Name: Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Lernen Sie die Präparation der erwachsenen Maus-Cochlea als drei intakte Wendungen mit Immunfärbung und konfokaler Mikroskopie. Diese Methode bewahrt die dreidimensionale Struktur des Corti-Organs und ermöglicht die Visualisierung von Haarzellen und Stützzellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Zuschuss des Office of Naval Research (N000141310569) unterstützt. Die Ausrüstung der Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility wurde vom National Center for Research Resources-Health (S10RR027716) unterstützt.

Ethics Statement: Verfahren, die Tier Themen wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Southern Illinois University School of Medicine genehmigt. 1. Extraktion der Schläfenbeine <ol><li> Identifizieren Schläfenbeine in der Unterseite der Maus Schädel 13 und abkratzen die Hirnnerven mit Standardmuster Pinzette. </li><li> Zeigen Standardmuster einer Pinzette an der Spitze der Ohrkapsel und mit dem Daumen der anderen Hand drücken Sie auf den hinteren Bogengangs, um den gekapselten Cochlea zu entfernen. </li><li> Befreien Sie die untere Hälfte des Schläfenbeins aus dem Schädel von Hand mit dem Daumen und Zeigefinger oder mit Hilfe 10.5 cm feinen Schere. </li></ol> 2. Post-fix Schläfenbeine <ol><li> Platzieren temporale in 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die 250 bis 500 &amp; mgr; l 4% Paraformaldehyd (PFA) in 10 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4 und Incubaß bei RT für 2 - 20 h. HINWEIS: Keine Öffnung der apikalen Kappe oder Injektion von PFA in die runden oder ovalen Fenster benötigt wird. Empfehlen die Verwendung von Methanol-freien, hochreine, Elektronenmikroskopie (EM) grade PFA, das bei einer 16% igen Konzentration in Glasfläschchen erworben werden kann. Sobald eine Ampulle geöffnet und 1: 4 verdünnt in PBS, so dass eine 4% ige Lösung, kann es bis zu 2 Wochen verwendet werden, wenn bei 4 o C gelagert (Einige Antikörper erfordern kurze Fixierung und andere können tolerieren O / N (O / N) Fixierung). </li></ol> 3. entkalken Schläfenbeine <ol><li> Nach der Fixierung zu entfernen PFA mit einer Pipette und ersetzen mit 120 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), etwas mehr als 2 ml. Stellen Sie sicher, die gesamte 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu verhindern, dass Luftblasen, wenn das Rohr geschlossen zu füllen. <ol><li> Wenn sie nicht sofort die Entkalkung, ersetzen PFA mit 10 mM PBS, pH 7,4, und Proben bei 4 o C HINWEIS: Nach der Fixierung kann Schläfenbeine für variab gespeichert werdenle beträgt der Zeit, bis der Entkalkung in Abhängigkeit von der Antigene untersucht. </li></ol></li><li> Die Röhrchen auf End-Over-End-Rotator und rotieren mit 4 Umdrehungen pro Minute bei RT. Ändern EDTA-Lösung täglich mit einer Pipette. Länge der Entkalkung ist abhängig vom Alter der Probe und der Präferenz des Wissenschaftlers dabei die Dissektion. <ol><li> Inkubieren Schläfenbeine in EDTA mit den folgenden Leitlinien für die Inkubationszeiten: Für Proben postnatalen Tag (P) von 8 bis P15: 2-4 h; Für Proben, P15 bis P21: O / N; Für Proben, P21 bis P30: 2 O / N; Für Proben, die älter als P30: 3 oder mehr O / N. HINWEIS: Entkalkung Zeiten können sich Nutzer Vorlieben und erweitert, wie gebraucht werden. Entkalkungszeit kann durch zweimaliges Ändern der EDTA-Lösung am Tag, etwa 8 Stunden auseinander reduziert werden. Einige Labors hinzufügen 1% PFA in die EDTA-Lösung, wenn die Entkalkung länger als 3 Tage, um eine Kontamination zu verhindern. </li></ol></li><li> Um festzustellen, ob die Probe ausreichend entkalkt, legen Schläfenbeine ona Silikonelastomer-beschichtet Dissektion Schüssel und drücken Sie vorsichtig Pinzette auf die schneckenförmige Cochlea. Wenn das Gewebe spongey ist, dann ist die Entkalkung komplett. </li><li> Sobald Entkalkung beendet ist, entfernen EDTA mit einer Pipette und fügen 500 -1000 ul 10 mM PBS pH-Wert 7,4. Proben bei 4 ° C bis bereit zu sezieren. </li></ol> 4. Erstellen Sie Silikon-Kautschuk beschichtet Dissection Dish <ol><li> Kombinieren Sie die Basis und Härter aus einem Silikonelastomer Einkapselungsmaterial Kit nach den Anweisungen des Herstellers und gründlich mischen. </li><li> In ca. 2 - 3 Esslöffel Pulver-Aktivkohle, bis die Lösung schwarz und gut mischen. HINWEIS: Flüssigtinte oder Flüssigkohle wird nicht mit der Lösung zu mischen, und kann nicht verwendet werden. Siliconelastomer-Einkapselung Kits können in Schwarz erworben werden, so dass Schritt 4.2 entfallen. </li><li> Füllen Sie die Lösung in 60 mm Glas oder Kunststoff-Petrischalen, Füllung reicht zur Beschichtung der Unterseite. Wenn bubbles vorhanden sind, Blätterteig mit Luft auf der Oberfläche. Lassen Sie stehen mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur eingestellt. HINWEIS: Silikon-Elastomer-beschichteten Schalen kann immer wieder für Jahre verwendet werden. Aber nicht mit Ethanol zur Reinigung, da sonst das Siliconelastomer zu knacken. </li></ol> 5. Ganze Berge Dissektion der Cochlea (für P7 und Ältere Proben) <ol><li> Trennen Sie die Basalwindung von Mitte / apikalen Windungen <ol><li> Legen Sie eine entkalkt Schläfenbein in einem Silikonelastomer-beschichtet Dissektion Teller füllte zwei Drittel mit 10 mM PBS, pH 7,4, und verwenden Sie ein Stereo-Dissektionsmikroskop für die folgenden Schritte. </li><li> Halten Sie das Schläfenbein im vestibulären Bereich mit # 4 oder # 5 Pinzette gerade Juwelier- und mit 5 mm Vannas-Tübingen Frühjahr Schere, schneiden Sie überschüssiges Ohrkapsel Gewebe an den Seiten und über der Spitze. </li><li> Verwendung von 2,5 mm Vannas Federschere, legen Sie ein Blatt in das ovale Fenster und stellen Sie mehrere kleine Schnitte entlang der Spiralligament / SeitenWand der basalen Windung. </li><li> Unter Verwendung von 5 mm Vannas-Tübingen-Federschere, legen Sie ein Blatt in die Region nur schneiden und legen Sie die andere Klinge auf der Außenseite des Schläfenbeins, medial der ovalen Fenster. Dieser Schnitt trennt den Basalwindung von mittleren und apikalen Windungen. </li></ol></li><li> Komplette Dissektion der basalen Windung. <ol><li> Verwendung von 2,5 mm Vannas Frühjahr Schere, schnitt die Spiralgangliennervenfasern, die zu der Modiolus zu verbinden, um die Spannung in der basalen Windung freigeben und unter dem Basalwindung geschnitten, um vom Gleichgewichtsorgan zu trennen. </li><li> Verwendung von 2,5 mm Vannas Federschere, stellen eine Reihe von kleinen Schnitten, um das Ligamentum spirale / Seitenwand von oben und unten Corti-Organ zu entfernen. Verwenden Sie # 4 oder # 5 Pinzette gerade Juwelier, um das Gewebe zu führen. Pin die Spiralgangliennervenfasern zu dem Silikonelastomer beschichtet Dissektion Gericht, aber nicht auf diesen Bereich zu halten, wenn das Gewebe zu zerreißen. </li><li> Während der vorhergehenden Schritte, einige der Reissner membrane werden oft entfernt werden. Wenn einer nach wie vor, fassen Sie die Reissner-Membran mit einer Pinzette # 4 oder # 5 gerade Juwelier- und ziehen weg von Corti-Organ. HINWEIS: Die Deckmembran ist selten sichtbar und in der Regel schwimmt weg, ohne einen bestimmten Schritt zur Entfernung erfordern. </li><li> Schließlich machen mehrere Schnitte, um die Dicke der Spiralganglien Axone zu reduzieren, um die wiederum so flach wie möglich herzustellen und zu verwenden # 4 oder # 5 Pinzette gerade Juwelier, um die seziert Basalwindung zu übertragen, durch Ergreifen Sie die verbleibenden Axone des Spiralganglions, um eine 48-Well-Platte (oder Kammerobjektträger), die ~ 500 ul 10 mM PBS pH-Wert 7,4. </li></ol></li><li> Separate mittleren und apikalen Windungen <ol><li> Die restlichen zwei Drittel der Cochlea, apikalen Seite nach unten. </li><li> Verwendung von 2,5 mm Vannas Federschere, legen Sie ein Blatt in die Scala media, wo die Mitte wiederum verwendet, um die basalen Windung verbunden werden, und stellen Sie mehrere kleine Schnitte entlang der Spiralligament / Seitenwand the mittleren Reihe. </li><li> Unter Verwendung von 5 mm Vannas-Tübingen-Federschere, legen Sie ein Blatt in der Region nur mit der Mitte wiederum auf der Oberseite des Blattes platziert geschnitten, und legen Sie die andere Klinge auf die außerhalb des knöchernen Labyrinth, in einem 90 o Winkel von der apikalen Spitze. Dies trennt den mittleren wiederum von der apikalen Umdrehung. </li></ol></li><li> Vollständige Präparation der Mitte wiederum in einer ähnlichen Weise zu der basalen Windung (siehe Schritte 5.2.2 bis 5.2.4). </li><li> Komplette Dissektion der apikalen Umdrehung. <ol><li> Verwendung von 2,5 mm Vannas Federschere, öffnen Sie die Kappe, die den Scheitel wiederum deckt. Komplette Zerlegung in einer ähnlichen Weise zu der basalen Windung (siehe Schritte 5.2.2 bis 5.2.4). HINWEIS: Dissected cochleären Windungen in 10 mM PBS, pH 7,4, in einer 48-Well-Platte (oder Kammerobjektträger) bei 4 ° C über mehrere Wochen vor der Immunfärbung gelagert werden. Jedoch PBS verdampft und muss periodisch aufgefüllt werden und die Lagerung von mehr als 2 - 3 Wochen in bakteriellen oder pilzlichen Wachstums auf dem ErgebnisGewebe, das die Qualität des Bildes zu verringern kann. Wir empfehlen, die Langzeitlagerung von Proben als unzerSchläfenBeine. </li></ol></li></ol> 6. Immunfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörper <ol><li> Nach der Dissektion, speichern jede Cochlea wiederum in einer separaten Vertiefung in einer 48-Well-Platte (oder Kammerobjektträger), in ~ 500 ul 10 mM PBS, pH 7,4, eingetaucht. Für jeden der folgenden Schritte sollten die Windung der Cochlea in Flüssigkeit eingetaucht werden und nicht auf der Oberseite schwebend oder auf der Seite des Gut geklebt. HINWEIS: Beim Entfernen von Flüssigkeit aus jeder Vertiefung, ist es leicht, die Cochlea-Windungen verlieren oder saugen sie auf in der Pipettenspitze. Ändern Lösungen mit 200 ul Pipettenspitze mit einer Dissektion Umfang wird dazu beitragen, dies zu verhindern. </li><li> Mit einer Pipette entfernen PBS aus jeder Vertiefung und ersetzen mit ~ 200 bis 300 &amp; mgr; l pro Vertiefung blockiert / Permeabilisierung Lösung (1% Triton X-100, 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 10% normalem Ziegenserum (NGS) in 10 mM PBS verdünnt pH 7,4). Inkubieren Sie 1 Stunde bei RT auf einem 3D-Rotator. HINWEIS: Wenn ein primärer Antikörper verwendet wurde, bei einer Ziege Wirt gemacht, dann eine sekundäre anti-Ziegen-Antikörper benötigt werden und NGS sollten nicht für jeden der Schritte verwendet werden. Pferdenormalserum kann als Ersatz für NGS verwendet werden. </li><li> Entfernen Sie blockiert / Permeabilisierung Lösung mit einer Pipette und ersetzen mit ~ 100 ul pro Vertiefung von primären Antikörperlösung (0,1% Triton X-100, 1% BSA und 5% NGS in 10 mM PBS, pH 7,4, verdünnt). Der Verdünnungsfaktor für jeden primären Antikörper variiert. Inkubieren Sie O / N (mindestens 14 h) bei 4 ° C auf einem 3D-Rotator. HINWEIS: Wenn mehr als eine primäre Antikörper verwendet wird, können alle in der gleichen Lösung für die Inkubation kombiniert werden, so stellen Sie sicher, dass jeder primären Antikörper hat einen anderen Host. </li><li> Entfernen primären Antikörperlösung mit einer Pipette und führen 3 Waschungen mit 10 mM PBS, pH 7,4, bei ~ 500 ul pro Vertiefung. Jeder Wasch brütet mindestens 5 min bei RT auf einem 3D-Rotator. </li><li> Entfernen letzten PBS Wäsche mit einer Pipette und ersetzen mit ~ 100 ul pro Vertiefung von sekundären Antikörper-Lösung (0,1% Triton X-100, 1% BSA und 5% NGS in 10 mM PBS, pH 7,4, verdünnt). Der Verdünnungsfaktor für jedes fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpers ist in der Regel 1: 500 oder 1: 1000. Platzieren Sie 48-Well-Platte in einem schwarzen Kasten, um fluoreszenz schützen getaggt Sekundärantikörper von Licht. Inkubieren Sie 2 - 3 h bei RT auf einem 3D-Rotator. HINWEIS: Wenn mehr als ein sekundärer Antikörper ist erforderlich, können sie in die gleiche Lösung für die Inkubation kombiniert werden. Stellen Sie sicher, es gibt keine Möglichkeit der grenzüber Kennzeichnung (z. B. unter Verwendung von Ziege-Anti-Kaninchen und Huhn anti-Ziege Sekundärantikörper) </li><li> Entfernen sekundären Antikörper-Lösung mit einer Pipette und führen 3 Waschungen mit 10 mM PBS, pH 7,4, bei ~ 500 ul pro Vertiefung. Inkubieren jeder Wäsche für mindestens 5 min bei RT auf einem 3D-Rotator. Halten Sie 48-Well-Platte in einem schwarzen Kasten, um vor Licht zu schützen. </li><li> Entfernen letzten PBS waschen mit einer Pipette und ersetzen mit ~ 100 &amp; mgr; l pro Vertiefung Hoechst 33342 (verdünnt 1: 2000 in 10 mM PBS pH-Wert 7,4), um Kerne zu beschriften. Inkubieren 15-20 min bei RT auf einem 3D-Rotator. Halten Sie 48-Well-Platte in einem schwarzen Kasten, um vor Licht zu schützen. Inkubieren Sie nicht länger als 20 min. </li><li> Entfernen Hoechst-Lösung mit einer Pipette und führen 3 Waschungen mit 10 mM PBS, pH 7,4, bei ~ 500 ul pro Vertiefung. Inkubieren jeder Wäsche für mindestens 5 min bei RT auf einem 3D-Rotator. Halten Sie 48-Well-Platte in einem schwarzen Kasten, um vor Licht zu schützen. </li><li> Alle Schritte können bei Bedarf erweitert werden, mit der Ausnahme, Hoechst Inkubation von mehreren Stunden. Um die Reaktion zu jedem Zeitpunkt unterbrechen, nur tauchen Proben in ~ 500 ul 10 mM PBS, pH 7,4, und speichern Sie die 48 -well Platte (oder Kammerobjektträger) bei 4 ° C bis bereit, um die Protokoll-Stunden oder 1 wieder aufzunehmen - 2 Tage später . </li></ol> 7. Montieren Cochlear Schaltet Slides <ol><li> Etikettenträger mit einschlägigen Informationen über die Probe und Antikörper verwendet. </li><li> Pipette ~ 50 ul Eindeckmittel auf jeder Folie und darauf achten,um Blasen zu vermeiden. Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit den Befestigungsmittel, um alle Luftblasen zu entfernen. </li><li> Mit # 4 oder # 5 Pinzette gerade Juwelier, fassen die Axone des Spiralganglions, um sanft zu übertragen ein Cochlea wiederum von der 48-Well-Platte mit dem Schlitten und in die Montage Medien. Hängen Sie eine Cochlea wiederum pro Folie, um Belichtung und Photobleichen während des Abbildungsprozesses zu verhindern. </li><li> Verwenden Sie ein Stereo Dissektionsmikroskop um sicherzustellen, dass Cochlea wiederum nicht gefaltet, verdreht, oder in der Nähe einer Luftblase. Wenn eine dieser Bedingungen auftreten, Pinzetten Verwendung # 4 oder # 5 gerade Juwelier, um die Cochlea wiederum neu zu positionieren. </li><li> Platzieren Sie ein Ende eines Deckglas auf den Objektträger und sanft loslassen, um das Deckglas fallen lassen. </li><li> Verwenden Sie ein Stereo Dissektionsmikroskop, um sicherzustellen, dass die Cochlea wiederum nicht gefaltet, verdreht, oder in der Nähe einer Luftblase. Wenn eine dieser Bedingungen zutrifft, sanft bewegen das Deckglas hin und her, um die Cochlea wiederum neu zu positionieren. </li><li> Objektträgerin einer Dia-Ordner, so dass sie flach. Lassen Sie die Montage Medien Heilung O / N bei RT (halten in der Dunkelheit) </li><li> Seal Deckgläser mit klarem Nagellack und lagern bei RT oder -20 ° C bis abgebildet. Dias können in einer Diashow Ordners oder Dias Box gespeichert werden. HINWEIS: Die Objektträger können langfristig bei -20 ° C oder -80 ° C gelagert werden und die Fluoreszenz wird für mehrere Monate aufrechterhalten werden. </li><li> Bildobjektträger unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops mit der entsprechenden Wellenlänge auf der Basis der Sekundärantikörper in der Immunfärbung verwendet. Helligkeit und Kontrast können unter Verwendung der Imaging-Software durch die konfokale Anbieter bereitgestellt werden. </li></ol>

<ol><li>Robles, L., Ruggero, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanics of the mammalian cochlea.</a> Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).</li>
<li>Ehret, G., Frankenreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitattive+analysis+of+cochlear+structures+in+the+house+mouse+in+relation+to+mechanisms+of+acoustical+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing.</a> J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).</li>
<li>Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+damage+in+the+C57BL%2FCBA+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea.</a> Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).</li>
<li>Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEngstrom%2C+H+%22Structural+pattern+of+the+organ+of+Corti.+A+systematic+mapping+of+sensory+cells+and+neural+elements%22">Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements</a>. , Almqvist and Wiksell. (1966).</li>
<li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+Recordings+at+Afferent+Dendrites+Contacting+Cochlear+Inner+Hair+Cells%3A+Monitoring+Multivesicular+Release+at+a+Ribbon+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse.</a> J Vis Exp. (48), e2442(2011).</li>
<li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross%2C+cellular+and+subcellular+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li>
<li>Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBohne%2C+BA+%22Handbook+of+Mouse+Auditory+Research%22">Handbook of Mouse Auditory Research</a>. Willott, J. , CRC Press. 171-187 (2001).</li>
<li>Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. , Massachusetts Eye and Ear. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/">http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/</a> (2015).</li>
<li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+proliferation+of+postmitotic+cochlear+supporting+cells+by+acute+ablation+of+the+retinoblastoma+protein+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice.</a> J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).</li>
<li>Steigelman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystin-1+Is+Required+for+Stereocilia+Structure+But+Not+for+Mechanotransduction+in+Inner+Ear+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells.</a> J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+in+vivo+conversion+of+mouse+cochlear+pillar+and+Deiters%27+cells+to+immature+hair+cells+by+Atoh1+ectopic+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression.</a> J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), e1685(2010).</li>
<li>Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+half+the+hair+cells+in+the+mouse+utricle+first+appear+after+birth%2C+with+significant+numbers+originating+from+early+postnatal+mitotic+production+in+peripheral+and+striolar+growth+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).</li>
<li>Collado, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+postnatal+accumulation+of+junctional+E-cadherin+is+inversely+correlated+with+the+capacity+for+supporting+cells+to+convert+directly+into+sensory+hair+cells+in+mammalian+balance+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs.</a> J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).</li>
<li>Meyers, J. R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+change+controls+supporting+cell+proliferation+in+lesioned+mammalian+balance+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium.</a> J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).</li>
<li>Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase+dysregulation+in+the+stria+vascularis+of+mice+with+Alport+syndrome%3A+implications+for+capillary+basement+membrane+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology.</a> Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

<html> Es gibt mehrere wichtige Schritte für eine erfolgreiche ganze Berg Präparation und Immunfärbung. Jedoch, bevor Sie eine dieser Methoden durchgeführt werden, ist die richtige Fixierung der Cochlea Gewebe benötigt. Wir empfehlen die Verwendung von Methanol-freien, hochreine, EM Grade PFA. PFA von Pulver kann Spuren von Methanol und einem instabilen pH-Wert, die Qualität der Immunfluoreszenz abnimmt. Andere Gruppen haben gezeigt, dass ähnliche Sektionen sind mit Hilfe Fixiermittel die Formaldehyd 14-16 ent...

Die spiralförmige Cochlea des Innenohres, innerhalb des Schläfenbeins enthalten, beherbergt das Corti-Organ, das auditive Sinnes Endorgan bei Säugetieren. Die Cochlea ist tonotopically organisiert und gewöhnlich in apikal, mittig geteilt, und basalen Windungen auf verschiedene Frequenzbereiche mit hochfrequenten Schallerkennung in der Basis und Niederfrequenzerkennung entsprechend der Spitze 1. Haarzellen, die mechanosensorischen Zellen des Corti-Organ, führen Sie die Länge der Cochlea, die etwa 6 mm lang bei Mäusen 2,3 ist. Diese Zellen wandeln die mechanische Energie der Schallwellen, die durch die mit Flüssigkeit gefüllte häutige Labyrinth übertragen werden, in neuronale Signale, die von zentralen auditorischen Strukturen verarbeitet werden. Die hier beschriebene Technik stellt ein Verfahren zur Herstellung von ganzen Bergen von Corti-Organ nach der Verkalkung der Cochlea abgeschlossen ist (für die Proben von einer Woche im Alter bis zum Erwachsenenalter). Wir präsentieren auch ein Verfahren zur immunostaining der ganzen montiert Cochlea-Gewebe. Cochlear Gesamtpräparate sind entscheidend für die Visualisierung der Haarzellen und Stützzellen umgibt in ihrer natürlichen räumlichen Anordnungen und ermöglichen eine Analyse in drei Dimensionen unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie. Drs. Hans Engström und Harlow Ades beschrieb ursprünglich eine ganze montieren Cochlea-Dissektion Verfahren im Jahr 1966. Sie detailliert eine Technik, um schnell zu fixieren und zu sezieren verkalkten cochleae in Flüssigkeit eingetaucht ist aus einer Vielzahl von Säugetieren, die Erhaltung intakter kurzen Segmenten des Corti-Organ für die mikroskopische Analyse 4. Die Präparation eines nicht fixierten, verkalkten Cochlea der Ratte hat sich auch in einem Lehr-Video 5 dargestellt. Drs. Barbara Bohne und Gary Harding an der Washington University, machte einige wichtige Veränderungen an dieser Methode. In ihrer Version der Cochlea ganze Berg-Methode, war das Schläfenbein entkalkt, in Kunststoff eingebettet und fünf Halbdrehungen oder zehn Viertel-Drehungen waren dissected 6,7. Dr. Charles Liberman und Kollegen an Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Eye and Ear Infirmary, modifiziert diese Technik so, daß Kunststoff-Einbettung nicht erforderlich 8. Weitere Modifikation der Technik traten bei Dr. Jian Zuo Labor in St. Jude-Kinderkrankenhaus 9-12, die die hier präsentierten Dissektion Verfahren informiert. Wir verwenden eine andere Strategie, um Zugriff auf das Corti-Organ als Bohne und Liberman, die Isolierung der kompletten apikalen, mittleren und basalen Umdrehungen ermöglicht zu gewinnen. Damit die sezierten Gewebe grßer und weniger wahrscheinlich, dass während der Dissektion oder Immunprozesse verloren gehen oder beschädigt werden. Darüber hinaus erleichtert die aktuelle Methode Messung des Abstandes von der apikalen Spitze oder basal Haken um einen Frequenzbereich zu ermitteln. Obwohl viele Labors durchführen Immunfärbung von Cochlea-Gewebe, ist unklar, wo diese Methode entstand. Als Ergebnis gibt es verschiedene Rezepte zum Blockieren buffeRS und Antikörperinkubation Puffer, die die Leistung der einzelnen primären Antikörper beeinträchtigen kann. Hier stellen wir ein Verfahren zur Immunfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die für die am häufigsten verwendeten Antikörper im auditorischen Bereich ist. Die komplexe Form der Cochlea, zarte Struktur des Corti-Organ, und knöchernen Umhüllung eine Herausforderung für die histologische und biochemische Analyse. Eine Vielzahl von Techniken sind derzeit in der mündlichen Verhandlung Feld verwendet, um diese schwierige Features zu überwinden und die Zellen zu visualisieren im Corti-Organ, jede Technik mit eigenen Vor- und Nachteile. Die hier vorgestellte Protokoll erlaubt ganze Berg Dissektion der erwachsenen Maus Cochlea und mit leichten Modifikation kann potentiell verwendet werden, um die kritischen Strukturen im cochleae aus einer Vielzahl von anderen auf dem Gebiet verwendet werden Modellorganismen untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Standard-Zange für das Muster</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>kann bei anderen Anbietern erworben werden</td></tr><tr><td>10,5 cm feine Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td>kann bei anderen Anbietern erworben werden</td></tr><tr><td>2 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>MidSci</td><td>AVSS2000</td><td>können bei anderen Anbietern erworben werden</td></tr><tr><td>16 % Formaldehyd, methanolfrei, ultrarein, EM-Qualität</td><td>Polysciences</td><td>18814</td><td>GIFTIG -- Handschuhe tragen und darf nicht in der Spüle entsorgt werden. Kann bei anderen Anbietern erworben werden.</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>kann bei anderen Anbietern gekauft</td></tr><tr><td>werden EDTA Fisher</td><td></td><td>BP118-500</td><td>kann bei anderen Anbietern gekauft</td></tr> werden <tr><td>End-over-End-Rohrrotator</td><td>Fisher</td><td>05-450-127</td><td>kann bei anderen Anbietern gekauft werden 60</td></tr><tr><td>mm Petrischale</td><td>Fisher</td><td>50-202-037</td><td>kann bei anderen Anbietern gekauft werden</td></tr><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 Silikonverkapselungskit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Aktivkohle</td><td>Fisher</td><td>AC134372500</td><td>kann bei anderen Anbietern gekauft</td></tr><tr><td>werden Stereo-Dissektionsmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>kann bei anderen Anbietern gekauft werden</td></tr><tr><td>Dumont #4 Juwelierzange</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Juwelierzange</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>2,5 mm Federschere Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>gebogen&nbsp;</td></tr><tr><td>5 mm Federschere Vannas-Tübingen</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>gerade</td></tr><tr><td>48-Well-Platten</td><td>Fisher</td><td>08-772-52</td><td>kann bei anderen Anbietern erworben werden</td></tr><tr><td>8-Well-Kammer-Objektträger</td><td>Fisher</td><td>1256518</td><td>kann bei anderen Anbietern erworben werden</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500</td><td>kann bei anderen Anbietern erworben</td></tr><tr><td>werden BSA, Fraktion V</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td>kann von anderen Anbietern erworben werden</td></tr><tr><td>NGS</td><td>Vector labs</td><td>S-1000</td><td>kann von anderen Anbietern erworben werden</td></tr><tr><td>NHS</td><td>Vector labs</td><td>S-2000</td><td>kann von anderen Anbietern erworben werden</td></tr><tr><td>3D-Rotator</td><td>Midsci</td><td>R3D-710</td><td>kann von anderen Anbietern erworben werden</td></tr><tr><td>Western Blot Inkubationsbox XL</td><td>Licor</td><td>929-97401</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>kann bei anderen Anbietern erworben werden</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade-Montagemedien</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>können bei anderen Anbietern erworben werden, aber Montagemedien variieren in ihrer Fähigkeit, vor Photobleiche zu schützen</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>können von anderen Anbietern gekauft werden</td></tr><tr><td>Deckgläser 22 x 22 x 1</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td>kann bei anderen Anbietern gekauft werden klarer</td></tr><tr><td>Nagellack</td><td>Örtliche Drogerie</td><td></td><td>kann bei anderen Anbietern gekauft werden</td></tr><tr><td>Diamappe aus Pappe</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>kann bei anderen Anbietern gekauft werden</td></tr><tr><td>Kunststoff-Diabox</td><td>Fisher</td><td>03-448-10</td><td>kann bei anderen Anbietern gekauft werden</td></tr></tbody></table>

ganze berge dissection und immunfluoreszenz der erwachsenen maus cochlea

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Das Corti-Organ, das in der Cochlea des Innenohrs untergebracht ist, enthält mechanosensorische Haarzellen und umgebende Stützzellen, die spiralförmig organisiert sind und einen tonotopischen Gradienten für die Schallerkennung aufweisen. Die Cochlea der Maus ist etwa 6 mm lang und für die Analyse oft in drei Windungen (Spitze, Mitte und Basis) unterteilt. Um den Zellverlust, die Zellteilung oder die Mosaik-Genexpression zu untersuchen, ist die gesamte Präparation der Cochlea nützlich. Diese Dissektionsmethode ermöglicht die Visualisierung aller Zellen innerhalb des Corti-Organs, wenn sie mit Immunfärbung und konfokaler Mikroskopie kombiniert wird, um Zellen in verschiedenen Ebenen der z-Achse abzubilden. Aus diesen Z-Stapel-Bildern können auch mehrere optische Querschnitte gewonnen werden. Darüber hinaus kann die Whole-Mount-Dissektionsmethode für die Rasterelektronenmikroskopie verwendet werden, obwohl eine andere Fixierungsmethode erforderlich ist. Hier stellen wir eine Methode vor, um das Corti-Organ als drei intakte Cochlea-Windungen (Spitze, Mitte und Basis) zu isolieren. Diese Methode kann bei Mäusen im Alter von einer Woche bis zum Erwachsenenalter angewendet werden und unterscheidet sich von der Technik für neonatale Proben, bei denen die Verkalkung der Cochlea unvollständig ist. Eine leicht modifizierte Version kann für die Dissektion der Ratten-Cochlea verwendet werden. Wir demonstrieren auch ein Verfahren zur Immunfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern.

Wir präsentieren eine Methode, um das Corti-Organ als drei intakte Cochlea-Windungen (Spitze, mittlere und Basis) von Cochlea-Gewebe, das verkalkt ist, mit den wichtigsten Dissektion Schritte in Abbildung 1 dargestellt zu isolieren. Während der ersten postnatalen Woche der Entwicklung, Verkalkung der Maus Cochlea ist unvollständig und eine einfachere Dissektion Methode kann verwendet 13 werden. Verwenden des Neugeborenen ganze Berg Dissektion Methode mit Cochl...

Wir präsentieren eine Methode, um die Erwachsenen Corti-Organ als drei intakte Cochlea-Windungen (Spitze, mittlere und Base) zu isolieren. Wir haben auch ein Verfahren zur Immunfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern nachzuweisen. Zusammen ermöglichen diese Verfahren die Untersuchung der Haarzellen, Stützzellen und anderen Zelltypen in der Cochlea vorhanden.

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Das übergeordnete Ziel dieser Ganzpräparat-Dissektionsmethode besteht darin, den sensorischen Bereich der verkalkten adulten Cochlea als drei intakte Windungen zu isolieren: die Spitze, die mittlere Windung und die Basis. Diese Dissektionsmethode erhält die dreidimensionale Struktur des Corti-Organs bei und ermöglicht die Visualisierung aller Zellen in Kombination mit Immunfärbung und konfokaler Mikroskopie zur Abbildung in verschiedenen Ebenen entlang der z-Achse. Im Vergleich zu früheren Dissektionsmethoden verwenden wir eine andere Strategie, die drei Cochleawindungen erzeugt, die größer sind und im Verlauf der Immunfärbung weniger wahrscheinlich verloren gehen oder beschädigt werden.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Dissektion schwer zu erlernen ist. Da das Corti-Organ zerbrechlich ist, bleibt nur ein geringer Spielraum für Fehler beim Entfernen des Spiralbandes. Nach der Tötung des Tieres gemäß den genehmigten Verfahren und dem Entfernen des Gehirns beginnen Sie damit, die Schläfenbeine an der Basis des Maus-Schädels zu identifizieren.Entfernen Sie dann die Hirnnerven mit einer Standard-Pinzette. Setzen Sie die Pinzette an der Spitze der Otokapsel an und drücken Sie mit dem Daumen der anderen Hand auf den hinteren Bogengang, um die eingeschlossene Cochlea zu lösen. Lösen Sie die untere Hälfte des Schläfenbeins entweder manuell mit Daumen und Zeigefinger oder mithilfe einer 10,5 cm langen Feinschere vom Schädel und geben Sie sie zur Fixierung in methanol-freies, elektronenmikroskopiegerechtes 4 % Paraformaldehyd.Nach der Fixierung die Ohrknöchelchen entsprechend den Anweisungen im schriftlichen Teil des Protokolls entkalken. Um festzustellen, ob die Probe ausreichend entkalkt ist, werden die Ohrknöchelchen auf eine mit Silikonelastomer beschichtete Präparierschale gelegt und vorsichtig mit einer Pinzette auf die schneckenförmige Cochlea gedrückt. Wenn das Gewebe schwammig ist, ist die Entkalkung abgeschlossen.Fügen Sie PBS zur Dissektionschale hinzu und halten Sie unter einem Stereomikroskop mit einer Nr. 4- oder Nr. 5-Pinzette das Felsenbein im Vestibularbereich fest. Schneiden Sie mit einer 5 ml-Vannas-Tübingen-Feder-Schere überschüssiges Otokapselgewebe an den Seiten und oberhalb der Spitze ab. Verwenden Sie eine 2,5 ml-Vannas-Feder-Schere, führen Sie eine Klinge in das ovale Fenster ein und setzen Sie mehrere kleine Schnitte entlang des Spiralbandes der Basalwindung an. Führen Sie nun eine Klinge der 5 ml-Vannas-Tübingen-Feder-Schere in den zuvor geschnittenen Bereich ein und platzieren Sie die andere Klinge außen am Felsenbein, medial zum ovalen Fenster.Dieser Schnitt trennt die Basalschnecke von der Mittel- und der Apikalschnecke. Als Nächstes vervollständigen Sie die Präparation der Basalschnecke, indem Sie mit der 2,5-Milliliter-Federschere die zum Modiolus führenden Nervenfasern des Spiralorganes durchtrennen, um die Spannung in der Basalschnecke zu lösen. Schneiden Sie unterhalb der Basalschnecke entlang, um sie von den Gleichgewichtsorganen zu trennen.Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe zu führen und die Fasern des Spiralganglions an der mit Silikon-Elastomer beschichteten Schale zu befestigen. Führen Sie eine Reihe kleiner Schnitte durch, um das Spiralband sowohl oberhalb als auch unterhalb des Corti-Organs zu entfernen. Während die Fasern des Spiralganglions an der mit Silikon-Elastomer beschichteten Schale befestigt sind, verwenden Sie die Pinzette, um die verbleibende Reissner-Membran vom Corti-Organ zu entfernen.Führen Sie mehrere Schnitte durch, um die Dicke der Axone des Spiralorganes zu verringern. Greifen Sie dann die verbleibenden Axone des Spiralorganes mit einer Pinzette an und übertragen die präparierte Basalskalentwicklung in eine 48-Well-Platte, die etwa 500 Mikroliter PBS enthält. Trennen Sie nun die Mittel- und Apikalskalentwicklung, indem Sie zunächst die verbleibenden zwei Drittel der Cochlea mit der apikalen Seite nach unten platzieren.Danach eine Klinge der 2,5-Milliliter-Schere in die Scala media einführen, dort, wo die mittlere Windung zuvor mit der basalen Windung verbunden war, und mehrere Schnitte entlang des Spiralbandes der mittleren Windung ausführen. Mit der 5-Milliliter-Schere eine Klinge in den Schnittbereich einführen, wobei die mittlere Windung auf der Klinge aufliegt. Die andere Klinge außen am knöchernen Labyrinth in einem 90-Grad-Winkel zur apikalen Spitze ansetzen.Dieser Schnitt trennt die mittlere Windung von der apikalen Windung. Vervollständigen Sie anschließend die Präparation der mittleren Windung, indem Sie das Spiralband vom Corti-Organ entfernen. Überführen Sie die präparierte Windung wie zuvor in eine 48-Well-Platte.Verwenden Sie nun eine 2,5-Milliliter-Vannas-Schere, um die Kappe zu öffnen, die die apikale Windung bedeckt, und wiederholen Sie den Vorgang, um das Spiralband der apikalen Windung vom Corti-Organ zu entfernen. Überführen Sie die präparierte Windung wie zuvor in eine 48-Well-Platte. Um mit der Immunfärbung zu beginnen, aspirieren Sie zunächst PBS aus jedem Well und ersetzen Sie es durch 200 bis 300 Mikroliter Blockierungslösung. Inkubieren Sie anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem 3D-Rotator.Nach Ablauf der Inkubationszeit die Blockierungslösung entfernen und mit 100 Mikrolitern primärem Antikörper ersetzen, der entsprechend in Trägerlösung verdünnt wurde. Über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem 3D-Rotator inkubieren. Am nächsten Tag die Lösung mit dem primären Antikörper entfernen und jede Vertiefung dreimal mit jeweils 500 Mikrolitern PBS für mindestens fünf Minuten bei Raumtemperatur waschen.Wiederholen Sie die Waschung zweimal. Nach der letzten Waschung saugen Sie das PBS ab und achten Sie darauf, die dissezierte Windung nicht mit der Pipettenspitze aufzusaugen. Ersetzen Sie es durch 100 Mikroliter pro Vertiefung fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper, der in Trägerlösung verdünnt ist.Stellen Sie die 48-Well-Platte in eine schwarze Box, um sie vor Licht zu schützen, und platzieren Sie sie auf dem 3D-Rotator, um sie zwei bis drei Stunden bei Raumtemperatur zu inkubieren. Nach der Inkubation saugen Sie die Sekundärantikörper-Lösung ab und waschen dreimal mit PBS wie zuvor. Nach dem Entfernen des letzten Waschschritts geben Sie 100 Mikroliter Hoechst hinzu, um die Kerne zu markieren.Lichtgeschützt 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem 3D-Rotator inkubieren. Abschließend die Hoechst-Lösung entfernen und dreimal wie zuvor mit PBS waschen. Nach der Markierung jedes Objektträgers 50 Mikroliter Eindeckmedium auf jeden Objektträger pipettieren.Danach mit einer geraden Pinzette der Größe vier oder fünf die Axone des Spiralganglions erfassen und vorsichtig eine Cochleagang aus der 48-Well-Platte auf das Montagemedium übertragen. Mithilfe des Mikroskops sicherstellen, dass der präparierte Gang weder gefaltet noch verdreht ist. Ein Ende eines Deckgläschens auf einen Objektträger legen und vorsichtig loslassen, damit das Deckglas herunterfällt.Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass die Cochleawindung nicht in der Nähe einer Luftblase liegt. Falls dies der Fall ist, bewegen Sie vorsichtig den Deckel rück- und vorwärts, um die Cochleawindung neu zu positionieren. Wiederholen Sie den Vorgang für die anderen Cochleawindungen.Montieren Sie eine Cochleagang pro Objektträger, um eine Lichteinwirkung und eine photobleaching während des Abbildungsprozesses zu vermeiden. Legen Sie die Objektträger in eine Objektträgermappe, sodass sie flach liegen. Schützen Sie sie vor Licht und lassen Sie das Montagemedium über Nacht bei Raumtemperatur aushärten.Am nächsten Tag decken Sie die Deckgläser mit klarem Nagellack ab und lagern Sie sie bei Raumtemperatur oder 20 Grad Celsius, bis sie abgebildet werden. Dieses konfokale Schnittbild zeigt die mittlere Windung des Cochlea, isoliert von einem p15-Maus. 420fache Vergrößerungsbilder wurden überlagert, um die gesamte mittlere Windung zu rekonstruieren.Die Haarzellen, markiert mit einem primären Kaninchen-Anti-Myosin-VIIa-Antikörper und einem mit Alexa 647 konjugierten sekundären Antikörper, erscheinen magenta. Stützzellen, markiert mit einem primären Ziegen-Anti-SOX2-Antikörper und einem mit Alexa 568 konjugierten sekundären Antikörper, erscheinen grün. Die Kerne erscheinen aufgrund der Hoechst-Färbung blau.Die Maßstabsleiste entspricht 100 Mikrometern. Dieses Bild zeigt einen optischen Querschnitt der mittleren Windung, isoliert von einer sechs Wochen alten Maus, in der X-, Z-Ebene. Auch hier sind die Haarzellen mit einem magentafarbenen Fluorophor und die Stützzellen mit einem grün erscheinenden Fluorophor markiert.Dies ist eine vergrößerte Darstellung des vorherigen Bildes, bei der die Fadenkreuze entfernt wurden. Die Maßstabsleiste entspricht 20 Mikrometern. Die folgenden vier Bilder zeigen einige der Probleme, die während der Ganzpräparat-Dissektion oder beim Aufbringen der Cochleagänge auf Objektträger auftreten können.Hier auf der linken Seite des Bildes wurde das Cochleagewebe neben der letzten Reihe der äußeren Haarzellen geschnitten, wodurch viele dieser Zellen in unterschiedlichen Winkeln eingebettet sind. In diesem Bild wurde ein Abschnitt des Corti-Organs auf der linken Seite abgeschnitten. In der Mitte des Bildes befindet sich ein Loch, das in den Bereich der äußeren Haarzellen gestanzt wurde.Hier ist das Corti-Organ an mehreren Stellen gefaltet. Sobald die Technik beherrscht ist, kann die Ganzpräparat-Dissektion in 20 bis 30 Minuten abgeschlossen werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, die Pinzette nicht auf das Corti-Organ zu setzen und das Spiralband nicht zu ziehen oder zu greifen.Schließen Sie stattdessen die Pinzette und fixieren Sie die Spiralganglionfasern an der mit Silikonelastomer beschichteten Schale. Proben von Mäusen im Alter von einer bis drei Wochen sind toleranter und nützlicher, um die Dissektionsmethode zu erlernen. Außerdem sind Proben mit Schäden an den Haarzellen schwieriger zu dissezieren, wobei Gewebe, das Lärm ausgesetzt war, besonders empfindlich und zerbrechlich ist.Nach diesem Dissektionsverfahren können weitere Methoden wie die Rasterelektronenmikroskopie durchgeführt werden. Es ist jedoch ein anderes Fixiermittel erforderlich. Zudem haben wir geringfügige Modifikationen an diesem Protokoll für die Dissektion von Ratten-Cochleagewebe vorgenommen, und in Zukunft hoffen wir, das Protokoll weiter für die Dissektion der Cochlea von Chinchilla, Ratte und Meerschweinchen anzupassen.

whole-mount-dissection-immunofluorescence-adult-mouse

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Ein einfaches Verfahren der Vibratom Schneiden des Corti-Organ, durch Immunhistochemie und konfokale Mikroskopie folgt beschrieben. Dieses Verfahren ermöglicht eine verbesserte Erhaltung der feinen Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ, und somit ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Zelltypen.

Vibratom Sectioning für Enhanced Erhaltung der Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ

Primäre Zilien beeinflussen verschiedene Signalwege. Die Cochlea von Säugetieren ist ideal für die Untersuchung der Signalübertragung der planaren Zellpolarität (PCP). Die Dysfunktion der Zilien beeinflusst das Wachstum der Cochlea, die zelluläre Musterung und die Ausrichtung der Haarzellen, die Messwerte des PCP. Unser Ziel ist es, die PCP-Signalübertragung in der Cochlea der Maus mittels phänotypischer Analyse, Immunhistochemie und Rasterelektronenmikroskopie zu analysieren.

Bewertung der Planar-Cell-Polarity Phänotypen in Ziliopathie Maus-Mutanten-Cochlea

Das Ziel dieses Protokolls ist eine effektive Methode, um decellularize und Entkalken Maus Cochleae zur Nutzung als Gerüste für Tissue-engineering-Anwendungen zu demonstrieren.

Ein Protokoll für einem Maus Cochleae für das Innenohr Tissue Engineering

Dieses Manuskript beschreibt ein experimentelles Protokoll zur Bewertung der morphologischen Eigenschaften und des Funktionellen Status von Bandsynapsen bei normalen Mäusen. Das vorliegende Modell eignet sich auch für lärminduzierte und altersbedingte Cochlea-Synaptopathie-eingeschränkte Modelle. Die korrelativen Ergebnisse früherer Mausstudien werden ebenfalls diskutiert.

Morphologische und funktionelle Bewertung von Bandsynapsen an bestimmten Frequenzregionen der Maus cochlea

Dieser Artikel stellt eine modifizierte Cochlea-Oberflächenvorbereitungsmethode vor, die eine Entkalkung und Verwendung eines Zell- und Gewebeklebers erfordert, um die Stücke der Cochlea-Epithel an 10 mm runden Abdeckungsscheinen für die Immunhistochemie bei erwachsenen Mauscochleae zu haften.

Cochlea-Oberflächenvorbereitung in der Erwachsenenmaus

In dieser Studie stellen wir ein Echtzeit-Bildgebungsverfahren unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie vor, um Zellen zu beobachten, die sich durch Ex-vivo-Inkubation mit dem Cochlea-Epithel, das das Organ von Corti enthält, in Richtung geschädigtes Gewebe bewegen.

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging zur Erforschung der Zellmigration zum Organ von Corti

Es wird ein Protokoll zur Verarbeitung von Cochleae für junge Erwachsene und ältere Rennmäuse durch Immunmarkierung der afferenten synaptischen Strukturen und Haarzellen, Abschreckung der Autofluoreszenz in gealtertem Gewebe, Sezieren und Abschätzen der Länge der Cochleae und Quantifizierung der Synapsen in Bildstapeln vorgestellt, die mit konfokaler Bildgebung erhalten wurden.

Immunmarkierung und Zählbandsynapsen bei jungen Erwachsenen und älteren Rennmaus-Cochleae

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für ein Mausmodell des lärminduzierten Hörverlusts (NIHL) vor. Um NIHL zu induzieren, haben wir ein neues und einfaches Gerät aus gewelltem Kunststoff, einem Rattenfallenkäfig und einem Lautsprecher entwickelt. Die auditorische Hirnstammantwort und die Immunfluoreszenzbildgebung wurden eingesetzt, um die Hörfunktion bzw. die Schädigung der äußeren Haarzellen zu beurteilen.

Modifizierte Versuchsbedingungen für lärminduzierten Hörverlust bei Mäusen und Beurteilung der Hörfunktion und der Schädigung der äußeren Haarzellen

Ein Lichtblattmikroskop wurde entwickelt, um die gesamte Cochlea abzubilden und zu digitalisieren.

Bildgebung der alternden Cochlea mit Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie

Die Stria vascularis ist für die Bildung des endocochleären Potentials von entscheidender Bedeutung. In dieser Arbeit stellen wir die Präparation der adulten Stria vascularis der Maus für die Einzelkernsequenzierung oder Immunfärbung vor.

Präparation von Stria vascularis der adulten Maus zur Einzelkernsequenzierung oder Immunfärbung

Dieses Protokoll, das für unerfahrene Benutzer von Maus-Innenohrgewebe gedacht ist, beschreibt umfassend die Schritte zur Verarbeitung von Maus-Innenohren in verschiedenen Entwicklungsstadien für die Schnittimmunfärbung.

Kryosektion und Immunfärbung von Innenohrgewebe von Mäusen: vom Embryonalstadium bis zum Erwachsenenstadium

Lernen Sie die Präparation der erwachsenen Maus-Cochlea als drei intakte Wendungen mit Immunfärbung und konfokaler Mikroskopie. Diese Methode bewahrt die dreidimensionale Struktur des Corti-Organs und ermöglicht die Visualisierung von Haarzellen und Stützzellen.

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

Weitere Videos entdecken