Bewertung der Planar-Cell-Polarity Phänotypen in Ziliopathie Maus-Mutanten-Cochlea

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die ziliär mutierte Cochlea von Mäusen auf Phänotypen mit planarer Zellpolarität zu untersuchen. Diese Techniken ermöglichen eine umfassende Detaillierung des Cochlea-Phänotyps, was zu einem genaueren Verständnis der ziliären Beteiligung an der Etablierung des PCP-Signalwegs bei Wirbeltieren führen wird. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass die präparierten Cochlea-Epithelien nach der Beherrschung für eine Vielzahl verschiedener Arten von phänotypischen Analysen verwendet werden können.

Nach der Präparation von Reagenzien und Gewebe von Versuchstieren im Entwicklungsstadium E16.5 bis p3 wird der Kopf mit einer Skalpellklinge oder einer kleinen Schere entlang der sagittalen Mittellinie, beginnend an der Nase und bis zum Keimblatt, präpariert. Entferne das Gehirn mit einer Pinzette aus jeder Schädelhälfte. Identifiziere dann die Schläfenknochen, die die sich entwickelnden knöchernen Labyrinthe des Innenohrs enthalten.

Während Sie mit der Probe unter einem Seziermikroskop arbeiten, verwenden Sie eine Pinzette, um die knöchernen Labyrinthe vom Schädel weg zu halten, indem Sie die Pinzette vorsichtig unter die knöchernen Labyrinthe führen. Verwenden Sie nach der Dissektion die Spitze der Präparierzange, um die ovalen und runden Fenster zu befreien und ein kleines Loch in die Spitze der Cochlea-Spirale zu bohren. Befestigen Sie anschließend die knöchernen Labyrinthe fünf Minuten lang in 1,5 Millilitern 4%igem Paraformaldehyd auf Eis, um eine einfache Entfernung der Tektorialmembran zu ermöglichen.

Legen Sie nun die knöchernen Labyrinthe in eine schwarze, mit Silikonelastomer beschichtete Präparierschale, die PBS enthält, um die Dissektion zu erleichtern. Verwenden Sie eine Pinzette Nummer fünf, um den äußeren Knorpel zu entfernen und den Cochlea-Gang freizulegen. Beginnen Sie am ovalen Fenster, führen Sie die untere Spitze der Pinzette in das ovale Fenster ein und hebeln Sie den Knorpel vorsichtig auf, indem Sie sich langsam nach oben in Richtung Spitze bewegen.

Drücken Sie dann mit einer feinen Pinzette die Reissner-Membran an der Basis des Cochlea-Gangs ein und ziehen Sie sie in einer Aufwärtsbewegung ab. Visualisieren Sie den dorsalen Aspekt des Cochlea-Gangs, einschließlich des sensorischen Epithels. Drücken Sie dann mit der Pinzette Nummer 55 die Tektorialmembran an der Basis der Cochlea ein und schälen Sie sie nach oben in Richtung Spitze.

vollständige Entfernung der Tektorialmembran ist erforderlich, um die besten Bilder mit Immunhistochemie zu erhalten, und ist für die Rasterelektronenmikroskopie unerlässlich. Nachdem Sie das Corti-Organ freigelegt haben, fixieren Sie das Gewebe weiter und führen Sie Immunhistochemie durch oder bereiten Sie sich auf die Rasterelektronenmikroskopie vor, wie im schriftlichen Teil des Protokolls beschrieben. Nachdem das Gewebe gefärbt wurde, legen Sie die Probe in eine schwarze Silikonelastomerschale, die PBS enthält.

Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette die vestibuläre Region aus der Cochlea-Spirale. Entfernen Sie dann sehr vorsichtig den darunter liegenden Knorpel und das Mesenchym aus der Cochlea-Spirale. Die verbleibende Cochlea-Spirale enthält den inneren Sulcus, das Corti-Organ und den äußeren Sulcus.

Übertragen Sie die Cochlea-Spirale in einen Tropfen PBS, der auf einen Objektträger gegeben wird. Leiten Sie das PBS mit einem saugfähigen Taschentuch oder einem Stück Filterpapier ab und positionieren Sie die Cochlea-Spirale vorsichtig neu, wenn sich die Epithelien verschoben haben und sich mit sich selbst überlappen. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium direkt auf die Cochlea-Probe und legen Sie vorsichtig ein Deckglas direkt auf die Probe, wobei Sie darauf achten, dass keine Luftblasen entstehen.

Verwenden Sie ein konfokales Epifluoreszenz- oder Laserscanning-Mikroskop, das mit Objektiven mit hoher Vergrößerung und hoher numerischer Apertur ausgestattet ist, um Bilder der apikalen Oberfläche der Cochlea-Haarzelle aufzunehmen. Verwenden Sie niedrigere Objektive, um überlappende Bilder der Cochlea-Spirale aufzunehmen und so die Länge des Cochlea-Ductus zu quantifizieren. Die folgenden Bilder zeigen die Immunfluoreszenzfärbung der Cochlea vom Basalturn-Typ nach der Geburt.

Phalloidin markiert filamentöses Aktin bei Stereozilien und kortikales Aktin an der Zellperipherie. Myosin VIIA ist ein Marker für innere und äußere Haarzellen. ZO_1 markiert die Tight Junctions zwischen den Zellen, was es zu einem großartigen Marker zur Unterscheidung von Zellgrenzen macht.

Acetyliertes Alpha-Tubulin wird als Marker für das Kinocilium am Scheitelpunkt des Bündels verwendet, wie durch den weißen Pfeil angezeigt. Interne Mikrotubuli sind auch durch acetyliertes Alpha-Tubulin gekennzeichnet, das besonders häufig in Säulenzellen vorkommt, wie durch die weißen Sternchen gekennzeichnet. Dieses Bild von präparierten Cochlea-Gängen bei E18.5, gefärbt mit acetyliertem Tubulin, zeigt eine deutliche Verkürzung der IFT20-bedingten Knockout-Cochlea-Gänge im Vergleich zur Kontrolle.

Das folgende Bild zeigt eine Ganzpräparation der basalen Cochlea-Drehung bei einer BBS8-Knockout-Maus am postnatalen Tag Null. Stereoziliäre Bündel in BBS8-Knockout-Cochleae sind variabel rotiert, wie durch den rechten Pfeil angezeigt, oder abgeflacht und falsch lokalisiert, wie durch den mittleren Pfeil angezeigt. Die Kinozilien sind falsch lokalisiert oder es fehlen Axoneme, wie der linke Pfeil zeigt.

Bei der Vorbereitung des Cochlea-Phänotyps für die Analyse ist es wichtig, daran zu denken, dass Unterschiede im genetischen Hintergrund den Cochlea-Phänotyp verändern können. Daher ist es wichtig, Wurfgeschwisterkontrollen für die Analyse zu verwenden. Weitere Analysen umfassen die audiometrische Untersuchung und Kultivierung von Cochlea-Explantaten, die eine Behandlung mit verschiedenen Signalaktivatoren oder -inhibitoren ermöglicht und damit zum mechanistischen Verständnis der beteiligten Entwicklungsprozesse beiträgt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Cochlea-Gewebe für die Analyse der Rolle der Ziliarkomponenten und ihrer unterschiedlichen Auswirkungen auf die PCP-Signalübertragung vorbereiten können.