Name: Herstellung und Prüfung von impedanzbasierten Fluidic Biochips mit RTgill-W1 Zellen für die schnelle Auswertung von Trinkwasserproben für Toxizität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung impedanzbasierter Fluidic-Biochips mit RTgill-W1-Zellen zur schnellen Trinkwassertoxizitätsprüfung. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Feldmessungen für Umweltmonitoring.

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Diese Arbeit wurde vom US Army Medical Research and Materiel Command und vom Small Business Innovation Research and Small Business Technology Transfer Program unterstützt; Vertrag Nr. W81XWH-13-C-0093. Wir danken Dr. Lucy Lee von der University of Fraser dafür, dass sie unsere Mentorin für RTgill-W1-Zellkulturen ist, und danken Dr. Niels Bols von der Waterloo University für die Entwicklung der RTgill-W1-Zelllinie.

1. Herstellung von Testmaterialien HINWEIS: Um die Biochips für die Prüfung, mehrere konfluenten Flasche aus RTgill-W1 Zellen vorbereiten müssen bereit sein. Eine gute Schätzung der Anzahl der Flaschen benötigt wird, ist ein konfluenter T175-Kolben für 16 Biochips ausgesät werden. <ol><li> Führen Sie die folgenden Schritte in einer Klasse II biologischen Sicherheitsschrank (biohood) unter aseptischen Bedingungen. Verwenden Sie 70% Ethanol für die biohood Desinfektion und alle in der Haube platziert Materialien. <ol><li> Bereiten Fibronektin Substrat für die fluidische Biochips durch eine 1 mg Phiole von Fibronektin Auftau- und in 100 ml sterilem L-15-Medien für eine Konzentration von 10 ug / ml verdünnt. Einfrieren in 40 ml Aliquots in sterilen 50 ml konischen Polypropylen-Röhrchen bei -20 ° C. Bei Raumtemperatur auftauen mehrere Stunden vor der Biochips Aussaat. Nach dem Auftauen nicht wieder einfrieren. </li><li> Bereiten Zellkulturmedien mit 50 ml fötalem Rinderserum Zugabe von 5 ml 200 mM ein L-alanyl-L-glutamin supergänzen, und 5 ml einer Penicillin / Streptomycin-Lösung (10.000 Einheiten Penicillin / ml und 10.000 &amp; mgr; g Streptomycin / ml) Lager zu 500 ml L-15-Medien. Dies wird 560 ml Zellkulturmedien ergeben, enthaltend 9% Serum. Kalt stellen. Hinweis: Dadurch wird die komplette Zellkulturmedien für den Kulturflaschen und die Biochips verwendet werden. </li></ol></li><li> Pulverisierte Medien Vials <ol><li> Bereiten Sie vor der Zeit 0,1 Dram-Snap-cap Fläschchen mit 60 mg ± 0,5% L-15ex Pulver eine automatisierte Pulverspender verwenden. Beschriften Sie die Fläschchen mit dem Tag wurde das Pulver abgegeben und im Kühlschrank lagern Fläschchen (in Mengen von 50) in wiederverschließbaren metallisierter Poly-Taschen; die jeweils drei 1 g Kieselgel Austrocknungs Packungen. Anmerkung: L-15ex pulverisierten Medien Phiolen können hergestellt und für bis zu 9 Monate vor der Prüfung aufbewahrt werden. </li></ol></li><li> Machen Sie eine Lösung von 100 ml 20% Bleiche von Haushaltsbleiche mit entsalztem Wasser (DI) zu verdünnen. Schätzung, dass 5 ml Bleichlösung für jede bi benötigt werdenochip. </li><li> Machen Sie Biochip Röhrenanordnungen von 27 mm Abschnitte von autoklavierbaren bioverträglichen Rohrschneiden (2 Abschnitte für jeden Biochip werden ausgesät) und passen die beiden Enden des Rohres mit Polycarbonat-Rutsch Luerverbindungen. Platzieren Röhrenanordnungen in einem autoklavierbaren Beutel und Autoklaven für 8 min bei 134 ° C. Auch Autoklaven Biochip-Stecker (2 pro Biochip) in einem separaten Beutel bei den gleichen Einstellungen. </li><li> Autoklav DI-Wasser für 30 min at121 ° C. Hinweis: Dieses Wasser wird zum Spülen Biochips nach dem Aussäen verwendet werden. Schätzen, dass 10 ml für jeden Biochip benötigt werden. Anmerkung: Der tatsächliche Volumen jeder Biochip Kanal 2 ml, aber 5 ml sterilem Wasser durch jeden Kanal nach Entfernung der Bleichlösung gespült. </li><li> Machen Spritzeninjektionsröhrenanordnungen durch Schneiden 27 mm Abschnitte aus biokompatiblem Schläuche und Befestigungs männlichen Luer-Rutscheinrichtungen an beiden Enden des Schlauches. Legen Röhrenanordnungen in einem Papierheißsiegelsterilisationsbeutel und Autoklaven für 8 min bei 134 &amp;# 176; C. </li></ol> 2. Fluidic Biochip Impfvorgangs Hinweis: Führen Sie alle Verfahren, bei denen die Biochips oder die Medien in einer Klasse II biologischen Sicherheitsschrank unter aseptischen Bedingungen behandelt wird. <ol><li> Vierundzwanzig Stunden nach geplanten Aussaat vor, entfernen Sie die Biochips Hersteller Verpackung in der biohood und in sterilisierten Kunststoff Instrumentenkoffern. </li><li> Sterilisieren der Biochips eine 20% -ige Bleichlösung wie folgt Anmerkung: In der Vergangenheit diese Bleichverfahren wurde das Pilzwachstum in der Biochips bei Langzeitlagerung in dem Fall verhindert, dass die Plasmasterilisation der vom Hersteller durchgeführt Biochips nicht wirksam war. <ol><li> Unter Verwendung einer 20 ml sterile Spritze mit einem Spritzeninjektionsrohranordnung befestigt und in der Arbeits biohood injizieren 2 ml der 20% igen Bleichlösung in jeden Kanal des Biochips. Lassen Sie die Biochips für 1 Stunde mit der Bleichlösung zu sitzen. </li><li> Nach einer Stunde Unterdruck aspwütend die Bleichlösung aus beiden Kanälen eines sterilen männlichen Luer Slip Montage an dem Vakuum-Saug-Schlauch verwenden. Verwenden Sie eine der Biochip-Röhrenanordnungen als Drain, wenn die Biochips Spülung. </li><li> Mit einer sterilen 20-ml-Spritze mit einer sterilen Spritze Einpritzeinheit angebracht, spülen Sie jeden Kanal des Chips mit 5 ml sterilem Wasser, so dass das überschüssige Wasser in einen Behälter zu entleeren im biohood. Dann Vakuum absaugen das Wasser als nur für das Bleichmittel beschrieben und legen Sie die Biochips zurück in die Kunststoff-Instrumentenkoffern und im biohood verlassen, bis und mit Zellen besiedelt am folgenden Tag. </li></ol></li><li> Sechzig Minuten vor der Biochips Animpfen injizieren 2 ml der 10 ug / ml Fibronektin-Lösung in jeden Kanal des Biochips. Lassen Sie die Biochips in der biohood für 60 Minuten, und dann absaugen das Fibronektin Vakuum (wie in Schritt 2.2.3 beschrieben), bevor der Biochip mit Zellen Aussaat. Legen Sie zwei Abschnitte der sterilen Biochip Röhrenanordnungen (sieheAbschnitt 1.4) an den Anschlüssen der Biochips. </li><li> Trypsinize 16 ein konfluenter RTgill-W1 T175 - Kolben für jeweils 16 Biochips beschriebenen Verfahren in dem Blatt American Type Culture Collection (ATCC) Produktbeschreibung verwendet wird . <ol><li> Absaugen Medien aus dem konfluenten Kolben (n) von Zellen. </li><li> Spülen Sie die Zellschicht mit 15 ml PBS und dann absaugen. </li><li> In 6 ml Trypsin / EDTA auf die Zellschicht in jedem T175 Kolben und erlauben Zellen für ~ 5 min zu trypsinize. </li><li> 15 ml komplette L-15-Zellkulturmedien zu jedem Kolben Trypsinierung zu stoppen. </li><li> Kombinieren die Zellsuspensionen in einem sterilen Einweg-Behälter. Hinweis: Gebindegröße von 150 bis 500 ml, abhängig von der Anzahl von Biochips variieren wird ausgesät. Schätzung, die 5 ml Zellsuspension werden pro Biochips benötigt werden. </li></ol></li><li> Entfernen Sie ~ 1 ml der Zellsuspension und in einen Mikrozentrifugenröhrchen für die Zählung. Mit einem Hellfeldmikroskop mit 10-facher objectiVE und einem Hämocytometer, ein 10 ul - Aliquot der Zellen zählen und das Volumen des kompletten L-15 - Zellkulturmedien Berechnung erforderlich , um eine Zellsuspension von 2,5 x 10 5 Zellen / ml zu erreichen. Hinweis: Wenn Sie die Zellsuspension unter Verwendung von Kolben zu impfen, die Kultur fortzusetzen, ist dies der Punkt sein würde, dies zu tun. Stellen Sie die Zellsuspension Konzentration mit kompletten L-15-Zellkulturmedien. </li><li> Mit einer sterilen 20 ml syringeattached auf eine sterile Spritze Injektionsschlauchleitungsbaugruppe (siehe Abschnitt 1.6), Injizieren von 2,5 ml der Zellsuspension in die Außenöffnung jedes Kanals des Biochips (dh die Anschlüsse, angebracht nicht den Schlauch haben), einige der zusätzlichen Zellsuspension erlaubt in der biohood aus dem Schlauch in einen Abfallbehälter zu fließen. Hinweis: Dadurch wird sichergestellt, dass der gesamte Kanal und die angeschlossenen Schläuche der Zellsuspension wird voll sein. <ol><li> Erstellen Sie eine geschlossene Schleife für jeden Biochip-Kanal durch das freie Ende des Schlauches mit den Luer fitti Einsetzenng in die äußeren Anschlüsse für jeden Kanal. </li><li> Wischen Sie überschüssige Medien aus der geschlossenen Schleifen mit einem Papiertuch mit 70% Ethanol befeuchtet und legen Sie die Biochips zurück in die Kunststoff-Box in einem 20 ° C Inkubator. Geben Sie jedem Biochip eine eindeutige Identifikationsnummer. </li></ol></li><li> An den Tagen 4 und 7, die Biochips aus dem 20 ° C Inkubator entfernen und die Medien in allen der Biochips mit temperatur äquilibriert vollständigen L-15 Zellkulturmedium aufzufüllen. Folgen Sie dem gleichen Verfahren wie in Schritt 2.6 außer Gebrauch nur L-15-Zellkulturmedien statt (keine Zellsuspension). Legen Sie die Biochips in der 20 ° C-Inkubator zurück nach dem Tag 4 Fütterung. <ol><li> Nach dem Tag 7 Fütterung, zu entfernen und die Schläuche von den Chips zu verwerfen und die autoklaviert Ablassschrauben in den Biochips einlegen. </li><li> Legen Sie die Biochips in einer Kiste in einem 6 ° C Inkubator bis zum Testen verwendet. Anmerkung: Die Chips können für bis zu 9 Monate bei Kühltemperaturen gelagert werden und sind immer noch lebensfähig zum Testen in die ECIS Leser. </li></ol></li></ol> 3. ECIS Testen mit Biochips <ol><li> Bereiten Testchemikalien bei der Verwendung. (Siehe Brennan et al., 2012 7 zur Herstellung von Testchemikalien). </li><li> Entfernen ECIS Leser und Testlieferungen aus dem Koffer. Entfernen Sie eine vorbereitete Biochips aus dem 6 ° C Inkubator. Setzen Sie den Biochip auf einem Papiertuch. Schalten Sie den ECIS Leser. </li><li> Unter Verwendung von 10 ml Spritzen, verzichtet werden 10 ml Steuer Wasser in eine Unze 0,5 markierten durchsichtigen Kunststoff-Kontrollglas und 10 ml der Testprobe in eine Unze 0,5 markierten durchsichtigen Kunststoff-Messbecher. Anmerkung: 1) Achten Sie darauf, Blasen für eine genaue Messung zu entfernen. 2) Die Spritzen und Gläser sind farbcodiert; Blau für die Steuerung und rot für den Test. </li><li> Entfernen Sie die zwei pulverisierte Medien Fläschchen aus den Folienbeutel. Öffnen Sie eine der pulverförmigen Medien Fläschchen (Verwendung Mehrzweckwerkzeug, wenn nötig) und gesamte Inhalt einer Flasche in das Glas mit Steuer Wasser gießen, das gesamte Fläschchen fallen inLösung auch. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem Testglas. Cap und schütteln Sie die Gläser, um sicherzustellen, dass das Pulver vollständig gelöst ist. </li><li> Füllen Sie jedes der farbigen 10 ml Spritzen mit 9 ml entweder Kontrolle (blau Spritze) oder Test (rot Spritze) Lösungen aus den jeweiligen Fläschchen. Entfernen von Luftblasen aus Spritzen. </li><li> Entfernen Sie die Stecker aus den Biochip-Ports und den Abfluss befestigen. </li><li> Setzen Sie den Biochip in den abnehmbaren Plastikschale in der ECIS-Leser und den Deckel schließen. </li><li> Bringen Sie Spritzen an die äußeren Biochip-Ports und den Spritzenkolben befestigen. </li><li> Aus dem Hauptmenü die Option &quot;NEXT&quot; Pre-Test zu initiieren. Hinweis: Reader-Software Impedanzen überprüfen. Wenn Impedanzen durch den Benutzer innerhalb des Bereichs festgelegt sind ( in der Regel zwischen 1.000 und 3.000 Ohm) wird der Bildschirm Register &quot;Cartridge Bestanden&quot; , wie in Abbildung 3 angegeben ist , und den Benutzer anweisen, wählen Sie &quot;Weiter&quot; und die Software wird weitergehen 3.10 zu Schritt). Wenn die Impedanzen nicht innerhalbdie eingestellten Bereich wegen eines defekten Biochips oder fehlerhafte Verbindung des Biochips für den Leser (in der Regel aufgrund einer Fehlausrichtung der Elektroden), dann wird der Bildschirm Register &quot;Cartridge Failed&quot; und der Benutzer hat die Möglichkeit, entweder auf &quot;Abbrechen&quot; oder &quot;Überprüfen&quot; den Test. <ol><li> Wählen Sie &quot;Abbrechen&quot; zurück 3.9 zu Schritt). Wählen Sie &quot;Überprüfen&quot;, um fortzufahren 3.10 Schritt A) nach einem Empfang &quot;Cartridge Bestanden&quot; Nachricht und wählen Sie &quot;Weiter&quot;. Hinweis: Es ist am besten, den Biochip zu nehmen und visuell untersuchen Sie ihn auf Mängel oder undicht, wenn eine &quot;Cartridge fehlgeschlagen&quot; Nachricht, bevor Sie mit einem neuen Biochip empfangen wird. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig3.jpg" /> Abbildung 3:. ECIS Reader Screenshot eines Biochips mit Acceptable Impedanzmessungen Der Screenshot zeigt Anfangsimpedanzmessungen in Ohm jeder der vier Control Elektroden (CE) und 4 Testprobe Elektroden (SE) im fluidischen Biochip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="10"><li> Wenn der Leser aufgefordert, geben Sie Probeninformationen eine Soft-Tastatur verwenden und wählen Sie dann auf &quot;Akzeptieren&quot;, wenn Sie fertig. Hinweis: Die ECIS-Reader-Software automatisch bei jedem Datensatz mit dem Datumsstempel wird, Zeit und andere Informationen, die von dem Benutzer eingegeben; wie die Biochip-Nummer und die Art der chemischen und Konzentration. Zwei Minuten von Impedanzdaten werden aus dem eingesetzten Biochips gesammelt werden und ein On-Screen-Timer Countdown-Zeit. </li><li> Nach zwei Minuten, wenn sie durch Anweisungen auf dem Bildschirm aufgefordert, die in einem roten Feld blinken, klicken Sie auf &quot;Weiter&quot;. Wenn durch Blinken der grünen Box aufgefordert, &quot;Proben injizieren jetzt&quot;, injizieren, um die Kontroll- und Testmedien aus den beigefügten Spritzen gleichzeitig in den Biochip channels. Lassen Sie die Spritzen an Ort und Stelle auf den Biochips, wenn Sie fertig. Hinweis: Impedanzwerte werden einmal pro Minute für 60 Minuten gesammelt werden. Wenn der Leser Software ECIS bestimmt, dass der Behandlungskanal von dem Steuerkanal an einer beliebigen Stelle zwischen 10 und 60 Minuten nach Testbeginn, dann ist die On-Screen-Display zeigt an, dass die Probe &quot;verseucht&quot; statistisch unterschiedlich ist. Wenn die Behandlung nicht verschieden von dem Steuerkanal ist, dann wird der Bildschirm die Meldung &quot;Keine Kontamination erkannt&quot; am Ende des Testlaufs. </li><li> Nehmen Sie die Testergebnisse als kontaminiert oder nicht für jede Probe verunreinigt. </li><li> Am Ende des Testlaufs, zu entfernen und den Biochip zu verwerfen. Spülen und der Luft trocknen die Spritzen, Teströhrchen und herausnehmbaren Plastikschale, die den Biochip während der Tests untergebracht. Hinweis: Die ECIS Leser verfügt über 4 GB Onboard-Speicher für die Betriebssoftware, Steuerungsmodelle und die Testdateien generiert aus einem Test ausgeführt wird. Dies ermöglicht mehrere thousand Testdateien auf dem Lesegerät gespeichert werden. Die Dateien können mit einem USB-Sprung-Antrieb abgerufen werden und für weitere Analysen zu Forschungszwecken auf einen Computer übertragen, falls gewünscht. </li></ol>

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Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die der Autoren und werden nicht unbedingt von der US-Armee unterstützt. Die Zitate kommerzieller Organisationen oder Handelsnamen in diesem Bericht stellen keine offizielle Billigung oder Genehmigung der Produkte oder Dienstleistungen dieser Organisationen durch das Department of the Army dar. Die Autoren Linda M. Brennan und Mark W. Widder, beide vom US Army Center for Environmental Health Research, erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben. Michael Mayo, Michael McAleer und Alex Greis sind Mitarbeiter von Nanohmics, die die in diesem Artikel verwendeten Einweg-Biochips und -Instrumente herstellen.10251980

Die ECIS Technologie eine gute Leistung in einer Laborumgebung und war in der Lage mögliche Wasser Verunreinigungen in Konzentrationen zu ermitteln, die für die menschliche Gesundheit relevant sind. Die Portabilität und Verpackung der Technologie macht es auf den Feldeinsatz förderlich. Kritische Schritte in dem Protokoll für den Erfolg der Technik sind wie folgt: 1) Halten Sie aseptischen Bedingungen während der Kultur, Säen und Fütterung der Biochips, 2) Halten Sie die ausgesäten Biochips in gekühlten Bedingungen bis zum Testen bereit, da die RTgill-W1-Zellen wird nicht sehr lange überleben, wenn sie auf Temperaturen über 25 ° C ausgesetzt sind, 3) wird genau das L-15ex in den pulverförmigen Phiolen Medien und genau die Wasserproben Fehlalarme zu vermeiden messen Herstellung, die durch eine Verschiebung der verursacht werden kann Osmolalität von Medien eher als Probe Toxizität, 4) zum Ausführen der Tests Gebrauchsanweisungen auf der ECIS Bildschirm. Die Software in dem Lesegerät alarmiert den Benutzer, wenn eine biochip ist nicht akzeptabel für die Prüfung (bezogen auf den anfänglichen Impedanzmessungen), wenn der Biochip zuerst in das Lesegerät eingeführt wird. Wenn die Impedanzniveaus nicht akzeptabel für die Prüfung sind, wird die Software nicht zulassen, dass der Benutzer mit der Prüfung fortfahren, bis ein neuer Biochip verwendet wird. Gründe für nicht akzeptabel Impedanzmessungen sind in der Regel aufgrund einer leichten Versatz der Biochip-Elektroden mit den ECIS Leser Stifte oder Flüssigkeitsleckage an einer der Verklebung Kanten des Biochips. Es gibt einige Grenzen dieser Technologie, da der ECIS Sensor nur mit Trinkwasser und nicht mit Oberflächenwasser getestet. Die RTgill-W1-Zellen, die auf dem Biochip sind, können nicht das Einfrieren oder die Temperaturen weit über 25 ° C für längere Zeit (Zeitrahmen abhängig von Stunden bis Tagen sein kann, von der Temperatur tolerieren. Die Biochips am besten funktionieren in einem Temperaturbereich von gekühlt Raumtemperatur 7. Sie sind sofort einsatzbereit, jedoch direkt nach r zu seinemoved von kalten Lagerung. Tragbare Kühlraumbehälter werden derzeit von Armeepersonal im Bereich für temperaturempfindliche Versorgungen verwendet. Diese gleichen Behälter können für geimpfte Biochip Transport verwendet werden. Eine weitere Beschränkung dieser Technik besteht darin, dass, obwohl es ein Breitbandsensor Toxizität ist, ist es nicht gut reagiert, wenn überhaupt, auf die Cholinesterase-hemmenden Verbindungen, wie einige Pestizide. Um diese Fähigkeit Lücke zu füllen, wird der ECIS-Sensor entwickelt, um mit einem im Handel erhältlichen schnellen Pestizid-Test-Test in Verbindung verwendet werden, wenn Wasserproben, um die Prüfung der Benutzer mit einem breiteren Spektrum von Toxizitätstests zur Verfügung zu stellen. Das Kit ist eine schnelle enzymatische Assays entwickelt, um Organophosphat und Carbamatpestiziden innerhalb von 30 Minuten zu erkennen. Die ECIS Sensor ergänzt das WQAS-PM (Water Quality Analysis System - Präventive Medizin) Bereich Wasser-Testsystem, das derzeit von militärischen Präventivmedizin Personal zur Erkennung, arsenic, Blei oder Zyanid in einer Trinkwasserprobe. Obwohl der ECIS Sensor nicht erkennen, was die Verunreinigung ist, zeigt es, wenn bestimmte Metalle oder organische Verbindungen vorhanden sind, was darauf hinweist, dass das Wasser nicht für den menschlichen Verzehr geeignet sind. Die ECIS Testergebnisse sind innerhalb einer Stunde zur Verfügung. Die Wasserproben können dann zur Identifizierung der kontaminierenden gesendet für eine weitere Analyse, wenn es ein positives Testergebnis. Wie oben beschrieben, wird der ECIS Leser ausgelegt ist Teil eines Systems sein, die eine separate enzymatische ACE-Kit, um ein breites Spektrum an Fremdkörperdetektion zur Deckung umfasst. Beide Leser werden in einem robusten Gehäuse verpackt für Feldtransport für den Feldeinsatz von Soldaten.

Das Ziel war es, ein Verfahren für die Zellaussaat, Lagerung und Prüfung von fluidischen Biochips im ECIS Biosensor zu entwickeln. Das Ziel für die Entwicklung dieses Biosensor war US-Armee Spezifikationen für ein Feld tragbares Gerät zu erfüllen, die eine mögliche Kontamination von Trinkwasserversorgung von Soldaten benutzt wird erkennen konnte. Die Anforderungen an die Toxizität Sensor waren, dass sie sich schnell ein breites Spektrum von toxischen Industrie Verbindungen erkennen konnte (innerhalb einer Stunde) in Konzentrationen relevant für die menschliche Gesundheit, dass das Gerät Feld tragbar sein, und die biologischen Komponenten würde eine Haltbarkeit haben, mindestens neun Monate. Kältetechnik, aber nicht das Einfrieren, die von verderblichen Komponenten war akzeptabel. Historisch gesehen haben, Feld tragbaren Wasser Prüftechnik mit einer biologischen Komponente , um sie (wie Antikörper, Enzyme oder Nucleinsäuren) Analyt-spezifischen 1-3. Der Nachteil dieser Art von Biosensoren ist, dass sie onl wirdy zu einem Zeitpunkt eine Art der chemischen Erkennung. Mehrere Sensoren benötigt werden, wenn vermutet wird, dass mehr als eine Chemikalie vorhanden ist. Wenn ein bestimmter Sensor nicht im Test Repertoire, chemische Verunreinigungen im Wasser ist, könnte leicht unentdeckt bleiben. Breit abgestütztes Toxizität Sensoren, auf der anderen Seite, haben das Potenzial, diese Technologielücke zu füllen. Diese haben in der Regel eine zelluläre Komponente , um sie 4-8. Die Vorteile der breit abgestützten Toxizität Biosensoren sind , dass sie das Vorhandensein einer Vielzahl von chemischen Verunreinigungen erkennen kann, einschließlich Mischungen und Unbekannten, in einem relativ kurzen Zeitraum 5,9,10. Das Konzept der Messung der elektrischen Impedanz von Zellmonolayern als mögliche Toxizitätssensor, der auch als elektrische Zell-Substrat - Impedanz - Mess (ECIS), wurde zuerst bekannt ist 11 von Giaever und Keese beschrieben. In den vergangenen zwei Jahrzehnten ein empfindlicher Indikator für Zell VIAB erwiesen wurdeility und Zytotoxizität. Grundsätzlich wird die Zellmonoschicht, die an die Elektroden auf den Biochips anhaftet auf Hochfrequenz ausgesetzt und niedriger Spannung und Stromstärke Wechselstromsignal. Die konfluente Monoschicht von Zellen behindert den Fluss der Elektronen. Wenn die Integrität der Zellmonoschicht beeinträchtigt ist (beispielsweise wenn eine giftige Chemikalie eingebracht wird), zeichnet der ECIS Sensor eine Änderung in der elektrischen Impedanz 11-14. 1 veranschaulicht das Prinzip der ECIS in Bezug auf die Zellmonoschicht auf dem Biochip . <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig1.jpg" /> Abbildung 1:.. Das Prinzip der ECIS Illustration einer Zellschicht auf einem Biochip mit vereinfachten ECIS Leser elektrisches Schema <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 12 beschrieben , verwendet. Diese Zellen waren nicht praktisch für den Feldeinsatz, aber, weil sie häufige Medienwechsel erforderlich ist , hatte eine begrenzte Haltbarkeit und erforderte eine künstliche CO 2 -Umgebung und 37 ° C Inkubationstemperatur. Es wurde entdeckt , daß ein im Handel erhältlicher Zelllinie , abgeleitet von Regenbogenforellen gill Epithelzellen (RTgill W-1 - Zellen) bei Raumtemperatur bei Umgebungs CO 2, getestet werden, um eine konfluente Monoschicht in den Biochips gebildet, könnte bei Kühltemperaturen gelagert werden, und hatte eine schnelle Reaktion (1 h oder weniger) zu einem breiten Spektrum an Chemikalien bei Konzentrationen relevant für die menschliche Gesundheit 12. Anwendungen von RTgill-W1 - Zellen in der Toxikologie, sowie in der Grundlagenforschung werden von Lee et al überprüft. 15 Verfahren für die Aussaat, Lagerung und Prüfung von fluidischen Biochips enthalten,Monoschichten von RTgill-W1 Zellen auf fluidische Biochips in einem Biosensor ECIS werden hier beschrieben. Die fluidische Biochips können für bis zu 9 Monate in einem gekühlten Zustand gelagert werden und kann zum Testen von Trinkwasser supplies.The begleitenden ECIS Leser, oder Testeinheiten werden separat ausgeliefert in einem kalten Lagerbehälter, versendet werden. Die Biochips haben zwei Komponenten zu ihnen; eine obere Polycarbonatschicht mit zwei getrennten Fluidkanäle, und eine untere Schicht, die elektronische vier Elektroden-Pads pro Kanal für die Impedanzabtastung enthält. Es gibt 10 Arbeitselektroden pro Pad; jede Elektrode 250 &amp; mgr; m im Durchmesser. Die versammelten Biochips haben Goldelektrodenanschlüsse zum Erfassen von Messwerten Impedanz, wenn sie in der ECIS Testgerät eingesetzt. Jede der beiden geschlossenen fluidischen U-förmige Kanäle hält 2 ml der RTgill-W1 Zellsuspension. 2 zeigt eine fluidische Biochip in dem ECIS Leser mit einer Vergrößerung von einer konfluenten Zellen auf einer einzelnen Sensorelektrode. Abbildung 2:.. Fluidic Biochip in ECIS Reader gezoomten Bereich zeigt eine konfluente Monoschicht von RTgill-W1 - Zellen auf einer einzigen Sensorelektrode <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com</td><td>16000-085</td><td>@ -20 °C lagern. Vor Gebrauch @ Raumtemperatur auftauen. Zutat für vollständige L-15-Zellkulturmedien (10%).</td></tr><tr><td>Fibronektin, Rinderplasma</td><td>EMD Millipore Corp.&nbsp; &nbsp; www.emdmillipore.com&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>341631-1 mg</td><td>@ -20 °C lagern. Vor Gebrauch @ Raumtemperatur auftauen. Mit L-15-Medien mischen, um eine Konzentration von 10 &#956 zu erreichen; g/ml und Freeze @ -20 &deg; C in Aliquoten. Verwendung als Substrat für Biochips.</td></tr><tr><td>L-15 Medien ohne L-Glutamin</td><td>Lonza&nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>12-700F</td><td>Basalmedien für Zellkulturen und die Fütterung von Biochips. Bei 6 °C lagern.</td></tr><tr><td>L-15ex pulverförmiges Medium mit Phenolrot</td><td>US Biological&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.usbio.net</td><td>L1501</td><td>Medium wird in 60 mg Aliquoten in 0,1-Dram-Fläschchen abgewogen und bei 6 μg gelagert; C in Folienbeuteln mit Trockenmittelpackungen. Neun Monate Haltbarkeit. Gemischt mit 10 ml Wasserprobe zum Testen in Biochips.</td></tr><tr><td>PBS, ohne Ca2+ oder Mg2+</td><td>Lonza&nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>17-516F</td><td>Bei Raumtemperatur lagern. Wird zum Spülen von Medien bei der Trypsinisierung von Zellkulturflaschen verwendet. &nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin, EDTA</td><td>Lonza&nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>CC-5012</td><td>@ -20 °C. Bei Raumtemperatur auftauen und zur Trypsinisierung von Zellkulturflaschen verwenden.</td></tr><tr><td>T175 Kulturflaschen</td><td>Fisher Scientific www.fishersci.com</td><td>12-565-30</td><td>Wird zur Kultivierung von RTgill-W1-Zellen verwendet.</td></tr><tr><td>Bleichmittel</td><td>Chlorox&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td> www.chlorox.com <td>Auf 20 % mit Millique oder destilliertem Wasser verdünnt zur Reinigung von ECIS-Chips. Jedes Haushaltsbleichmittel ist akzeptabel.</td></tr><tr><td>70% Ethylalkohol</td><td></td><td></td><td>Zur Desinfektion von Biohaubenoberflächen und Materialien, die in Biohauben platziert werden.</td></tr><tr><td>Kiemenzellen der Regenbogenforelle (RTgill-W1)&nbsp;</td><td>Sammlung von Gewebekulturen des amerikanischen Typs &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.atcc.org</td><td>CRL-2523</td><td>Zellen, die kultiviert und für Biosensoren verwendet werden (Seeding-Biochips).</td></tr><tr><td>GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM</td><td>Lonza&nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>35050-061</td><td>Bei Raumtemperatur lagern. Zutat für vollständige L-15-Zellkulturmedien (1%).</td></tr><tr><td>Penn/Strep Stock 10K/10K</td><td>Lonza&nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>17-602E</td><td>Lagern @ -20 °C. Vor Gebrauch @ Raumtemperatur auftauen. Zutat für vollständige L-15-Zellkulturmedien (1%).</td></tr><tr><td>Pharmed BPT</td><td>Schläuche U.S. Plastic Corp.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.usplastic.com</td><td>57317</td><td>In 27 mm Schliff geschnitten und autoklaviert. Wird für die Aussaat von Biochips mit Zellen und als geschlossener Kreislauf zwischen Medienwechseln verwendet.</td></tr><tr><td>Polycarbonat-Luer-Verschraubungen für Pharmed Schlauchleitungen</td><td>Value Plastics&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>MTLS210-9</td><td>Befestigt an jedem Ende des geschnittenen Pharmed-Schlauchs zum Einführen in Bichips.</td></tr><tr><td>20 ml Spritzen mit Aufsteckspitze</td><td>VWR Scientific &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; us.vwr.com</td><td>BD302831</td><td>Wird zur Injektion von Zellsuspension für die Aussaat von ECIS-Chips sowie zur Fütterung von Chips verwendet.</td></tr><tr><td>0,1 Dram Mikrofläschchen aus Polypropylen mit Schnappverschluss</td><td>Flaschen, Gläser und Tuben, Inc.&nbsp; &nbsp; www.bottlesjarsandtubes.com</td><td>30600</td><td>Zur Aufbewahrung von 60 mg Aliquoten von L-15ex pulverförmigen Medien.</td></tr><tr><td>60 mil Lexan fluidische ECIS-Biochips</td><td>Nanohmics, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td> www.nanohmics.com <td>Maßgeschneidert von Nanohmics, Inc. RTgill-W1-Zellen werden in die Biochips injiziert und die geseedeten Chips werden zum Testen in den ECIS-Reader gelegt.</td></tr><tr><td>Autoklavierbare Instrumentenbox aus Kunststoff 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8"</td> <td>Medi-Dose EPS&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; medidose.com</td><td>IB701</td><td>Wird zur Aufbewahrung von folgenden Komponenten verwendet: autoklavierte Stecker, gereinigte Biochips, ausgesäte Biochips.</td></tr><tr><td>Heißsiegel-Sterilisationsbeutel aus Papier, 7 & frac12; &rdquo; x 13"</td><td>KardinalGesundheit&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.cardinalhealth.com</td><td>90713</td><td>Wird zum Autoklavieren von Rohren, Verschraubungen und Stopfen verwendet.</td></tr><tr><td>Quantos automatisierter Pulverdosierer</td><td>Mettler Toledo&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.mt.com</td><td>QB5</td><td>Automatisierte Abgabe von 60 mg Aliquots von pulverförmigem L-15ex in 0,1-Dram-Fläschchen.</td></tr><tr><td>ECIS-Lesegerät</td><td>Nanohmics, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td> www.nanohmics.com <td>Maßgeschneidert von Nanohmics, Inc. Ein gesäter Biochip wird in das Lesegerät eingesetzt, um Wassertoxizitätstests durchzuführen.</td></tr><tr><td>3 x 5 metallisierte 2,5 mil wiederverschließbare Beutel aus Polypropylen</td><td>Uline&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.uline.com</td><td>S-16893</td><td>Verpackung und Lagerung von Biochips mit Saatgut und pulverförmigen L-15ex-Medienfläschchen.</td></tr><tr><td>Leatherman squirt ps4</td><td>Amazon&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td> www.Amazon.com <td>Wird zum Öffnen von Fläschchen mit Pulvermedien verwendet.</td></tr><tr><td>1 g Kieselgel-Trockenmittel-Päckchen&nbsp;</td><td>Uline&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.uline.com</td><td>S-3902</td><td>In Polypropylenbeutel mit L-15ex Durchstechflaschen für Pulvermedien geben, um zu verhindern, dass das Pulver Feuchtigkeit aufnimmt.</td></tr><tr><td>Sterile 250- oder 500-ml-Nalgene-Flaschen</td><td>Fisher Scientific www.fishersci.com</td><td>09-740-25C oder E</td><td>Hold-Zellsuspensionen für die Aussaat von ECIS-Chips in der Biohaube.</td></tr><tr><td>Stecker für Biochips</td><td>Nanohmics, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td> www.nanohmics.com <td>Maßgeschneidert von Nanohmics, Inc. Wird verwendet, um Ports auf Biochips vor der Lagerung bei 6 °C abzudichten.</td></tr><tr><td>Abflüsse für ECIS-Biochips</td><td>Nanohmics, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td> www.nanohmics.com <td>Sonderanfertigung von Nanohmics, Inc. Vor dem Einsetzen in den ECIS-Leser an 2 inneren Anschlüssen an Biochips. Ermöglicht das Abfließen von überschüssigem Medium aus den Kanälen während der Testinjektionen.&nbsp;</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Fisher Scientific www.fishersci.com</td><td>S17040</td><td>Wird zum Zählen von Zellen vor dem Einstellen der Zellsuspension für die Injektion in Biochips benötigt.</td></tr><tr><td>Hellfeldmikroskop mit 10X Objektiv</td><td>Leitz Labovert</td><td></td><td>Jedes Hellfeldmikroskop ist akzeptabel.</td></tr><tr><td>Biologische Sicherheitswerkbank</td><td></td><td></td> der Klasse II Jede <td>biologische Sicherheitswerkbank der Klasse II, in der die Zellkultur unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden kann, ist akzeptabel.</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 0,6 ml</td><td>Fisher Scientific www.fishersci.com</td><td>02-681-311</td><td>Fasst 1 ml Zellsuspension vor dem Zählen der Zellen.</td></tr><tr><td>Slip 10 cc rote Spritzen</td><td>Procedure Products, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.procedureproducts.com</td><td>S/49S 30-R</td><td>Entnahme von 9 ml Testwasserprobe und Verwendung zur Injektion der Probe in den Biochip.</td></tr><tr><td>Slip 10 cc blaue Spritzen</td><td>Procedure Products, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.procedureproducts.com</td><td>S/49S 30-B</td><td>Entnahme von 9 ml Kontrollwasserprobe und Verwendung zur Injektion der Probe in den Biochip.</td></tr><tr><td>&frac12; oz. durchsichtiges PET-Plastikglas mit weißen, gerippten, gefütterten Kappen</td><td>SKS-Flasche & Packaging, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.sks-bottle.com</td><td>0605-30</td><td>Probenfläschchen zum Mischen von L-15ex-Pulver und 10 ml Wasserprobe zu Testzwecken.</td></tr><tr><td>50 ml sterile konische Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen</td><td>Fisher Scientific&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.fishersci.com</td><td>12-565-269</td><td>Zur Aufnahme von 40 ml Aliquoten von 10 &#956; g/ml Fibronektin bei -20 °C.</td></tr><tr><td>NIDS ACE Acetylcholinesterase-Hemmer-Nachweistest</td><td>ANP Technologies, Inc. www.anptinc.com</td><td>ACE-400</td><td>Sensor für den schnellen Nachweis von Pestiziden im Trinkwasser</td></tr></tbody></table>

herstellung und prüfung von impedanzbasierten fluidic biochips mit rtgill-w1 zellen für die schnelle auswertung von trinkwasserproben für toxizität

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Dieses Manuskript beschreibt, wie fluidische Biochips mit Regenbogenforellen-Kiemenepithelzellen (RTgill-W1) für den Einsatz in einem tragbaren Wassertoxizitätssensor für das Feld hergestellt werden können. Eine Monoschicht aus RTgill-W1-Zellen bildet sich auf den Sensorelektroden, die in den Biochips eingeschlossen sind. Die Biochips werden dann für Tests in einem tragbaren ECIS-Gerät (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing) vor Ort verwendet, das für schnelle Toxizitätstests von Trinkwasser entwickelt wurde. Das Manuskript beschreibt weiterhin, wie ein Toxizitätstest mit den vorbereiteten Biochips durchgeführt werden kann. Eine Kontrollwasserprobe und die Testwasserprobe werden mit vorgemessenen pulverförmigen Medien gemischt und in separate Kanäle des Biochips injiziert. Die Impedanzmesswerte der Messelektroden in jedem der Biochipkanäle werden von einer automatisierten statistischen Software gemessen und verglichen. Auf dem Bildschirm des ECIS-Geräts wird innerhalb einer Stunde nach der Probeninjektion entweder "Kontamination erkannt" oder "Keine Kontamination erkannt" angezeigt. Die Vorteile sind die einfache Handhabung und die schnelle Reaktion auf ein breites Spektrum anorganischer und organischer Chemikalien in Konzentrationen, die für die menschliche Gesundheit relevant sind, sowie die Langzeitstabilität der gelagerten Biochips in einem testbereiten Zustand. Einschränkungen sind die Forderung nach Kühllagerung der Biochips und die eingeschränkte Empfindlichkeit gegenüber Cholinesterase-hemmenden Pestiziden. Anwendungen für diesen Toxizitätsdetektor sind die schnelle, vor Ort tragbare Prüfung der Trinkwasserversorgung durch das Personal der Präventivmedizin der Armee oder der Einsatz in kommunalen Wasseraufbereitungsanlagen.

Die ECIS Technologie in diesem Papier beschrieben unterzog Prüfung bei der US Environmental Protection Agency (US-EPA) -sponsored Technik Prüf- und Evaluation Program (TTEP). Dreizehn Chemikalien wurden für die Prüfung als Vertreter eines breiten Spektrums von toxischen Industrie Verbindungen ausgewählt, die mögliche Verunreinigungen von Trinkwasser sein könnte. Während des Tests, 9 der 13 durch ECIS innerhalb einer Stunde bei Konzentrationen nachgewiesen wurden , die für die menschliche Gesundheit relevant sind 8. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse dieser Verunreinigungsprüfung. 4 Figur ist repräsentativ , was ein &quot;verseucht&quot; Ergebnis wie auf aussehen der ECIS Leser Bildschirm. Zum größten Teil, verminderte zelluläre Impedanzen für kontaminierte Proben im Vergleich zu Kontrollen. Gelegentlich können bestimmte Verbindungen, die eine Erhöhung der Impedanz verursachen. Auch in Tabelle 1 zusammengefasst </strong&gt; ist die saubere Wasserprüfung. Vierzig saubere Wasserproben wurden durchgeführt und keine Verunreinigung wurde in keiner der Proben (siehe Abbildung 5) für einen repräsentativen Screenshot von &quot;No Verunreinigung festgestellt&quot; erkannt. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig4.jpg" /> Abbildung 4: ECIS Reader Screenshot einer &quot;verseucht&quot; Wasserprobe Ein Beispiel für eine normalisierte Impedanz Grafiken und Ergebnisse aus einer Wasserprobe , die verunreinigt war.. Blaue Linien stellen normalisierte Impedanzen von jeder der Steuerelektroden; roten Linien stellen normalisierte Impedanzen jedes der Testprobe Elektroden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig5.jpg" /> Abbildung 5: ECIS Reader Screenshot einer &quot;No Verunreinigung festgestellt&quot; Wasserprobe Ein Beispiel für eine normalisierte Impedanz Grafiken und Ergebnisse aus einer Wasserprobe , die nicht verunreinigt war.. Blaue Linien stellen normalisierte Impedanzen von jeder der Steuerelektroden; roten Linien stellen normalisierte Impedanzen jedes der Testprobe Elektroden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Kategorie </td><td> Contaminant </td><td colspan="3"> Getestete Konzentration (mg / L) 1 </td><td colspan="2"> Erkannt ≤1 Stunde n = 4/4 Chips </td></tr><tr><td rowspan="8"> Pestizide </td><td> Aldicarb </td><td colspan="3"> 0,17 </td><td colspan="2"> Nein </td></tr><tr><td> Arsen<html> ic (Natriumarsenit) </td><td colspan="3"> 4.5 </td><td colspan="2"> ja </td></tr><tr><td> Azid (Natriumazid) </td><td colspan="3"> 46.7 </td><td colspan="2"> ja </td></tr><tr><td> Fenamiphos </td><td colspan="3"> 0,56 </td><td colspan="2"> Nein </td></tr><tr><td> Methamidophos </td><td colspan="3"> 1.4 </td><td colspan="2"> Nein </td></tr><tr><td> methyl Parathion </td><td colspan="3"> 33.6 </td><td colspan="2"> ja </td></tr><tr><td> Paraquat (dichlorid) </td><td colspan="3"> 4.6 </td><td colspan="2"> Nein </td></tr><tr><td> Pentachlorophenate (Natrium) </td><td colspan="3"> 71,9 </td><td colspan="2"> ja </td></tr><tr><td rowspan="5"> Industriechemikalien </td><td> Ammoniak </td><td colspan="3"> 924 </td><td colspan="2"> ja </td></tr><tr><td> Kupfer (Kupfer-II-Sulfat) </td><td colspan="3"> 103 </td><td colspan="2"> ja </td></tr><tr><td> Cyanid (Natrium) </td>3 &quot;&gt; 14 </td><td colspan="2"> ja </td></tr><tr><td> Mercury (Chlorid) </td><td colspan="3"> 24.7 </td><td colspan="2"> ja </td></tr><tr><td> Toluol </td><td colspan="3"> 444 </td><td colspan="2"> ja </td></tr><tr><td> Clean Water 2 </td><td> keiner </td><td colspan="3"> N / A </td><td colspan="2"> Nein </td></tr><tr><td colspan="7"> 1 getesteten Konzentrationen sind die gleichen wie in dem Manuskript von Widder, et al. (2014). </td></tr><tr><td colspan="7"> 2 40 saubere Wasserproben wurden ohne Kontamination führen. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Schadstoffe in Wasserproben durch ECIS erkannt.

Dieses Manuskript beschreibt, wie fluidische Biochips mit Regenbogenforellen-Kiemenepithelzellen für den Einsatz in einem tragbaren elektrischen Zellsubstrat-Impedanzsensor für das Feld vorbereitet werden können. Auch das Protokoll für die Durchführung eines Trinkwasser-Toxizitäts-Schnelltests mit dem Sensor wird beschrieben.

Herstellung und Prüfung von impedanzbasierten Fluidic Biochips mit RTgill-W1 Zellen für die schnelle Auswertung von Trinkwasserproben für Toxizität

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie ein Biosensor zur Bewertung der Toxizität von Trinkwasserproben eingesetzt wird. Dies wird erreicht, indem Biochips hergestellt werden, die eine einschichtige Zellkultur aus Regenbogenforellengillen enthalten, und diese anschließend als Bestandteil eines impedanzbasierten Biosensors verwendet werden. Dieses Verfahren ermöglicht es, chemische Toxizität in Trinkwasserversorgungen auf für die menschliche Gesundheit relevanten Konzentrationsniveaus schnell nachzuweisen.Die wichtigsten Vorteile dieser Technik bestehen darin, dass die Biochips unter Feldbedingungen verwendet werden können, dass sie bis zu neun Monate lang gekühlt gelagert werden können, ohne dass die Zellen gepflegt oder gewartet werden müssen, und dass sie jederzeit nach dem Entnehmen aus der Kühlung betriebsbereit zum Testen sind. Diese Prozedur wird Jordan McNairn, ein Studierender aus unserem Labor, demonstrieren. Am Tag vor der Zellseeding werden die Biochips aus ihrer Verpackung entnommen und in sterilisierte Kunststoff-Instrumentenkästen gelegt.Befestigen Sie eine der Schlauchbaugruppen an der Spritze und ziehen Sie eine 20%ige Bleichlösung in eine 20-Milliliter-Spritze auf. Injizieren Sie zwei Milliliter der Lösung in jeden Kanal des Biochips. Lassen Sie die Biochips nach Beendigung der Injektion eine Stunde lang mit der Bleichlösung einwirken.Nach einer Stunde verwenden Sie eine sterile Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer männlichen Luer-Anschlussarmatur verbunden ist und an eine Vakuumleitung angeschlossen ist, um die Bleichlösung aus beiden Kanälen zu aspirieren. Nachdem die Bleichlösung von dem Biochip abgesaugt wurde, befestigen Sie eine sterile Schlauchverbindung mit männlichen Luer-Anschlüssen an jedem Ende am Biochip, um diese als Ablauf bei der Spülung der Biochips zu nutzen. Danach ziehen Sie sterilem Wasser in eine 20-Milliliter-Spritze auf und spülen jeden Kanal des Chips mit fünf Milliliter Wasser durch. Aspirieren Sie das Wasser erneut unter Vakuum. Legen Sie die Biochips zurück in die Kunststoff-Instrumentenkästen. Lassen Sie die Biochips bis zum nächsten Tag in der Biosicherheitswerkbank stehen.Eine Stunde vor der Aussaat der Biochips pipettieren Sie zwei Milliliter einer Fibronectin-Lösung mit 10 Mikrogramm pro Milliliter in jeden Kanal des Biochips. Inkubieren Sie die Biochips 60 Minuten lang in der Biosicherheitswerkbank und saugen Sie anschließend die Fibronectin-Lösung unter Vakuum ab. Bringen Sie abschließend zwei sterile Biochip-Schlauchsysteme an den Anschlüssen der Biochips an und stellen Sie die Biochips beiseite, bis die Zellen zur Aussaat bereit sind.Entfernen Sie einen konfluenten T-175-Flasche mit Regenbogenforellengillenepithelzellen aus dem Inkubator und stellen Sie sie in die Biosicherheitswerkbank. Eine konfluente T-175-Flasche reicht für die Besiedlung von etwa 16 Biochips. Aspirieren Sie das Medium von den Zellen ab.Spülen Sie sie mit PBS und aspirieren Sie den PBS ab. Geben Sie anschließend sechs Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung auf die Zellschicht. Inkubieren Sie das Kolbenfläschchen bei Raumtemperatur für etwa fünf Minuten.Gegeben Sie dann 15 Milliliter komplettes L-15-Zellkulturmedium zu jedem Kolben hinzu, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen. Entnehmen Sie eine kleine Portion der Zellsuspension und verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellkonzentration zu bestimmen. Untersuchen Sie die Zellen mit einem Hellfeldmikroskop, das mit einem 10x-Objektiv ausgestattet ist.Berechnen Sie anschließend die aktuelle Zellkonzentration und stellen Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von einer Viertelmillion Zellen pro Milliliter ein. Injizieren Sie danach mithilfe einer sterilen 20-Milliliter-Spritze 2,5 Milliliter der Zellsuspension in den äußeren Anschluss jedes Kanals des Biochips. Lassen Sie die überschüssige Zellsuspension durch die Schläuche in einen Abfallbehälter abfließen.Erstellen Sie anschließend eine geschlossene Schleife für jeden Biochip-Kanal, indem Sie das freie Ende des Schlauchs mit Luer-Anschluss in die äußere Öffnung jedes Kanals einführen. Danach befeuchten Sie ein Papiertuch mit 70 % Ethanol und wischen damit überschüssiges Medium von den geschlossenen Schleifen ab. Stellen Sie die Biochips danach wieder in eine Plastikbox.An den Tagen vier und sieben entnehmen Sie die Biochips aus dem Inkubator und wechseln das Medium in den Biochips durch temperaturangepasstes vollständiges L-15-Zellkulturmedium. Nach der Versorgung am Tag sieben entfernen und entsorgen Sie die Schläuche von den Chips und setzen die autoklavierten Ablaufstopfen in die Biochips ein.Stellen Sie die Biochips bis zur Verwendung für Tests in einer Box in einen Inkubator mit sechs Grad Celsius. Entnehmen Sie das ECIS-Testgerät und das Zubehör aus dem Transportkoffer und schalten Sie das Gerät ein. Nehmen Sie außerdem einen der vorbereiteten Biochips aus dem Inkubator mit sechs Grad Celsius heraus und legen Sie ihn auf ein Papiertuch.Unter Verwendung einer 10-Milliliter-Spritze 10 Milliliter Kontrollwasser in ein beschriftetes klares 0,5-Unzen-Kunststoffkontrollgefäß abgeben. Achten Sie darauf, Blasen zur genauen Messung zu entfernen. Verwenden Sie anschließend eine separate Spritze und geben Sie 10 Milliliter der Testprobe in ein klares 0,5-Unzen-Kunststofftestgefäß ab. Entfernen Sie anschließend zwei Fläschchen mit pulverförmigem Medium. Öffnen Sie eines der Fläschchen mit pulverförmigem Medium und geben Sie den gesamten Inhalt eines Fläschchens in das Gefäß mit dem Kontrollwasser, wobei Sie auch das gesamte leere Fläschchen in die Lösung fallen lassen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem Testgefäß.Dann verschließen und schütteln Sie die Gläser, um sicherzustellen, dass das Pulver vollständig gelöst ist. Füllen Sie die blaue 10-Milliliter-Spritze mit neun Millilitern der Kontrolllösung und die rote 10-Milliliter-Spritze mit neun Millilitern der Testlösung aus den jeweiligen Fläschchen.Entfernen Sie eventuell vorhandene Luftblasen aus den Spritzen. Entfernen Sie anschließend die Stopfen von den Biochip-Anschlüssen und befestigen Sie den Abfluss. Platzieren Sie den Biochip in das entnehmbare Kunststofffach im ECIS-Lesegerät, schließen Sie den Deckel und befestigen Sie danach die gefüllten Spritzen an den äußeren Biochip-Anschlüssen.Schließlich befestigen Sie die Spritzenstößel. Wählen Sie auf dem Hauptbildschirm des Lesegeräts „Weiter“, um den Vortest zu starten. Die Software überprüft anschließend die Anfangsimpedanzen.Wenn die Impedanzen im Bereich liegen, zeigt der Bildschirm „Kartusche bestanden“ an und weist den Benutzer an, „Weiter“ auszuwählen. Geben Sie dann die Probendaten über eine Bildschirmtastatur ein und wählen Sie anschließend „Akzeptieren“, wenn Sie fertig sind. An diesem Punkt werden zwei Minuten lang Impedanzdaten vom eingesetzten Biochip erfasst, und eine Countdown-Uhr auf dem Bildschirm zeigt die verbleibende Zeit an.Nach zwei Minuten auf „Weiter“ klicken. Wenn eine blinkende grüne Box zur Aufforderung „Proben jetzt injizieren“ erscheint, die Kontroll- und Testmedien aus den angebrachten Spritzen gleichzeitig in die Biochip-Kanäle injizieren. Nach Beendigung die Spritzen an den Biochips angebracht belassen.Wenn die ECIS-Lesersoftware ermittelt, dass der Behandlungs-Kanal zu irgendeinem Zeitpunkt während des Tests statistisch signifikant vom Kontrollkanal abweicht, zeigt die Bildschirmanzeige an, dass die Probe verunreinigt ist. Andernfalls wird am Ende der Überwachungsphase angezeigt, dass keine Verunreinigung festgestellt wurde. Notieren Sie die Testergebnisse für jede Probe als „Verunreinigt“ oder „Nicht verunreinigt“.Entfernen und entsorgen Sie am Ende des Testlaufs den Biochip. Spülen Sie die Spritzen, die Probengefäße und das entnehmbare Kunststofffach, in dem der Biochip während der Tests untergebracht war, aus und lassen Sie sie an der Luft trocknen. 13 hier gezeigte Chemikalien wurden als Vertreter eines breiten Spektrums toxischer Industrieverbindungen ausgewählt, die mögliche Kontaminanten von Trinkwasser darstellen könnten.Während der Tests wurden neun der 13 Proben innerhalb einer Stunde mittels elektrischer Zell-Substrat-Impedanzsensorik erkannt, und zwar bei Konzentrationen, die für die menschliche Gesundheit relevant sind. Typische Ergebnisse, wie sie nach einem Test mittels elektrischer Zell-Substrat-Impedanzsensorik beobachtet werden, sind hier dargestellt. Verunreinigte Proben weisen im Vergleich zu den Kontrollproben aus sauberem Wasser deutlich niedrigere Impedanzwerte auf.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Biochip mit einer Monoschicht aus Regenbogenforellengillenepithelzellen herstellt und anschließend diesen Biochip in einem impedanzbasierten Toxizitätstest zur Bewertung der Toxizität von Trinkwasser verwendet. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, aseptisch zu arbeiten, wenn die Biochips vorbereitet werden, und die Biochips bis zur Verwendung gekühlt aufzubewahren. Jeder Biochip kann nur einmal verwendet und danach entsorgt werden müssen.Wenn die Herstellung der Biochips einmal beherrscht ist, kann sie in etwa 10 Minuten durchgeführt werden. Dies ist eine Schätzung, da die Chips in Chargen hergestellt werden. Die Impedanzmessung der Probe, einschließlich der Probenvorbereitung, dauert etwa eine Stunde und 10 Minuten, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.Nach Durchführung dieses Verfahrens können an einer Probe, die ein verunreinigtes Ergebnis lieferte, weitere Methoden wie die analytische Chemie angewendet werden, um die vermutete(n) chemische(n) Substanz(en) zu identifizieren. Die Entwicklung dieser Technik eröffnet Forschern, die sich für die Detektion von Wassergiftigkeit interessieren, den Weg, Technologien mit Regenbogenforellengallenschleimhautzellen und Impedanzmessung zu nutzen. Wir hoffen, dass Sie die Techniken als nützlich erachten, und freuen uns auf zukünftige Innovationen, die durch diese neuen Möglichkeiten möglicherweise ermöglicht werden.Vielen Dank und einen schönen Tag.

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In diesem Video demonstrieren wir den Prozess der Echtzeitüberwachung zellulärer Ereignisse, einschließlich der Proliferation adhärenter Zellen, über einen zellulären Impedanzassay. Dabei wirken die adhärenten Zellen als Isolatoren, die den Stromfluss zwischen den Elektroden begrenzen und die Impedanz erhöhen.

Zelluläre impedanzbasierte Analyse zur Überwachung zellulärer Prozesse in Echtzeit

In diesem Artikel präsentieren wir ein Mikrofluidik-Chip für Einzelzellanalyse. Es ermöglicht die Quantifizierung der intrazellulären Proteine, Enzyme, Cofaktoren und zweiten Boten mittels Fluoreszenzassays oder Immunoassays.

Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

Ein Protokoll zum Screening auf endokrine Aktivität in organischen Extrakten von Wasserproben, einschließlich aufbereitetem Abwasser und Oberflächenwasser (aufnehmendem Wasser), wurde unter Verwendung kommerziell erhältlicher in vitro Transaktivierungs-Bioassays angepasst.

Screening für Endokrine Aktivität in Wasser unter Verwendung von handelsüblichen<em&gt; In Vitro</em&gt; Trans Biotests

Eine mikrofluidischen Biosensor-Plattform wurde entworfen und hergestellt mit kostengünstigen trocken Photoresist Filmtechnik für die rasche und sensible Quantifizierung der verschiedenen Analyten. Diese Einweg-System ermöglicht das elektrochemische Auslesen der Enzym-linked-Assays auf den Chip immobilisiert mittels der Stop-Flow-Technik.

Trockenen Film Photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen Biosensor Plattform: Gerät Fertigung, On-Chip-Test Vorbereitung und Systembetrieb

Dieses Protokoll beschreibt eine allgemeine Strategie zur kommerziellen angeordneten gold Mikroelektroden ausgestattet für ein Label-freie Zelle Analyzer zur Einsparung auf die hohen laufenden Kosten Ofmicrochip basierende Assays zu regenerieren. Der Regenerationsprozess enthält Trypsin-Verdauung, Spülen mit Wasser, Ethanol und eine Spinnerei Schritt, der wiederholte Verwendung von Mikrochips ermöglicht.

Regeneration der angeordneten Gold Mikroelektroden ausgestattet für eine Echtzeit-Zelle-Analyzer

Diese Publikation beschreibt die Herstellung von einer Orgel-on-Chip-Gerät mit integrierten Elektroden für die direkte Quantifizierung der Transendothelial elektrischen Widerstand (TEER). Für die Validierung die Blut - Hirn-Schranke wurde innerhalb dieses Gerät mikrofluidischen nachgeahmt und seiner Barrierefunktion wurde überwacht. Die vorgestellten Methoden zur Elektrode Integration und direkte Quantifizierung der TEER sind allgemein anwendbar.

Herstellung und Validierung von einer Orgel-on-Chip-System mit integrierten Elektroden, direkt Transendothelial elektrischen Widerstand zu quantifizieren

Elektrowetting-basierte digitale Mikrofluidic ist eine Technik, die eine spannungsgetriebene Änderung des scheinbaren Kontaktwinkels eines Mikroliter-Volumentröpfchens nutzt, um seine Manipulation zu erleichtern. Die Kombination mit funktionalisierten Magnetperlen ermöglicht die Integration mehrerer Laboreinheiten zur Probenvorbereitung und Identifizierung von Krankheitserregern mittels Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Elektrowetting-basierte Digital Microfluidics Plattform für automatisierte enzymgebundene Immunsorbent Assay

Wir präsentieren ein mikrofluidisches System für Hochdurchsatzstudien an komplexen Lebensmaschinen, das aus 1500 Kultureinheiten, einer Reihe verbesserter Peristaltikpumpen und einem Mischmodul vor Ort besteht. Der mikrofluidische Chip ermöglicht die Analyse der hochkomplexen und dynamischen Mikro-Umgebungsbedingungen in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Wir beschreiben einen Ansatz zum Nachweis und zur Erfassung invasiver Zellsubpopulationen in Echtzeit. Das experimentelle Design verwendet die Echtzeit-Zellanalyse, indem Änderungen in der elektrischen Impedanz von Zellen überwacht werden. Invasive Krebs-, Immun-, Endothel- oder Stromazellen in komplexen Geweben können eingefangen und die Auswirkungen von Kokulturen beurteilt werden.

Echtzeit-Detektion und Erfassung invasiver Zellsubpopulationen aus Co-Kulturen

Die folgende Studie evaluiert das toxikologische Profil eines ausgewählten metallorganischen Gerüsts unter Verwendung der elektrischen Zellsubstrat-Impedanzmessung (ECIS), einer Echtzeit-Hochdurchsatz-Screening-Technik.

Elektrische Zell-Substrat-Sensorik zur Echtzeit-Bewertung von toxikologischen Profilen metallorganischer Gerüstverbindungen

Unser detailliertes Protokoll beschreibt die Erstellung und Verwendung des fortschrittlichen Darm-on-Chip-Modells, das die menschliche Darmschleimhaut mit 3D-Strukturen und verschiedenen Zelltypen simuliert und eine eingehende Analyse von Immunantworten und zellulären Funktionen als Reaktion auf mikrobielle Besiedlung ermöglicht.

Immunkompetentes Darm-on-Chip-Modell zur Analyse der Immunantworten der Darmschleimhaut

Erfahren Sie die Herstellung impedanzbasierter Fluidic-Biochips mit RTgill-W1-Zellen zur schnellen Trinkwassertoxizitätsprüfung. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Feldmessungen für Umweltmonitoring.

Herstellung und Prüfung von impedanzbasierten Fluidic Biochips mit RTgill-W1 Zellen für die schnelle Auswertung von Trinkwasserproben für Toxizität (Video) | JoVE Journal

Herstellung und Prüfung von impedanzbasierten Fluidic Biochips mit RTgill-W1 Zellen für die schnelle Auswertung von Trinkwasserproben für Toxizität

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