Erzeugenden Primärfibroblastenkulturen von Maus-Ohr und Schwanz Tissues

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, primäre Fibroblastenkulturen aus den Ohren und dem Schwanz von Mäusen zu etablieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten, beispielsweise Unterschiede zwischen gesunden und Krebszellen. Der Hauptvorteil dieser Studie liegt darin, dass wir Fibroblasten aus Ohren gewinnen können, die vor der Zellisolierung bis zu 10 Tage lang bei Raumtemperatur in Medium gelagert wurden.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Biologie der Maus ermöglicht, kann sie auch auf andere säugetierische Organismen wie Ratten und Kaninchen angewendet werden. Bevor die Gewebe gesammelt werden, füllen Sie 10-Zentimeter-Kulturschalen mit 10 Milliliter komplettem Medium. Danach, nachdem die Maus euthanasiert wurde, fahren Sie mit sterilisierten Instrumenten fort, um die Gewebeproben zu entnehmen.

Sammeln Sie Gewebeproben aus dem Ohr mit einem Durchmesser von etwa einem Zentimeter und etwa fünf Zentimeter Schwanzgewebe. Überführen Sie die Gewebeproben in ein kegelförmiges Reagenzglas, das mit 40 Milliliter 70 %igem Ethanol gefüllt ist. Lassen Sie sie fünf Minuten lang einweichen und trocknen Sie sie anschließend fünf Minuten lang in einer offenen 10-Zentimeter-Kulturplatte in einer Sterilwerkbank an der Luft.

Nachdem die Gewebe getrocknet sind, überführen Sie sie auf die mit Medium beladene Platte. Schneiden Sie nun mit einer Schere alle Haare von den Geweben ab und schneiden Sie die Gewebe in Stücke, die kleiner als drei Millimeter sind. Überführen Sie das zerkleinerte Gewebe in Kryoröhrchen und füllen Sie die Röhrchen anschließend mit Collagenase-D-Pronase-Lösung bis zur 1,8-Milliliter-Marke.

Jetzt die Gewebe bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 200 U/min 90 Minuten lang inkubieren. Legen Sie in der Abzugshaube eine Schale mit 10 Milliliter komplettem Medium aus. Stellen Sie über die Schale einen 70-Mikron-Zellsieb und geben Sie nach der Inkubation die Gewebeverdauung in den Sieb.

Zerreiben Sie das Gewebe nun mithilfe eines Stößels im Sieb. Führen Sie diesen Vorgang mindestens fünf Minuten lang durch. Schütteln Sie das Sieb gelegentlich in das Medium, um die dissoziierten Zellen auszuwaschen.

Es ist wichtig, dass die verdauten Ohren- und Schwanzgewebe gut zerkleinert werden, um eine große Anzahl von Zellen zu gewinnen. Achten Sie außerdem darauf, den Zellsieb nach dem Zerkleinern der Gewebe gut zu schütteln. Dadurch werden zusätzliche Zellen aus dem Sieb ausgewaschen.

Sammeln Sie anschließend die Zellsuspension in einem kegelförmigen 15-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie dann das Sieb mit 10 Milliliter Medium und geben Sie die Spüllösung zur Sammlung hinzu. Waschen Sie nun die Zellen.

Zunächst zentrifugieren Sie die Zellen in einer gekühlten Zentrifuge. Danach entfernen Sie den Überstand. Schließlich suspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter komplettem Medium.

Wiederholen Sie die Waschung ein weiteres Mal und schließen Sie das Verfahren ab, indem Sie die Zellen in komplettem Medium belassen, das für die Kultivierung bereitsteht. Um die Zellen zu kultivieren, überführen Sie zunächst die Zellsuspensionen in 10-Milliliter-Kulturschalen. Anschließend geben Sie 10 µL Amphoterizin-B-Lösung zu jeder Kultur hinzu.

Incubieren Sie die Zellen nun drei Tage lang. Ersetzen Sie am dritten Tag das Medium durch frisches komplettes Medium mit Amphoterizin B. Kurz danach erreichen die Kulturen eine Konfluenz von 70 %. Entfernen Sie zu diesem Zeitpunkt das Medium und waschen Sie die Kultur mit fünf Millilitern 1X PBS aus.

Danach ersetzen Sie das PBS durch zwei Milliliter 1X-Trypsin-EDTA-Lösung und inkubieren die Zellen fünf Minuten lang. Nach der kurzen Inkubation klopfen Sie vorsichtig auf die Schalen und geben je sechs Milliliter frisches komplettes Medium zu jeder Schale hinzu. Pipettieren Sie nun die freigesetzten Zellen aus der Schale in zwei kegelförmige 15-Milliliter-Röhrchen.

Danach die Röhrchen fünf Minuten lang bei 450 G in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugieren. Die Pellets in fünf Milliliter komplettem Medium resuspendieren und die Zelldichte der Suspensionen bestimmen. Anschließend die Zellen in 10-Zentimeter-Platten mit jeweils 200.000 pro Platte ausplattieren.

Inkubieren Sie diese Zellen drei bis vier Tage lang, bis sie eine Konfluenz von 70 % erreichen, und wiederholen Sie dann den Prozess des Sammelns und erneuten Ansäens der Zellen in einer bestimmten Dichte. Sie können auf diese Weise bis zu 25 Tage lang kultiviert werden. Drei Tage nach der Zellgewinnung befand sich signifikanter Zelltrümmern in der Kultur, bevor das Medium gewechselt wurde.

Die Zelltrümmer sind mit weißen Pfeilen markiert. Die Maßstabsleiste entspricht 100 Mikron. Ein neues Medium reduzierte die Zelltrümmer signifikant.

Drei Tage alte Kulturen, die aus Gewebe gewonnen wurden, das 10 Tage lang bei Raumtemperatur gelagert worden war, zeigten, dass die Fibroblasten ziemlich robust sind. Aus solchen Geweben wurde nach fünf bis sechs Tagen eine Fibroblasten-Konfluenz von 70 bis 80 % erreicht. Die Zellen wurden mit einem Marker für Fibroblasten, Vimentin, markiert, das in Rot dargestellt ist.

DAPI wurde verwendet, um die Kerne anzufärben, die blau erscheinen. Die Maßstabsleiste beträgt 10 Mikrometer. Die gleichmäßige Färbung deutet darauf hin, dass die Fibroblastenkultur rein ist.

Das beschriebene Protokoll erzielte regelmäßig dieses Ergebnis. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun wissen, wie primäre Fibroblastenkulturen schnell und zuverlässig etabliert werden können. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist besondere Vorsicht bei der Gewinnung der Fibroblasten aus dem Gewebe geboten, da eine unzureichende Zerkleinerung des Gewebes zu einer geringeren Zellzahl führt.