Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

Wir präsentieren eine Methode, um die Erwachsenen Corti-Organ als drei intakte Cochlea-Windungen (Spitze, mittlere und Base) zu isolieren. Wir haben auch ein Verfahren zur Immunfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern nachzuweisen. Zusammen ermöglichen diese Verfahren die Untersuchung der Haarzellen, Stützzellen und anderen Zelltypen in der Cochlea vorhanden.

Das übergeordnete Ziel dieser Whole-Mount-Dissektionsmethode ist es, die sensorische Region der verkalkten erwachsenen Cochlea in drei intakte Windungen zu isolieren: die Spitze, die Mitte und die Basis. Diese Dissektionsmethode bewahrt die dreidimensionale Struktur des Corti-Organs und ermöglicht in Kombination mit Immunfärbung und konfokaler Mikroskopie die Visualisierung aller Zellen, um auf verschiedenen Ebenen der Z-Achse abzubilden. Im Vergleich zu früheren Dissektionsmethoden verwenden wir eine andere Strategie, die drei Cochlea-Windungen erzeugt, die größer sind und mit geringerer Wahrscheinlichkeit verloren gehen oder bei der Immunfärbung beschädigt werden.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das Präparieren schwer zu erlernen ist. Da das Corti-Organ zerbrechlich ist, gibt es einen kleinen Spielraum für Fehler bei der Entfernung des Spiralbandes. Nachdem Sie das Tier nach zugelassenen Verfahren eingeschläfert und das Gehirn entfernt haben, beginnen Sie mit der Identifizierung der Schläfenknochen in der Basis des Mausschädels.

Kratzen Sie dann die Hirnnerven mit einer Standardzange ab. Platzieren Sie die Pinzette an der Spitze der Kapsel und drücken Sie mit dem Daumen der anderen Hand auf den hinteren Bogengang, um die eingekapselte Cochlea zu lösen. Befreien Sie die untere Hälfte des Schläfenbeins entweder manuell mit Daumen und Zeigefinger oder mit einer 10,5 Zentimeter feinen Schere vom Schädel und legen Sie es in eine methanolfreie Elektronenmikroskopie mit 4 % Paraformaldehyd

Nach der Fixation entkalken Sie die Schläfenknochen gemäß den Anweisungen im schriftlichen Teil des Protokolls. Um festzustellen, ob die Probe ausreichend entkalkt ist, legen Sie die Schläfenknochen auf eine mit Silikon-Elastomer beschichtete Sezierschale und drücken Sie die Pinzette vorsichtig auf die schneckenförmige Cochlea. Ist das Gewebe schwammig, dann ist die Entkalkung abgeschlossen.

Geben Sie PBS in die Präparierschale und verwenden Sie dann bei der Arbeit unter einem Stereo-Dissektionsmikroskop die Pinzette Nummer vier oder fünf, um das Schläfenbein im vestibulären Bereich zu halten, und fünf Milliliter Vannas-Tübingen-Federschere, um überschüssiges otisches Kapselgewebe entlang der Seiten und über der Spitze abzuschneiden. Führen Sie mit einer 2,5 Milliliter Federschere Vannas eine Klinge in das ovale Fenster ein und machen Sie mehrere kleine Schnitte entlang des Spiralbandes der Basaldrehung. Führen Sie nun eine Klinge der fünf Milliliter Federschere Vannas-Tübingen in den gerade geschnittenen Bereich ein und platzieren Sie die andere Klinge an der Außenseite des Schläfenbeins, medial zum ovalen Fenster.

Dieser Schnitt trennt die basale Drehung von der mittleren und apikalen Drehung. Um die Dissektion der basalen Drehung abzuschließen, verwenden Sie als Nächstes die 2,5-Milliliter-Federschere, um die Nervenfasern des Spiralgangliens zu durchtrennen, die mit dem Modololus verbunden sind, um die Spannung in der basalen Drehung zu lösen. Unterhalb der basalen Drehung abschneiden, um sich von den vestibulären Organen zu trennen.

Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe zu führen und die Spiralganglienfasern an die mit Silikon-Elastomer beschichtete Schale zu heften. Machen Sie eine Reihe kleiner Schnitte, um das spiralförmige Band sowohl oberhalb als auch unterhalb des Corti-Organs zu entfernen. Wenn die Spiralganglienfasern an der mit Silikon-Elastomer beschichteten Schale befestigt sind, entfernen Sie mit der Pinzette die verbleibende Reissner-Membran aus dem Corti-Organ.

Machen Sie mehrere Schnitte, um die Dicke der Spiralganglienaxone zu reduzieren. Fassen Sie dann die verbleibenden Axone des Spiralganglions mit einer Pinzette und übertragen Sie die präparierte Basaldrehung auf eine 48-Well-Platte, die etwa 500 Mikroliter PBS enthält. Trennen Sie nun die mittlere und die apikale Drehung, indem Sie zuerst die restlichen zwei Drittel der apikalen Seite der Cochlea nach unten legen.

Führen Sie dann eine Klinge der 2,5 Milliliter Schere in die Scala media ein, wo zuvor die mittlere Drehung mit der basalen Drehung verbunden war, und machen Sie mehrere Schnitte entlang des Spiralbandes der mittleren Drehung. Führen Sie mit der Fünf-Milliliter-Schere eine Klinge in den Schnittbereich ein, wobei die mittlere Umdrehung auf der Klinge platziert wird. Platzieren Sie die andere Klinge an der Außenseite des knöchernen Labyrinths in einem 90-Grad-Winkel von der apikalen Spitze.

Dieser Schnitt trennt die mittlere Drehung von der apikalen Drehung. Schließen Sie als Nächstes die Dissektion der mittleren Windung ab, indem Sie das spiralförmige Band aus dem Corti-Organ entfernen. Übertragen Sie die präparierte Wende wie zuvor auf eine 48-Well-Platte.

Verwenden Sie nun eine 2,5-Milliliter-Federschere von Vannas, um die Kappe zu öffnen, die die apikale Drehung abdeckt, und wiederholen Sie den Vorgang, um das apikale Wendespiralband aus dem Corti-Organ zu entfernen. Übertragen Sie die präparierte Wende wie zuvor auf eine 48-Well-Platte. Um mit der Immunfärbung zu beginnen, aspirieren Sie zuerst PBS aus jeder Vertiefung, ersetzen Sie es dann durch 200 bis 300 Mikroliter Blockierungslösung und inkubieren Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem 3D-Rotator.

Nach Ablauf der Inkubationszeit die Blockierungslösung entfernen und durch 100 Mikroliter Primärantikörper ersetzen, die entsprechend in Trägerlösung verdünnt sind. Inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem 3D-Rotator. Entfernen Sie am nächsten Tag die primäre Antikörperlösung und waschen Sie jede Vertiefung mindestens fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit 500 Mikrolitern PBS.

Wiederholen Sie die Wäsche zweimal. Nach dem letzten Waschen aspirieren Sie das PBS und achten Sie darauf, dass Sie die präparierte Windung in der Pipettenspitze nicht aufsaugen. Ersetzen Sie ihn durch 100 Mikroliter fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper, der in einer Trägerlösung verdünnt ist.

Legen Sie die 48-Well-Platte zum Schutz vor Licht in eine Blackbox und stellen Sie sie auf den 3D-Rotator, um sie zwei bis drei Stunden lang bei Raumtemperatur zu inkubieren. Nach der Inkubation die sekundäre Antikörperlösung aspirieren und wie zuvor dreimal mit PBS waschen. Nach dem Entfernen der letzten Wäsche 100 Mikroliter Hoechst zur Markierung der Zellkerne hinzufügen.

Vor Licht schützen und 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem 3D-Rotator inkubieren. Zum Schluss die Hoechst-Lösung entfernen und wie zuvor dreimal mit PBS waschen. Nachdem Sie jeden Objektträger beschriftet haben, pipettieren Sie 50 Mikroliter Einbettmedium auf jeden Objektträger.

Fassen Sie dann mit der Juwelierzange Nummer vier oder Nummer fünf die Axone des Spiralganglions an und übertragen Sie vorsichtig eine Cochlea-Umdrehung von der 48-Well-Platte auf das Einbettmedium. Verwenden Sie das Mikroskop, um sicherzustellen, dass die präparierte Drehung nicht gefaltet oder verdreht ist. Legen Sie ein Ende eines Deckblatts auf eine Folie und lassen Sie es vorsichtig los, damit der Deckblatt fallen kann.

Verwenden Sie ein Stereo-Dissektionsmikroskop, um sicherzustellen, dass sich die Cochlea-Drehung nicht in der Nähe einer Luftblase befindet. Bewegen Sie in diesem Fall den Abdeckschub vorsichtig hin und her, um die Cochlea-Drehung neu zu positionieren. Wiederholen Sie den Vorgang für die anderen Cochlea-Drehungen.

Montieren Sie eine Cochlea-Umdrehung pro Objektträger, um Lichteinwirkung und Lichtausbleichen während des Bildgebungsprozesses zu vermeiden. Legen Sie die Folien so in einen Folienordner, dass sie flach liegen. Vor Licht schützen und die Eindeckmedien über Nacht bei Raumtemperatur aushärten lassen.

Versiegeln Sie am nächsten Tag die Deckblätter mit klarem Nagellack und lagern Sie sie bei Raumtemperatur oder 20 Grad Celsius, bis sie abgebildet sind. Dieses konfokale Schnittbild zeigt die Cochlea-Mitteldrehung, isoliert von einer p15-Maus. 420X-Bilder wurden überlagert, um die gesamte mittlere Kurve zu rekonstruieren.

Die Haarzellen, die mit einem Kaninchen-Anti-Myosin VIIa-Primärantikörper und einem Alexa 647-konjugierten Sekundärantikörper markiert sind, erscheinen magentafarben. Stützzellen, die mit einem Anti-SOX2-Primärantikörper und einem Alexa 568-konjugierten Sekundärantikörper markiert sind, erscheinen grün. Die Zellkerne erscheinen aufgrund der Hoechst-Färbung blau.

Der Maßstabsbalken stellt 100 Mikrometer dar. Dieses Bild zeigt einen optischen Querschnitt der mittleren Windung, isoliert von einer sechs Wochen alten Maus in der X-, Z-Ebene. Auch hier werden die Haarzellen mit einem magentafarbenen Fluorophor und die Stützzellen mit einem grün erscheinenden Fluorophor markiert.

Dabei handelt es sich um eine vergrößerte Vergrößerung des vorherigen Bildes, wobei das Fadenkreuz entfernt wurde. Der Maßstabsbalken stellt 20 Mikrometer dar. Die folgenden vier Bilder zeigen einige der Probleme, die bei der Dissektion der gesamten Halterung oder beim Montieren von Cochlea-Dias auftreten können.

Hier, auf der linken Seite des Bildes, wurde das Cochlea-Gewebe neben der letzten Reihe der äußeren Haarzellen geschnitten, wodurch viele dieser Zellen in unterschiedlichen Winkeln angebracht wurden. In diesem Bild ist ein Abschnitt des Corti-Organs auf der linken Seite abgeschnitten. In der Mitte des Bildes ist ein Loch in den äußeren Bereich der Haarzellen gestanzt.

Hier ist das Organ von Corti an mehreren Stellen gefaltet. Einmal gemeistert, kann die gesamte Präparationstechnik in 20 bis 30 Minuten abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Eingriffs ist es wichtig, die Pinzette nicht auf das Corti-Organ zu legen und das Ziehen oder Greifen am Spiralband zu vermeiden.

Schließen Sie stattdessen die Pinzette und stecken Sie die Spiralganglienfasern an die mit Silikon-Elastomer beschichtete Schale. Proben von ein bis drei Wochen alten Mäusen sind verzeihender und nützlicher, um die Seziermethode zu erlernen. Darüber hinaus sind Proben mit Haarzellschäden schwieriger zu sezieren, wobei lärmexponiertes Gewebe besonders schwierig und zerbrechlich ist.

Im Anschluss an dieses Präparierverfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Rasterelektronenmikroskopie, durchgeführt werden. Es wird jedoch ein anderes Fixiermittel benötigt. Darüber hinaus haben wir geringfügige Änderungen an diesem Protokoll für die Dissektion von Cochlea-Gewebe von Ratten vorgenommen, und wir hoffen, dass wir in Zukunft weitere Änderungen für die Dissektion von Cochlea aus Chinchilla, Rennmaus und Meerschweinchen vornehmen können.