasern

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