Au-Wechselwirkung von SLP1 Polymere und Monolayer aus Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS und AFM als Werkzeuge für Biomolekül-Metallforschung
19. Januar 2016
Um grundlegende Informationen über die Sorption und das Recycling von Gold aus wässrigen Systemen zu erhalten, wurde die Wechselwirkung von Au(III)- und Au(0)-Nanopartikeln auf S-Schicht-Proteinen untersucht. Die Sorption von Proteinpolymeren wurde mittels ICP-MS und die von proteinhaltigen Monolayern mit QCM-D untersucht. Ein anschließendes AFM ermöglicht die Abbildung der Nanostrukturen.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, das Goldsorptionsverhalten durch S-Schicht-Proteine des vorgestellten Bakterienstammes aus ökologischer und technologischer Sicht zu untersuchen. Diese Methoden können Schlüsselfragen in der Umweltforschung beantworten, z. B. auf dem Gebiet der Sorptionsprozesse und der Entfernung und Rückgewinnung von Metallen. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass Sie die Metallsorption und die Adsorption von Nanopartikeln in einem anderen Skalenbereich nachweisen können.
Durch den Einsatz von QCM-D ist es möglich, dies in einer Echtzeitmessung zu erkennen. Um diesen Vorgang zu starten, rüsten Sie die Flüssigkeitszellen mit Sensordummys aus. Pumpen Sie mindestens 20 Milliliter pro Modul eines 2%igen alkalischen flüssigen Reinigungsmittels in Reinstwasser durch das QCM-D- und Schlauchsystem.
Anschließend wird ein fünffaches Volumen pro Modul Reinstwasser mit einer Durchflussmenge von bis zu 300 Mikrolitern pro Minute gemäß dem Protokoll des Herstellers durch das System gepumpt. Reinigen Sie die Siliziumdioxidsensoren außerhalb der Durchflussmodule durch Inkubation in 2%iger Natriumdodecylsulfatlösung für mindestens 20 Minuten. Spülen Sie die Sensoren dann mehrmals mit Reinstwasser ab.
Nachdem Sie die Kristalle mit gefilterter Druckluft getrocknet haben, legen Sie sie für 20 Minuten in eine Ozonreinigungskammer. Wiederholen Sie anschließend den Reinigungsvorgang zweimal, um alle organischen Inhalte zu entfernen. Um gebundene Metalle von der Sensoroberfläche zu entfernen, spülen Sie die Sensoren mit einer molaren Salpetersäure ab.
Spülen Sie die Sensoren anschließend mehrmals mit Reinstwasser ab. Als nächstes modifizieren Sie die Sensoren mit drei Gramm pro Liter abwechselnder Schichten aus Polyethylenimin und Polystyrolsulfonat durch Tauchbeschichtung unter Verwendung der Schicht-für-Schicht- oder LBL-Technik. Legen Sie die Sensoren in die entsprechende Polyelektrolytlösung in Deep-Well-Platten und inkubieren Sie diese 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie dann die Sensoren aus der Polyelektrolytlösung und spülen Sie sie zwischen jedem Tauchbeschichtungsschritt intensiv mit Reinstwasser aus. Sobald die externe Modifikation abgeschlossen ist, platzieren Sie die Sensoren im Durchflussmodul. Äquilibrieren Sie die Sensoren, indem Sie sie vor Beginn der Experimente mit Reinstwasser spülen.
Lösen Sie an dieser Stelle zuvor isoliertes und gereinigtes Slp1 in der Formel Harnstoff auf, um die Polymere in Monomere umzuwandeln. Zentrifugieren Sie die monomerisierten Proteine eine Stunde lang bei 15.000 g und 4 Grad Celsius, um größere Proteinagglomerate zu entfernen. Mischen Sie den gelösten und zentrifugierten Slp1-Überstand mit Rekristallisationspuffer auf eine endgültige Proteinkonzentration von 0,2 Gramm pro Liter.
Nach erfolgreicher Proteinrekristallisation auf den polyelektrolytmodifizierten Sensoren in den Durchflussmodulen spülen Sie die beschichteten Sensoren intensiv mit Rekristallisationspuffer mit einer Durchflussrate von 125 Mikrolitern pro Minute, bis stabile Frequenzwerte und Dissipationsverschiebungen festgestellt werden. Nach erfolgreicher Slp1-Beschichtung in den Flow-Modulen wird die erhaltene Slp1-Schicht intensiv mit 1,6 Millimolar Citrat Puffer pH 5,0 gespült, bis stabile Werte der Frequenz und Dissipationsverschiebungen festgestellt werden. Als nächstes pumpt man eine zuvor vorbereitete ein-millimolare Nanopartikellösung mit einer Durchflussrate von 125 Mikrolitern pro Minute zu den Durchflussmodulen.
Verfolgen Sie dann die Massenadsorption an der Slp1-Schicht. Nach Abschluss der Metall-Nanopartikel-Wechselwirkung spülen Sie die Schicht mit nanopartikelfreiem Puffer, um schwach gebundene Metalle oder Nanopartikel zu entfernen. Nehmen Sie mit einem Rasterkraftmikroskop oder einem Rasterkraftmikroskop mit einem inversen optischen Mikroskop Bilder in Flüssigkeit mit Reinstwasser direkt auf den beschichteten QCM-D-Sensoren auf.
Spülen Sie die Sensoren nach den QCM-D-Experimenten mit Reinstwasser ab und platzieren Sie sie in der AFM-Flüssigkeitszelle. Verwenden Sie einen Ausleger mit einer Resonanzfrequenz von ca. 25 Kilohertz in Wasser und einer Steifigkeit von weniger als 0,1 Newton pro Meter. Stellen Sie die Scangeschwindigkeit zwischen 2,5 und 10 Mikrometer pro Sekunde ein.
Nehmen Sie Bilder im dynamischen Kontaktmodus auf, während der Ausleger von einem Piezo mit seiner Resonanzfrequenz angeregt wird. Abschließend wird durch die Schwingungsdämpfung der Abstand des Auslegers zur Oberfläche bestimmt. Die maximale Metallbindungskapazität von Gold drei durch suspendiertes Slp1 zeigt, dass es während der 24-stündigen Inkubation innerhalb des untersuchten pH-Bereichs stabil gebunden war.
Die unmittelbare Abnahme der Frequenz deutet auf eine schnelle Adsorption und eine hohe Affinität der Proteine zur polyelektrolytmodifizierten Oberfläche hin. Die Dissipation nimmt ebenfalls sofort zu, was auf eine Adsorption von viskoelastischen Molekülen an der Oberfläche aufgrund der schnellen Dämpfung hinweist, was zu steigenden Dissipationswerten führt. Vorsynthetisierte Gold-Null-Nanopartikel wurden mit Slp1 inkubiert und mit SDS-PAGE analysiert, die die QCM-D-Daten bestätigten, die zeigten, dass Nanopartikel die Slp1-Struktur nicht stören
.Die Adsorption von vorsynthetisierten metallischen Gold-Null-Nanopartikeln wird für QCM-D-Experimente in Delta-F-Delta-D-Diagrammen und als Dicken- und Massenprofile gezeigt. Hier ist das Proteingitter von Slp1 dargestellt, das auf polyelektrolytmodifizierten Sensoren rekristallisiert wurde. Die Gitterkonstante wurde mit 13 bis 14 Nanometern bestimmt und die Schichtdicke betrug 10 plus oder minus zwei Nanometer.
AFM-Studien bestätigten, dass das Slp1-Gitter nach der Gold-Drei-Wechselwirkung vollständig intakt blieb, was die QCM-D-Ergebnisse bestätigt, die die Stabilität der Beschichtung vorhersagten. AFM verifiziert die Adsorption von Gold-Null-Nanopartikeln am Slp1-Gitter, aber aufgrund der Partikelgröße folgen sie nicht der p4-Symmetrie von Slp1. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb eines Arbeitstages durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Nach diesen Methoden können weitere Techniken wie Infrarotspektroskopie oder Heliumionenmikroskopie durchgeführt werden, um weitere Fragen wie spezifische Bindungsvisiere oder Wechselwirkungen mit Gold oder Goldnanopartikeln zu beantworten. Die vorgestellte Technik ebnete dem uzrachem den Weg, um die Wechselwirkungen von Biomolekülen mit Metallen und beispielsweise das Adsorptions- und Dissorptionsverhalten auf verschiedenen Arten von Oberflächen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Wechselwirkungen von Metallen mit biologischen Lösungsmitteln untersucht und vergessen Sie bitte nicht, bei dieser Methode eine Schutzbrille, einen Laborkittel und natürlich auch Handschuhe zu verwenden.
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Übersicht
Diese Studie untersucht das Goldsorptionsverhalten von S-Schicht-Proteinen eines bakteriellen Stammes unter besonderer Berücksichtigung ökologischer und technologischer Auswirkungen. Die Forschung verwendet verschiedene Methoden, um die Metallsorption und die Adsorption von Nanopartikeln in Echtzeit zu untersuchen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Umweltwissenschaften
- Biotechnologie
- Nanotechnologie
Hintergrund
- Die Gewinnung von Gold aus wässrigen Systemen ist entscheidend für die ökologische Nachhaltigkeit.
- Schichtproteine spielen eine bedeutende Rolle bei Sorptionsprozessen von Metallen.
- Das Verständnis dieser Wechselwirkungen kann zur Entwicklung effizienter Recyclingverfahren beitragen.
- Echtzeit-Messtechniken verbessern die Analyse von Sorptionsverhalten.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Wechselwirkung von Au(III)- und Au(0)-Nanopartikeln mit S-Schicht-Proteinen.
- Bewertung der ökologischen und technologischen Auswirkungen der Goldsorption.
- Anwendung fortschrittlicher Techniken zur Echtzeitdetektion von Metallsorption.
Verwendete Methoden
- Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) zur Analyse von Proteinpolymeren.
- Schwingquarz-Mikrowaage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D) zur Analyse proteinhaltiger Monolagen.
- Rasterkraftmikroskopie (AFM) zur Abbildung von Nanostrukturen.
- Echtzeitmessungen zur Verfolgung von Sorptionsprozessen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Detektion der Goldsorption durch S-Schicht-Proteine.
- Echtzeitmessungen lieferten Einblicke in die Adsorption von Nanopartikeln.
- Charakterisierung von Nanostrukturen mittels AFM-Bildgebung.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis von Metallrückgewinnungsprozessen bei.
Schlussfolgerungen
- Die Studie unterstreicht das Potenzial von S-Schicht-Proteinen bei der Gewinnung von Gold.
- Fortgeschrittene Techniken ermöglichen eine detaillierte Analyse der Sorptionsverhalten.
- Die Ergebnisse könnten zukünftige umwelt- und technologische Anwendungen beeinflussen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative Analyse von Protein-Metall-Wechselwirkungen ist entscheidend, um die Entwicklung biosorptiver Materialien risikominimiert voranzutreiben und die Workflows zur Metallrückgewinnung in der Biopharma- und industriellen Biotechnologie zu optimieren. Die Kombination von QCM-D, ICP-MS und AFM ermöglicht eine Echtzeit-Untersuchung mit hoher Auflösung der Bindungskinetik, strukturellen Stabilität und Oberflächenwechselwirkungen und stärkt so die Vorhersagegenauigkeit bei der frühen Materialauswahl. Diese Fähigkeiten unterstützen Go/No-Go-Entscheidungen für translationsfähige Biosorptionsplattformen und fördern die abteilungsübergreifende Ausrichtung in Forschung und Entwicklung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die mechanistische Untersuchung der Spezifität und Affinität der Protein-Metall-Bindung.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von biosorptiven Protein-Kandidaten für die Materialinnovation.
- Liefert quantitative Daten für die prädiktive Modellierung und die risikoadjustierte Priorisierung von Biosorptionszielen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erleichtert die Echtzeitüberwachung der Monoschichtbildung und Nanopartikeladsorption zur Standardisierung von Assays.
- Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse zur Vergleichbarkeit von Proteinvarianten und Oberflächenmodifikationen.
- Ermöglicht die skalierbare Untersuchung biosorptiver Materialien für die Integration in nachgeschaltete Prozesse.
Translationale und präklinische Forschung
- Stellt die Leistung biosorptiver Proteine im Einklang mit industriell relevanten Bedingungen, wie pH-abhängiger Bindung, dar.
- Ermöglicht die kontinuierliche Übertragung von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung der Biosorptionswirksamkeit und -stabilität.
- Liefert strukturelle und funktionelle Daten, um die risikoadjustierte Weiterentwicklung biosorptiver Plattformen zu unterstützen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser Arbeitsablauf verbindet die frühe Entdeckung, das Screening und die translationale Forschung, indem er die quantitative Beurteilung von Protein-Metall-Wechselwirkungen und struktureller Stabilität in Echtzeit ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die mechanistische Entrisikobewertung von biosorptiven Proteinkandidaten.
- Screening: Stellt assaysbereite, reproduzierbare Einzelschichtsysteme für den vergleichenden Test bereit.
- Analytik: Liefert quantitative Bindungs-, Massen- und Strukturaussagen für fundierte, datenbasierte Entscheidungen.
- Translationale Forschung: Gewährleistet die Konsistenz der biosorptiven Leistung über verschiedene Modellsysteme und Prozessbedingungen hinweg.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für Untersuchungen zu Protein-Metall-Wechselwirkungen in unterschiedlichen Forschungs- und Entwicklungsprogrammen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Entwicklung biosorptiver Materialien.
- Operationaler Wert: Standardisiert Arbeitsabläufe zur Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit in Studien zu Protein-Metall-Wechselwirkungen.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffiziente Weiterentwicklung des Portfolios.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung biosorptiver Kandidaten für industrielle und umweltrelevante Anwendungen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in QCM-D, ICP-MS und AFM-Methodik sowie bei der Interpretation der Daten.
- Benötigt eine leistungsfähige analytische Infrastruktur für Echtzeit- und hochauflösende Messungen.
- Setzt eine standardisierte Probenvorbereitung und Assay-Protokolle über Teamgrenzen hinweg voraus.
- Eine Anpassung kann für unterschiedliche Proteinsysteme oder Oberflächenchemien erforderlich sein.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Empfindlichkeit gegenüber pH-Wert und Nanopartikelgröße, wie die Studie belegt.
