Herstellung und Prüfung von impedanzbasierten Fluidic Biochips mit RTgill-W1 Zellen für die schnelle Auswertung von Trinkwasserproben für Toxizität

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu demonstrieren, wie ein Biosensor zur Bewertung der Toxizität von Trinkwasserproben eingesetzt werden kann. Dies wird erreicht, indem Biochips hergestellt werden, die eine Monoschicht von Regenbogenforellen-Kiemenzellen enthalten, und diese dann als Teil eines impedenzbasierten Biosensors verwendet werden. Dieses Verfahren bietet eine Möglichkeit, chemische Toxizität in der Trinkwasserversorgung in Konzentrationen, die für die menschliche Gesundheit relevant sind, schnell nachzuweisen.

Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass die Biochips unter Feldbedingungen verwendet werden können, dass sie bis zu neun Monate lang kalt gelagert werden können, ohne dass die Zellen gepflegt oder gewartet werden müssen, und dass sie in einem testbereiten Zustand sind und nach der Entnahme aus der Kühlung jederzeit verwendet werden können. Dieses Verfahren wird von Jordan McNairn, einem Studenten aus unserem Labor, demonstriert. Nehmen Sie die Biochips am Tag vor der Zellaussaat aus der Verpackung und legen Sie sie in sterilisierte Instrumentenkoffer aus Kunststoff.

Befestigen Sie eine der Schlauchleitungen an der Spritze und ziehen Sie eine 20%ige Bleichlösung in eine 20-Milliliter-Spritze auf. Injizieren Sie zwei Milliliter der Lösung in jeden Kanal des Biochips. Wenn Sie fertig sind, lassen Sie die Biochips eine Stunde lang mit der Bleichlösung einwirken.

Nach einer Stunde verwenden Sie eine sterile Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer männlichen Gleitluer-Einheit ausgestattet ist, die an einer Vakuumleitung befestigt ist, um die Bleichlösung aus beiden Kanälen abzusaugen. Nachdem Sie das Bleichmittel aus dem Biochip abgesaugt haben, befestigen Sie eine sterile Schlauchbaugruppe mit männlichen Gleitgummis an jedem Ende des Biochips, um sie beim Spülen der Biochips als Abfluss zu verwenden. Ziehen Sie dann steriles Wasser in eine 20-Milliliter-Spritze und spülen Sie jeden Kanal des Chips mit fünf Millilitern Wasser.

Vakuumieren Sie das Wasser wie zuvor. Und legen Sie die Biochips wieder in die Instrumentenkoffer aus Kunststoff. Lassen Sie die Biochips bis zum nächsten Tag in der Biosicherheitshaube.

Eine Stunde vor der Aussaat der Biochips injizieren Sie zwei Milliliter einer Fibronektinlösung von 10 Mikrogramm pro Milliliter in jeden Kanal des Biochips. Inkubieren Sie die Biochips 60 Minuten lang in der Biosicherheitshaube und saugen Sie dann die Fibronektinlösung im Vakuum an. Platzieren Sie abschließend zwei sterile Biochip-Schlauchbaugruppen auf den Anschlüssen der Biochips und legen Sie die Biochips beiseite, bis die Zellen für die Aussaat bereit sind.

Nehmen Sie einen konfluenten T-175-Kolben mit Regenbogenforellen-Kiemenepithelzellen aus dem Inkubator und setzen Sie ihn in die Biosicherheitshaube ein. Ein konfluenter T-175-Kolben wird in der Lage sein, etwa 16 Biochips zu säen. Saugen Sie das Medium aus den Zellen ab.

Spülen Sie sie mit PBS ab und saugen Sie PBS ab. Und dann fügen Sie der Zellschicht sechs Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung hinzu. Der Kolben wird etwa fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.

Geben Sie dann 15 Milliliter vollständiges L-15-Zellkulturmedium in jeden Kolben, um das Trypsin zu deaktivieren. Entnehmen Sie ein kleines Aliquot aus der Zellsuspension und verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Konzentration der Zellen zu messen. Betrachten Sie die Zellen mit einem Hellfeldmikroskop, das mit einem 10-fach-Objektiv ausgestattet ist.

Berechnen Sie dann die aktuelle Zellkonzentration und stellen Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von einer Viertelmillion Zellen pro Milliliter ein. Verwenden Sie anschließend eine sterile 20-Milliliter-Spritze, um 2,5 Milliliter der Zellsuspension in den äußeren Anschluss jedes Kanals des Biochips zu injizieren. Lassen Sie die zusätzliche Zellensuspension aus dem Schlauch in einen Abfallbehälter fließen.

Erstellen Sie dann eine geschlossene Schleife für jeden Biochip-Kanal, indem Sie das freie Ende des Schlauchs mit einer Luer-Armatur in den äußeren Anschluss für jeden Kanal einführen. Befeuchten Sie anschließend ein Papiertuch mit 70 % Ethanol und wischen Sie damit überschüssige Medien von den geschlossenen Kreisläufen ab. Legen Sie dann die Biochips wieder in eine Plastikbox.

Nehmen Sie an den Tagen vier und sieben die Biochips aus dem Inkubator. Und wechseln Sie die Medien in den Biochips mit temperaturausgeglichenen vollständigen L-15-Zellkulturmedien. Entfernen und entsorgen Sie nach der Fütterung am siebten Tag die Schläuche von den Chips und setzen Sie die Ablassstopfen des Autoklaven in die Biochips ein.

Legen Sie die Biochips in eine Box in einem sechs Grad Celsius heißen Inkubator, bis sie zum Testen verwendet werden. Nehmen Sie das ECIS-Testlesegerät und die Verbrauchsmaterialien aus der Tragetasche und schalten Sie das Lesegerät ein. Nehmen Sie außerdem einen der vorbereiteten Biochips aus dem Sechs-Grad-Inkubator und legen Sie ihn auf ein Papiertuch.

Geben Sie mit einer 10-Milliliter-Spritze 10 Milliliter Kontrollwasser in ein beschriftetes 0,5-Unzen-Kontrollglas aus durchsichtigem Kunststoff. Achten Sie darauf, Blasen für eine genaue Messung zu entfernen. Verwenden Sie dann eine separate Spritze und geben Sie 10 Milliliter der Testprobe in ein durchsichtiges 0,5-Unzen-Plastiktestgefäß

Entfernen Sie anschließend zwei Durchläschchen mit Pulvermedium. Öffnen Sie eine der Durchstechflaschen mit Pulvermedium und gießen Sie den gesamten Inhalt einer Durchstechflasche in das Gefäß mit dem Kontrollwasser, wobei Sie die gesamte Durchstechflasche ebenfalls in die Lösung fallen lassen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem Testglas.

Verschließen und schütteln Sie dann die Gläser, um sicherzustellen, dass sich das Pulver vollständig aufgelöst hat. Füllen Sie die blaue 10-Milliliter-Spritze mit neun Millilitern der Kontrolllösung. Und die rote 10-Milliliter-Spritze mit neun Millilitern der Testlösung aus den jeweiligen Fläschchen.

Entfernen Sie alle vorhandenen Luftblasen von den Spritzen. Entfernen Sie anschließend die Stecker von den Biochip-Anschlüssen und bringen Sie den Abfluss an. Legen Sie den Biochip in das herausnehmbare Kunststofffach des ECIS-Lesegeräts, schließen Sie den Deckel und befestigen Sie dann die gefüllten Spritzen an den äußeren Biochip-Anschlüssen.

Bringen Sie abschließend die Spritzenkolben an. Wählen Sie auf dem Hauptbildschirm des Readers Weiter aus, um den Vortest zu starten. Die Software prüft dann die anfänglichen Impedanzen.

Wenn sich die Impedanzen innerhalb des Bereichs befinden, registriert der Bildschirm "Kassette bestanden" und weist den Benutzer an, "Weiter" auszuwählen. Geben Sie dann Beispielinformationen mit einer Bildschirmtastatur ein, und wählen Sie dann Akzeptieren aus, wenn Sie fertig sind. Zu diesem Zeitpunkt werden zwei Minuten Impedanzdaten vom eingesetzten Biochip erfasst, und ein Timer auf dem Bildschirm zählt die Zeit herunter.

Klicken Sie nach zwei Minuten auf Weiter. Wenn Sie durch ein blinkendes grünes Kästchen aufgefordert werden, "Proben jetzt injizieren", injizieren Sie das Kontroll- und Testmedium aus den beigefügten Spritzen gleichzeitig in die Biochip-Kanäle. Lassen Sie die Spritzen auf den Biochips, wenn Sie fertig sind.

Wenn die ECIS-Reader-Software zu irgendeinem Zeitpunkt während des Tests feststellt, dass sich der Behandlungskanal statistisch vom Kontrollkanal unterscheidet, zeigt die Bildschirmanzeige an, dass die Probe kontaminiert ist. Andernfalls wird angezeigt, dass am Ende des Überwachungszeitraums keine Kontamination festgestellt wurde. Notieren Sie die Testergebnisse für jede Probe als kontaminiert oder nicht kontaminiert.

Entfernen und entsorgen Sie am Ende des Testlaufs den Biochip. Spülen und trocknen Sie die Spritzen, die Testfläschchen und die herausnehmbare Kunststoffschale, in der sich der Biochip während der Tests befand. 13 Chemikalien, die hier gezeigt werden, wurden für die Prüfung ausgewählt, da sie repräsentativ für ein breites Spektrum an toxischen Industrieverbindungen stehen, die mögliche Verunreinigungen des Trinkwassers sein könnten.

Während des Tests wurden neun der 13 innerhalb einer Stunde bei Konzentrationen, die für die menschliche Gesundheit relevant sind, durch die Impedanzmessung des Substrats der elektrischen Zellen nachgewiesen. Hier sind typische Ergebnisse dargestellt, die nach einem Impedanzmesstest für das Substrat einer elektrischen Zelle zu sehen wären. Kontaminierte Proben weisen im Vergleich zu den Kontrollproben für sauberes Wasser deutlich niedrigere Impedanzwerte auf.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Biochip mit einer Monoschicht aus Regenbogenforellen-Kiemenepithelzellen herstellen und diesen Biochip anschließend in einem impedanzbasierten Toxizitätstest zur Bewertung der Trinkwassertoxizität verwenden können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, bei der Vorbereitung der Biochips aseptisch zu arbeiten und die Biochips bis zu ihrer Verwendung gekühlt aufzubewahren. Jeder Biochip kann nur einmal verwendet werden und muss dann entsorgt werden.

Einmal gemeistert, kann die Biochip-Vorbereitung in etwa 10 Minuten durchgeführt werden. Dies ist eine Schätzung, da die Chips in Chargen hergestellt werden. Die Impedanzprüfung der Probe, einschließlich der Probenvorbereitung, dauert bei ordnungsgemäßer Durchführung etwa eine Stunde und 10 Minuten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z. B. die analytische Chemie, an einer Probe durchgeführt werden, die zu einem kontaminierten Ergebnis geführt hat, um die verdächtige Chemikalie(n) zu identifizieren. Die Entwicklung dieser Technik ebnet Forschern, die sich für die Messung von Wassertoxizität interessieren, den Weg, um Technologien mit Regenbogenforellen-Kiemenepithelzellen und Impedanzmessung zu nutzen. Wir hoffen, dass Sie die Techniken nützlich finden und freuen uns auf zukünftige Innovationen, die diese neuen Funktionen erleichtern können.

Vielen Dank und einen schönen Tag.