Name: Erzeugenden Primärfibroblastenkulturen von Maus-Ohr und Schwanz Tissues (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Lernen Sie die Erzeugung primärer Fibroblastenkulturen aus Maus-Ohren und -Schwänzen. Diese Methode ermöglicht die Nutzung von bis zu 10 Tagen bei Raumtemperatur gelagerten Geweben für die Zellbiologie-Forschung.

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Diese Arbeit wurde durch das NRF-Stipendium HUJ-CREATE - Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation unterstützt.

Die Mäuse wurden in pathogenfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts bis Euthanasie (The Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Richtlinien an der National University of Singapore und der National Advisory Committee für Labortierforschung (NACLAR) Richtlinien) untergebracht ist. 1. Mäuse <ol><li> Bestellen Sie eine Maus der entsprechenden genetischen Hintergrund. Dieses Protokoll basiert auf Gewebe von einer C57BL / 6-Mäusen abgeleitet wurden. </li></ol> 2. Herstellung von Komplettmedium <ol><li> Vorbereitung Komplettmedium durch Zugabe der folgenden Komponenten zu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium, 10% fötales Kälberserum (FCS), 50 uM 2-Mercaptoethanol, 100 uM Asparagin, 2 mM Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung. </li></ol> 3. Vorbereitung der Enzymlösungen <ol><li> Bereiten Kollagenase D-Lösung in einem 15 ml konischen Bodenrohr. <ol><li> Man wiegt 10 mg Kollagenase D. Dissolve Kollagenase D in 4 ml Vollmedium. </li></ol></li><li> Bereiten Pronase-Lösung in einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. <ol><li> Man wiegt 10 mg Pronase. </li><li> Plus 5 ul 1 M Tris-Puffer (pH 8,0). 1 ul 0,5 M EDTA (pH 8,0). </li><li> Füllen Sie mit 494 &amp; mgr; l sterilem Wasser. </li><li> Inkubieren Pronaselösung bei 37 ° C in einem Wasserbad für 30 min. </li></ol></li></ol> 4. Herstellung von Collagenase D-Pronase Mix (≤2 Tails) Hinweis: Führen Sie die nachfolgenden Schritte in einem sterilen Zellkultur Kapuze. <ol><li> Add 250 ul Pronase Lösung auf 4 ml Kollagenase D-Lösung. </li><li> Übergeben Sie die Collagenase D-Pronase Mischung durch einen 0,2 um Spritzenfilter in ein steriles 15 ml konischen Bodenrohr. </li></ol> 5. Gewinnung von Fibroblasten von Ohr und Schwanz Tissues <ol><li> Euthanize Mäusen nach den entsprechenden Richtlinien des Instituts.</li><li> Zeigen autoklaviert chirurgische Instrumente (Schere und Pinzette) in der Zellkultur Kapuze. </li><li> 10 ml Komplettmedium in zwei 10 cm Zellkulturschalen je. </li><li> Geschnitten Ohren (~ 1 cm Radius) und 5 cm des Schwanzes (von der Spitze des Schwanzes) einer Maus mit Schere und Inkubation für 5 min in 40 ml 70% igem Ethanol in einem sterilen 50 ml konischen Unterrohr. </li><li> Luft trocknen Ohren und Schwanz, indem sie in einer offenen 10 cm Zellkulturschale in der Haube für 5 min. Einmal getrocknet, Transfer Ohr und Schwanzstücke, zwei Kulturschalen mit &quot;Ohren&quot; und &quot;Schwanz&quot;, die 10 ml Vollmedium wie in Schritt 5.3 beschrieben. </li><li> Entfernen Sie Haare aus den Ohren und Schwanz mit einer Schere. </li><li> Schneiden Ohren und Schwanz in Stücke kleiner als 3 mm in der Größe mit einer Schere. </li><li> Übertragen Sie die geschnittenen Gewebe in 1,8 ml Kryoröhrchen Fläschchen mit &quot;Ohren&quot; und &quot;Schwanz&quot; und fügen Sie eine ausreichende Kollagenase D-Pronaselösung für das Volumen, um das 1,8-ml-Markierung auf der Flasche zu erreichen. </li><li> Pschnüren die Kryoröhrchen Fläschchen horizontal auf einem Shaker und schütteln Sie die Proben bei 200 Upm für 90 min bei 37 ° C. </li><li> Nach 90 min Inkubation, entfernen Sie die Kryoröhrchen Vials aus dem Schüttler und legen Sie die Durchstechflaschen in der Kapuze. </li><li> 10 ml Komplettmedium in zwei 10 cm Zellkulturschalen, die mit &quot;Ohren&quot; und &quot;Schwanz&quot; jeder, und legte eine 70 &amp; mgr; m Zellsieb in jedem Gericht. </li><li> Legen Sie die verdaut Ohr und Schwanz Gewebe in der 70 &amp; mgr; m Zellsieb in den entsprechend gekennzeichnet Gerichte in Schritt 5.11 vorbereitet und kraftvoll mahlen das Gewebe mit einer 10 ml Spritzenkolben für&gt; 5 min. Schütteln Sie die Zellsieb gelegentlich in dem Medium, um Zellen aus der Zelle Sieb waschen. </li><li> Pipettieren Sie die Zellsuspension aus jeder Schale in zwei 15 ml konischen Boden Rohre mit &quot;Ohren&quot; und &quot;Schwanz&quot;. Waschen Sie die Teller und Sieb mit zusätzlichen 10 ml Komplettmedium und fügen Sie das Medium in die entsprechenden 15 ml konischen Boden Rohre. </li><li> Spin down die ZelleSuspension 7 min bei ~ 580 × g und 4 ° C unter Verwendung einer Kühlzelle Zentrifuge. </li><li> Überstand entfernen, 10 ml Komplettmedium auf das Zellpellet in 15 ml konischen Boden Rohr und die Zellen resuspendieren. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.14 und 5.15. </li></ol> 6. Die Kultivierung des Zellgemisches <ol><li> Überstand entfernen. Stellen Sie sicher, dass das Zellpellet ungestört bleibt. </li><li> Re-suspend-Zellen in 10 ml Vollmedium und fügen Sie die entsprechende Mischung auf zwei 10 cm Zellkulturschalen mit &quot;Ohren&quot; und &quot;Schwanz&quot;. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l Amphotericin B-Lösung (Stammlösung: 250 &amp; mgr; g / ml) zu der Kultur. </li><li> Zellen bei 37 ° C inkubieren in einem befeuchteten 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Am dritten Tag, ersetzen Sie das Medium, das mit 10 ml frisches vollständiges Medium, das 10 &amp; mgr; l von Amphotericin B, um Ablagerungen zu entfernen (Abbildung 1 und 2). </li></ol> 7. Sub-Kultur von Fibroblasten <ol><li> When Kultur erreicht etwa 70% Konfluenz (Tag 3-4 Kultur) Entfernen des Mediums und Waschen der Zellen mit 5 ml sterile 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Entfernen PBS und 2 ml sterile 1x Trypsin-EDTA-Lösung zu den Zellen. </li><li> Die Zellen 5 min bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Nach 5 min, klopfen Sie leicht das Kulturschale und 6 ml Vollmedium zu den Zellen. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konischen Boden Rohr und drehen Sie das Rohr für 5 min bei ~ 450 xg und 4 ° C unter Verwendung eines Kühlzelle Zentrifuge. </li><li> Überstand abnehmen und vorsichtig resuspendieren das Zellpellet in 5 ml Vollmedium. </li><li> Samen 2 x 10 5 Zellen in einer 10 cm Zellkulturschale und Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2 Inkubator für 3-4 Tage vor der Wiederholung der Schritte 7.1 bis 7.6. </li></ol> 8. Herstellung von Ohren für den Versand Hinweis: Führen Sie ter nachfolgende Schritte in einer sterilen Zellkultur Kapuze. <ol><li> Euthanize Mäusen nach den entsprechenden Richtlinien des Instituts. </li><li> Zeigen autoklaviert Schere und Pinzette in die Zellkultur Kapuze. </li><li> 50 ml vollständigem Medium in einem 50 ml konischen Unterrohr. </li><li> Schneiden Sie die Ohren (~ 1 cm Radius) einer Maus mit einer Schere. </li><li> Übertragen Sie die Ohren in die 50 ml konischen Bodenrohr mit einer Pinzette (wie in Schritt 3 hergestellt). </li><li> Verschließen Sie die 50 ml konischen Bodenrohr mit Parafilm vor dem Versand bei RT in einer entsprechenden Box. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass es keinen Konflikt zwischen finanziellen Interessen gibt.

Hier stellen wir eine einfache, kostengünstige und schnelle experimentelle Verfahren zur primären Fibroblastenkulturen aus den Ohren und Schwänze der Mäuse zu etablieren. Die Extraktion sollte in haftende und sich schnell teilenden Fibroblasten innerhalb von 3 Tagen nach der Trennung des Gewebes führen. Eine wichtige Einschränkung von Primärzellen ist Seneszenz, eine dauerhafte Wachstumsstillstand 15. Verwendung des Protokolls kann Fibroblastenkulturen für 5-6 mal passagiert werden, bevor Fibroblasten werden ...

Primärzellen werden von lebendem Gewebe und kultiviert unter in vitro Bedingungen abgeleitet sind. Es wird allgemein angenommen, dass primäre Zellen, die den physiologischen Zustand und der genetische Hintergrund des Gewebes, aus dem sie stammen, als immortalisierte oder Tumorzelllinien 1 stärker ähneln. Aus diesem Grund Primärzellen sind ein nützliches Modell für die Untersuchung biologischer Fragestellungen 2,3. Doch im Gegensatz zu etablierten Zelllinien, die auf unbestimmte Zeit zu wachsen, Primärzellen schließlich unterziehen Seneszenz in Kultur und häufig wiedereingeführt werden müssen. Üblicherweise verwendete primäre Zellen umfassen Fibroblasten, Epithelzellen, Endothelzellen, T-Zellen, B-Zellen, Knochenmark-Makrophagen (BMDM) und Knochenmark stammenden dendritischen Zellen (BMDC). Fibroblasten werden oft als primäre Zellkultur-Modell genutzt. Sie bieten entscheidende Vorteile gegenüber anderen Primärzellen. Die Zellkulturen werden leicht hergestellt, leicht aufrechterhalten und erfordern keine Purification der Zellen vor der Kultur. Sie haben schnellen anfänglichen Proliferation und keine Voraussetzung für die Fachmedium oder Aktivierungsprotokolle. Fibroblasten lassen sich effizient mit biologischen, chemischen und physikalischen Protokollen 4,5 transfiziert werden. Gibt es eine Möglichkeit, um die Ohren für bis zu 10 Tage bei RT vor der Etablierung von Zellkulturen zu speichern. Fibroblastenkulturen sind förderlich für die Visualisierung von zytoplasmatischen Prozesse und für die Neuprogrammierung in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) 6. Fibroblasten sind wichtige Zellen des Bindegewebes, die Kollagen-Proteine ​​der extrazellulären Matrix 7 sekretieren. Sie stellen den strukturellen Rahmen in vielen Geweben 8 und spielen eine wesentliche Rolle bei der Wundheilung und Gewebereparatur 9,10. Hier beschreiben wir eine einfache und schnelle (&lt;4 h) Protokoll, um Fibroblastenkulturen aus den Ohren und Schwänze der Mäuse 11 zu etablieren. Das Protokoll erfordert nur minimale MausErfahrung, um das Gewebe (im Gegensatz zu anderen Protokollen 12,13) ​​zu ernten und kann verwendet werden, um Kulturen von Ohren in Medium bei RT für bis zu 10 Tage gelagert zu etablieren.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Asparagin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4159</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck Millipore</td><td>107017</td><td>Absolute zur Analyse</td></tr><tr><td>Kollagenase D</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088866001</td><td>Aus Clostridium histolyticum, lyophilisiert, unsterile</td></tr><tr><td>Pronase-Protease</td><td>Merck Millipore</td><td>53702</td><td>Aus Streptomyces griseus&nbsp; </td></tr><tr><td>Tris-Puffer (pH 8)</td><td>1. BASE</td><td>1415</td><td>Ultrareine Qualität</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8)</td><td>1. BASE</td><td>BUF-1053</td><td>Biotechnologie-Qualität</td></tr><tr><td>10X phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>1. BASE</td><td>BUF-2040-10X4L</td><td>Ultrareine</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td>0,5 % Trypsin, 0,2 % EDTA, Trypsin gammabestrahlt durch SER-TAIN-Verfahren, ohne Phenolrot, in Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2492-20ml</td><td>250 &mu; g/ml in entionisiertem Wasser, sterilfiltriert</td></tr><tr><td>Schere</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Aesculap</td><td>AE-BD312R</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &mu; M Spritzenvorsatzfilter</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; M Zellsieb</td><td>SPL</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenkolben</td><td>Terumo</td><td>SS+10L</td><td></td></tr><tr><td>Kryoröhrchenröhrchen</td><td>NUNC</td><td>368362</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Zellkulturschale</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td>Zellkulturbehandelte Schale&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml konisches Bodenröhrchen</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konisches Bodenröhrchen</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>GFL</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Inkubationsschüttler</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>Certomat-BS1</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 25 Lichtmikroskop</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

erzeugenden primärfibroblastenkulturen von maus-ohr und schwanz tissues

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Primärzellen werden direkt aus Gewebe gewonnen und sind gedacht, um mehr repräsentativ für den physiologischen Zustand der Zellen, die in vivo als etablierte Zelllinien sein. Jedoch weisen primäre Zellkulturen in der Regel eine begrenzte Lebensdauer und häufig wiedereingeführt werden müssen. Fibroblasten sind eine leicht zugängliche Quelle von Primärzellen. Hier diskutieren wir eine einfache und schnelle Versuchsdurchführung zu primären Fibroblastenkulturen von Ohren und Schwanz von Mäusen zu etablieren. Das Protokoll kann die primäre Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden, zu etablieren. Wenn das Protokoll genau befolgt, sind Verunreinigungen unwahrscheinlich, trotz der Verwendung für längere Zeit in einigen Fällen nicht gespeichert unsterilen Gewebe auftreten. Fibroblasten vermehren sich rasch in Kultur und kann zu einer beträchtlichen Zahl vor einer replikativen Seneszenz erweitert werden.

Extraktion von Fibroblasten, die aus Gewebe in einer signifikanten Menge an Gewebetrümmer (Abbildung 1). Im Gegensatz zu Gewebetrümmer, Fibroblasten haften an Gewebekulturkunststoffoberflächen zwischen Tag 1 und 3 der Kultur. Das Medium der Fibroblastenkulturen kann sicher an Tag 3 der Kultur, die die Pegel der vorliegenden Trümmer in der Kultur (2) signifikant verringern sollte verändert werden. Fibroblasten zeigen eine längliche Morphologie und eine deutlich sichtbare Zytoplasma <stro...

Beschreiben wir eine einfache und schnelle experimentelle Verfahren zur Erzeugung von primären Fibroblasten, die aus den Ohren und Schwänze von Mäusen. Das Verfahren erfordert keine spezielle Tiertrainings erfordern und für die Erzeugung von Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden.

Erzeugenden Primärfibroblastenkulturen von Maus-Ohr und Schwanz Tissues

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, primäre Fibroblastenkulturen aus den Ohren und dem Schwanz von Mäusen zu etablieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten, beispielsweise Unterschiede zwischen gesunden und Krebszellen. Der Hauptvorteil dieser Studie liegt darin, dass wir Fibroblasten aus Ohren gewinnen können, die vor der Zellisolierung bis zu 10 Tage lang bei Raumtemperatur in Medium gelagert wurden.Obwohl diese Methode Einblicke in die Biologie der Maus ermöglicht, kann sie auch auf andere säugetierische Organismen wie Ratten und Kaninchen angewendet werden. Bevor die Gewebe gesammelt werden, füllen Sie 10-Zentimeter-Kulturschalen mit 10 Milliliter komplettem Medium. Danach, nachdem die Maus euthanasiert wurde, fahren Sie mit sterilisierten Instrumenten fort, um die Gewebeproben zu entnehmen.Sammeln Sie Gewebeproben aus dem Ohr mit einem Durchmesser von etwa einem Zentimeter und etwa fünf Zentimeter Schwanzgewebe. Überführen Sie die Gewebeproben in ein kegelförmiges Reagenzglas, das mit 40 Milliliter 70 %igem Ethanol gefüllt ist. Lassen Sie sie fünf Minuten lang einweichen und trocknen Sie sie anschließend fünf Minuten lang in einer offenen 10-Zentimeter-Kulturplatte in einer Sterilwerkbank an der Luft. Nachdem die Gewebe getrocknet sind, überführen Sie sie auf die mit Medium beladene Platte. Schneiden Sie nun mit einer Schere alle Haare von den Geweben ab und schneiden Sie die Gewebe in Stücke, die kleiner als drei Millimeter sind. Überführen Sie das zerkleinerte Gewebe in Kryoröhrchen und füllen Sie die Röhrchen anschließend mit Collagenase-D-Pronase-Lösung bis zur 1,8-Milliliter-Marke.Jetzt die Gewebe bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 200 U/min 90 Minuten lang inkubieren. Legen Sie in der Abzugshaube eine Schale mit 10 Milliliter komplettem Medium aus. Stellen Sie über die Schale einen 70-Mikron-Zellsieb und geben Sie nach der Inkubation die Gewebeverdauung in den Sieb.Zerreiben Sie das Gewebe nun mithilfe eines Stößels im Sieb. Führen Sie diesen Vorgang mindestens fünf Minuten lang durch. Schütteln Sie das Sieb gelegentlich in das Medium, um die dissoziierten Zellen auszuwaschen.Es ist wichtig, dass die verdauten Ohren- und Schwanzgewebe gut zerkleinert werden, um eine große Anzahl von Zellen zu gewinnen. Achten Sie außerdem darauf, den Zellsieb nach dem Zerkleinern der Gewebe gut zu schütteln. Dadurch werden zusätzliche Zellen aus dem Sieb ausgewaschen.Sammeln Sie anschließend die Zellsuspension in einem kegelförmigen 15-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie dann das Sieb mit 10 Milliliter Medium und geben Sie die Spüllösung zur Sammlung hinzu. Waschen Sie nun die Zellen.Zunächst zentrifugieren Sie die Zellen in einer gekühlten Zentrifuge. Danach entfernen Sie den Überstand. Schließlich suspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter komplettem Medium.Wiederholen Sie die Waschung ein weiteres Mal und schließen Sie das Verfahren ab, indem Sie die Zellen in komplettem Medium belassen, das für die Kultivierung bereitsteht. Um die Zellen zu kultivieren, überführen Sie zunächst die Zellsuspensionen in 10-Milliliter-Kulturschalen. Anschließend geben Sie 10 µL Amphoterizin-B-Lösung zu jeder Kultur hinzu.Incubieren Sie die Zellen nun drei Tage lang. Ersetzen Sie am dritten Tag das Medium durch frisches komplettes Medium mit Amphoterizin B. Kurz danach erreichen die Kulturen eine Konfluenz von 70 %. Entfernen Sie zu diesem Zeitpunkt das Medium und waschen Sie die Kultur mit fünf Millilitern 1X PBS aus.Danach ersetzen Sie das PBS durch zwei Milliliter 1X-Trypsin-EDTA-Lösung und inkubieren die Zellen fünf Minuten lang. Nach der kurzen Inkubation klopfen Sie vorsichtig auf die Schalen und geben je sechs Milliliter frisches komplettes Medium zu jeder Schale hinzu. Pipettieren Sie nun die freigesetzten Zellen aus der Schale in zwei kegelförmige 15-Milliliter-Röhrchen.Danach die Röhrchen fünf Minuten lang bei 450 G in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugieren. Die Pellets in fünf Milliliter komplettem Medium resuspendieren und die Zelldichte der Suspensionen bestimmen. Anschließend die Zellen in 10-Zentimeter-Platten mit jeweils 200.000 pro Platte ausplattieren.Inkubieren Sie diese Zellen drei bis vier Tage lang, bis sie eine Konfluenz von 70 % erreichen, und wiederholen Sie dann den Prozess des Sammelns und erneuten Ansäens der Zellen in einer bestimmten Dichte. Sie können auf diese Weise bis zu 25 Tage lang kultiviert werden. Drei Tage nach der Zellgewinnung befand sich signifikanter Zelltrümmern in der Kultur, bevor das Medium gewechselt wurde.Die Zelltrümmer sind mit weißen Pfeilen markiert. Die Maßstabsleiste entspricht 100 Mikron. Ein neues Medium reduzierte die Zelltrümmer signifikant.Drei Tage alte Kulturen, die aus Gewebe gewonnen wurden, das 10 Tage lang bei Raumtemperatur gelagert worden war, zeigten, dass die Fibroblasten ziemlich robust sind. Aus solchen Geweben wurde nach fünf bis sechs Tagen eine Fibroblasten-Konfluenz von 70 bis 80 % erreicht. Die Zellen wurden mit einem Marker für Fibroblasten, Vimentin, markiert, das in Rot dargestellt ist.DAPI wurde verwendet, um die Kerne anzufärben, die blau erscheinen. Die Maßstabsleiste beträgt 10 Mikrometer. Die gleichmäßige Färbung deutet darauf hin, dass die Fibroblastenkultur rein ist.Das beschriebene Protokoll erzielte regelmäßig dieses Ergebnis. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun wissen, wie primäre Fibroblastenkulturen schnell und zuverlässig etabliert werden können. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist besondere Vorsicht bei der Gewinnung der Fibroblasten aus dem Gewebe geboten, da eine unzureichende Zerkleinerung des Gewebes zu einer geringeren Zellzahl führt.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Isolierung und Instandhaltung von Fibroblastenkulturen von Haut-und Lungengewebe von wilden Nagetieren.

Gründung Primary Adult Fibroblastenkulturen von Nagetieren

Die Qualität von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) durch die rechte Mausstamm wie CF-1 bestimmt. Pluripotenz-unterstützende MEFs und konditionierte Medien (CM) aus diesen gewonnenen Erkenntnisse sollten den optimalen Konzentrationen von Activin A, Gremlin und TGFß1 für die Activin / Nodal und FGF Signalwege erforderlich, um kooperativ zu halten Selbsterneuerung und Pluripotenz enthalten.

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

Erzeugung induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) Linien produziert Linien unterschiedlicher Entwicklungspotenzial, auch wenn sie Standard-Tests für Pluripotenz passieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Mäuse vollständig aus iPS, die die iPSC Linien definiert als die über volle Pluripotenz abgeleitet...

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Dieses Video beschreibt die schnelle Methode, die Melanozyten und Fibroblasten gleichzeitig aus der Haut des postnatalen Mauswelpen zu isolieren und zu kultivieren. Diese Zellen können in vitro erhalten und manipuliert werden, um die Zellbiologie der Haut, die Wundheilung und das Melanom zu untersuchen.

Schnelle Kultivierung primärer melanischer Melanozyten und Fibroblasten: Isolierung von Melanozyten und Fibroblasten aus einer ganzen Maushautprobe

Hier zur Gewebezüchtung Gefäßimplantate, die zum Pfropfen in Mäusen durch Impfen Doppel partiell pluripotenten Stammzellen funktional erzeugen präsentieren wir ein Protokoll (PiPSC) - abgeleiteten glatten Muskelzellen und PiPSC - abgeleitete Endothelzellen auf einer dezellularisierten Gefäßgerüst Bioreaktor.

Generierung und Pfropfen von Tissue Engineering Gefäße in einem Maus-Modell

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Erzeugung von iCMs unter Verwendung der Retrovirus-vermittelten Verabreichung von Gata4, Tbx5 und Mef2c in einem polycistronischen Konstrukt. Dieses Protokoll liefert eine relativ homogene Population von reprogrammierten Zellen mit verbesserter Effizienz und Qualität und ist wertvoll für zukünftige Studien zur iCM-Reprogrammierung.

Verbesserte Generierung induzierter Kardiomyozyten Mit einem Polycistronische Construct Ausdruck optimale Verhältnis von Gata4, Mef2c und Tbx5

Das Verhalten von Fibroblasten liegt einem Spektrum klinischer Entitäten zugrunde, aber sie bleiben schlecht charakterisiert, hauptsächlich aufgrund ihrer inhärenten Heterogenität. Die traditionelle Fibroblastenforschung beruht auf In-vitro-Manipulation, um das Verhalten von Fibroblasten in vivo zu maskieren. Wir beschreiben ein FACS-basiertes Protokoll für die Isolierung von Hautfibroblasten der Maus, das keine Zellkultur erfordert.

Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS

Hier stellen wir Ihnen unser Protokoll für Herstellung von induzierten erythroiden Vorläuferzellen (iEPs) von Maus Erwachsenen Fibroblasten mit Transkription Faktor-driven direkte Abstammung Neuprogrammierung (DLR).

Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen

Dieses Protokoll skizziert eine schnelle Methode, um gleichzeitig Melanozyten- und Fibroblastenkulturen aus der Haut von 0-4 Tage alten Mäusen zu erzeugen. Diese Primärkulturen können in vitro gepflegt und manipuliert werden, um eine Vielzahl physiologisch relevanter Prozesse zu untersuchen, einschließlich Hautzellbiologie, Pigmentierung, Wundheilung und Melanom.

Schnelle Generierung von primären Melanozyten- und Fibroblastenkulturen

Wir präsentieren ein Protokoll, um primäre erwachsene Fibroblasten auf einfache, schnelle und zuverlässige Weise zu isolieren, die von Anfängern (z. B. Studenten) durchgeführt werden können. Das Verfahren kombiniert enzymatische Gewebeverdauung und mechanische Agitation mit Ultraschallwellen, um primäre Fibroblasten zu erhalten. Das Protokoll kann leicht an spezifische experimentelle Anforderungen (z.B. menschliches Gewebe) angepasst werden.

Ultraschall-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung von künstlichem Bindegewebe für eine Parallelkultur von 48 Geweben in einer Multi-Well-Platte mit Doppelpolen vorgestellt, die für mechanistische Studien, Krankheitsmodellierung und Screening-Anwendungen geeignet ist. Das Protokoll ist kompatibel mit Fibroblasten aus verschiedenen Organen und Spezies und wird hier mit menschlichen primären kardialen Fibroblasten veranschaulicht.

Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Lernen Sie die Erzeugung primärer Fibroblastenkulturen aus Maus-Ohren und -Schwänzen. Diese Methode ermöglicht die Nutzung von bis zu 10 Tagen bei Raumtemperatur gelagerten Geweben für die Zellbiologie-Forschung.

Erzeugenden Primärfibroblastenkulturen von Maus-Ohr und Schwanz Tissues

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