Ein menschliches Glioblastom Organotypisches Scheibenkulturmodell zur Untersuchung der Tumorzellmigration und patientenspezifischen Wirkungen von antiinvasiven Arzneimitteln

Aktuelle Ex-vivo- Modelle von Glioblastom (GBM) sind nicht für eine physiologisch relevante Untersuchung der menschlichen Tumorinvasion optimiert. Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung und Pflege von organotypischen Scheibenkulturen aus frischem menschlichem GBM-Gewebe vor. Es wird eine Beschreibung der Zeitraffer-Mikroskopie und der quantitativen Zellmigrationsanalyse-Techniken gegeben.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, invasives Migrationsverhalten in primären humanen Glioblastomzellen zu beobachten und zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neuroonkologie zu beantworten, wie z.B. welche phänotypischen und molekularen Eigenschaften den patientenspezifischen Unterschieden im Krankheitsverlauf und im Therapieansprechen zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die direkte Manipulation von Primärzellen ermöglicht und gleichzeitig die in vivo Gewebearchitektur und die zelluläre Heterogenität des Glioblastoms bewahrt

Beginnen Sie damit, leere PTFE-Kultureinsätze mit einer sterilen Pinzette in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte zu platzieren, die einen Milliliter Scheibenkulturerhaltungsmedium pro Vertiefung enthält. Wenn alle Einsätze hinzugefügt wurden, legen Sie die Platte in einen befeuchteten, wasserummantelten Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Legen Sie anschließend die Tumorgewebestücke in eine Petrischale mit eiskaltem Verarbeitungsmedium und waschen Sie das Gewebe mit einer Pipette dreimal vorsichtig mit frischem Medium, um anhaftende rote Blutkörperchen zu entfernen.

Schneiden Sie nach der dritten Wäsche die Tumorstücke mit dem Skalpell in etwa drei mal drei mal 10 Millimeter große Streifen, entfernen Sie vorsichtig alle anhaftenden Gefäße und vermeiden Sie nekrotisches oder kauterisiertes Gewebe. Wenn das gesamte Gewebe abgeschnitten ist, geben Sie fünf bis sieben Millimeter 37 Grad Celsius flüssige Agarose in eine zwei Kubikzentimeter große Kunststoffeinbettungsform und kühlen Sie die Agarose eine Minute lang auf einem Eisbett. Legen Sie zwei bis vier Gewebestreifen mit der Längsachse vertikal in die Agarose und lassen Sie das Gewebe nach dem Platzieren weitere zwei bis fünf Minuten auf Eis.

Wenn die Agarose fest geworden ist, schneide mit einem Skalpell die Seiten der Form ab, um die Agarose vorsichtig aus der Form zu entfernen. Und verwenden Sie einen großzügigen Tropfen Cyanacrylatkleber, um den Agaroseblock auf einer Vibratomus-Probenplatte zu befestigen. Wenn der Kleber ausgehärtet ist, tauchen Sie den Agaroseblock in eiskaltes Verarbeitungsmedium und sprudeln Sie mit einer getrimmten sterilen Kunststoffpipette ein Gemisch von 5 % CO2 und 95 % O2 in das Medium im Vibratom-Reservoir.

Stellen Sie die Dicke der Vibratomscheibe auf 300 bis 350 Mikrometer ein und passen Sie die Klingenvorschubgeschwindigkeit und die Klingenamplitude entsprechend der Gewebekonsistenz und den Vibrationsspezifikationen an. Erhalten Sie die entsprechende Anzahl von Scheiben entsprechend der geplanten experimentellen Analyse, indem Sie die Scheiben mit einem Mikrospatel aus Edelstahl in eine Petrischale mit eiskaltem Verarbeitungsmedium überführen, sobald sie aufgenommen werden. Wenn alle Scheiben aufgenommen wurden, übertragen Sie mit dem Mikrospatel jede Scheibe auf einen einzelnen PTFE-Einsatz.

Nach einer 12- bis 24-stündigen Inkubation äquilibrieren Sie eine neue Sechs-Well-Platte mit frischem Scheibenkulturerhaltungsmedium für 15 Minuten im Zellkultur-Inkubator. Fassen Sie dann mit einer sterilen Pinzette jeden Einsatz am Rand und übertragen Sie die Einsätze in einzelne Vertiefungen der neuen Sechs-Well-Platte. Geben Sie zwischen sieben und 10 Tagen Kultur vorsichtig fünf bis 10 Mikroliter GFP-exprimierendes Retrovirus tropfenweise auf die Oberfläche jeder Gewebescheibe und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator.

Wenn das Signal offensichtlich ist, äquilibrieren Sie einen Milliliter frisches Scheibenmedium in einer Schale mit Glasboden und übertragen Sie die Einsätze mit einer sterilen Pinzette in die Schale. Stellen Sie die Schale in einen 37 Grad heißen, mit 5 % CO2 versiegelten Mikroskoptisch-Inkubator eines konfokalen Mikroskops. Verwenden Sie ein 10-fach-Luftobjektiv mit großem Arbeitsabstand in Verbindung mit Einzel- oder Multiphotonen-Bildgebung, um dreidimensionale, zeitaufgelöste Bilder der Zellmigration aufzunehmen.

Visualisieren Sie die Schicht mit dem Mikroskop und lokalisieren Sie ein geeignetes Feld mit einer ausreichenden Dichte an fluoreszenzmarkierten Tumorzellen zwischen dem Schnittrand und der Mitte des Gewebes. Stellen Sie dann im mehrdimensionalen Analysemodus der Bildgebungssoftware die Mitte des Z-Stapels so ein, dass alle abzubildenden Positionen ein sichtbares fluoreszierendes zelluläres Signal enthalten, und stellen Sie eine angemessene Zeit für jede Z-Stapel-Aufnahme ein. Öffnen Sie zunächst eine Z-Stapel-Datei in ImageJ und wählen Sie Bild, Stapel und Z-Projekt aus.

Wählen Sie den ersten und letzten Zeitrahmen des Z-Stapels für die Analyse aus, und wählen Sie Max Intensity als Projektionstyp aus, um eine Projektion mit maximaler Intensität oder MIP-Rendering zu generieren. Um MIPs für jeden Zeitpunkt in der Reihe gleichzeitig zu generieren, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Alle Zeitrahmen. Erstellen Sie ein MIP aus jedem Satz von Z-Stapel-Images, die in jeder abgebildeten Region erfasst wurden.

Öffnen Sie MTrackJ aus dem Menü Plugins und klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen. Um den Zellkörperschwerpunkt in der interessierenden Tumorzelle manuell zu identifizieren, klicken Sie auf den visuell angenäherten Mittelpunkt der Zelle. Markieren Sie die Position des Zellkörpers in jedem Zeitrahmen der Bildreihe, um eine eindeutige Spur für jede Zelle zu erstellen und die Zellkörperpositionen der nächsten Zelle nacheinander zu markieren.

Sobald eine Zellpopulation in einer bestimmten Tumormikroregion verfolgt wurde, verwenden Sie die Messfunktion, um alle Koordinaten der Zellspur zu exportieren und die Dateien im xls-Format für eine spätere Analyse zu speichern. Verwenden Sie schließlich die Koordinaten, die für jeden Punkt entlang der Migrationsbahn einer Zelle aufgezeichnet wurden, um quantitative Analysen der Tumorinvasion durchzuführen. Organotypische Glioblastomschnitte zeigen eine Übereinstimmung mit dem ursprünglichen Tumorgewebe in der gesamten Kultur, einschließlich der Aufrechterhaltung von Pseudopalisadennekrosen und Mikroglia für bis zu 15 Tage.

Unter hypoxischen Bedingungen zeigen die Scheiben eine schnelle physiologische Reaktion und induzieren die Freisetzung des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors in das Medium, ein Prozess, der in vivo in der Mikroumgebung des Glioblastoms häufig vorkommt. Die quantitative Messung von GFP-exprimierenden Tumorzellen im Zeitraffer ermöglicht die Berechnung der Migrationsgeschwindigkeit und der Richtungsabhängigkeit der Glioblastomzellen über Tumorregionen in Proben. Die Verfolgung der Migration von vermischten, aber morphologisch unterschiedlichen beweglichen Tumorzellen in Mikroglia innerhalb einer Schnittkultur zeigt zelltypspezifische Bewegungsmuster.

Die Abbildung der Schnittregionen etwa alle 10 Minuten bietet auch eine angemessene zeitliche Auflösung für die Aufnahme von Zeitrafferbildern der Tumorzellen, die sich während der Zellteilung befinden. Hier ist zum Beispiel ein Paar sich teilender Zellen, die gefangen wurden, als sie die Migration pausierten, die Mitose abschlossen und die Migration in ihren Tochterzellen ohne Verzögerung wieder einleiteten, und das alles innerhalb eines Zeitrahmens von drei Stunden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 90 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.