Name: Au-Wechselwirkung von SLP1 Polymere und Monolayer aus Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS und AFM als Werkzeuge für Biomolekül-Metallforschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Erfahren Sie die Gold-Sorption durch S-Layer-Proteine von Lysinibacillus sphaericus JG-B53 mittels QCM-D, ICP-MS und AFM in Echtzeit. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Biomolekül-Metall-Wechselwirkungen.

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Die vorliegende Arbeit wurde teilweise durch die IGF-Projekt &quot;S-Sieve&quot; (490 ZBG / 1) durch das BMWi und des BMBF-Projektes &quot;Aptasens&quot; (BMBF / DLR 01RB0805A) finanziert finanziert. Besonderen Dank an Tobias J. Günther für seine wertvolle Hilfe bei der AFM-Studien und um Erik V. Johnstone zum Lesen des Manuskripts als englischer Muttersprachler. Ferner würde der Autor dieses Papieres gerne Aline Ritter und Sabrina Gurlit (vom Institut für Ressourcenökologie zur Unterstützung bei der ICP-MS-Messungen) zu danken, Manja Vogel, Nancy Unger, Karen E. Viacava und die Gruppe Biotechnologie des Helmholtz-Institut Freiberg für Ressourcentechnologie.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In dieser Arbeit untersuchten die Bindung von Au auf S-Layer-Proteine ​​wurde unter Verwendung einer Kombination von verschiedenen analytischen Methoden untersucht. Insbesondere die Bindung von Au ist sehr attraktiv, nicht nur für die Wiedergewinnung von Au aus dem Bergbau, Wasser oder Prozesslösungen, sondern auch für die Konstruktion von Materialien, zB sensorischen Oberflächen. Für Studien der Wechselwirkung Au (Au (III) und Au (0) -NPs) mit suspendierten und umkristallisiert Monoschicht von SLP1, das Protei...

Aufgrund der zunehmenden Verwendung von Gold für verschiedene Anwendungen wie Elektronik, Katalysatoren, Biosensoren oder medizinische Instrumente hat sich die Nachfrage des Edelmetalls in den letzten Jahren 6-9 gewachsen. Gold sowie viele andere wertvolle und Schwermetalle in die Umwelt über industrielle Abwässer in verdünnten Konzentrationen durch Bergbauaktivitäten freigesetzt, und Entsorgungs 7,8,10, obwohl die meisten Umweltkontamination durch schwere oder Edelmetalle ist ein fortlaufender Prozess vor allem durch technologische Aktivitäten verursacht. Dies führt zu einer erheblichen Störung der natürlichen Ökosysteme und könnte möglicherweise die menschliche Gesundheit gefährden 9. Die Kenntnis dieser negativen Ergebnisse fördert die Suche nach neuen Techniken, um Metalle aus kontaminierten Ökosystemen und Verbesserungen beim Recycling von Metallen aus industriellen Abwässern zu entfernen. Etablierte physikalisch-chemische Methoden wie Fällung oder Ionenaustausch sind nicht so effektiv, vor allem in der Hochly verdünnten Lösungen 7,8,11. Biosorption entweder mit lebenden oder toten Biomasse, ist eine attraktive Alternative für die Abwasserbehandlung 10,12. Die Verwendung solcher biologischer Materialien kann der Verbrauch von toxischen Chemikalien zu verringern. Viele Mikroorganismen beschrieben worden zu sammeln oder zu immobilisieren Metallen. Zum Beispiel Zellen der Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus) JG-A12 haben hohe Bindungskapazitäten für Edelmetalle, dargestellt beispielsweise Pd (II), Pt (II), Au (III) und anderen toxischen Metallen wie Pb (II) oder U (VI) 4,13, Zellen des Bacillus megaterium für Cr (VI) 14, Zellen von Saccharomyces cerevisiae für Pt (II) und Pd (II) 15 und Chlorella vulgäre zur Au (III) und U (VI) 16 , 17. Die Bindung von Metallen wie Au vorherigen (III), Pd (II) und Pt (II) wurde auch für Desulfovibrio desulfuricans 18 gemeldet und L. sphaericus JG-B53 19,20. Dennoch sind nicht all Mikroben binden große Mengen von Metallen und deren Anwendung als Sorptionsmaterial begrenzt 12,21. Weiterhin Metallbindungskapazität hängt von verschiedenen Parametern, beispielsweise Zell-Zusammensetzung, die verwendet Biokomponente oder Umwelt- und experimentellen Bedingungen (pH, Ionenstärke, Temperatur etc.). Das Studium der isolierten Zellwandfragmente 22,23, wie Membranlipiden, Peptidoglycan, Proteinen oder anderen Komponenten kann dabei die Metallbindungsverfahren komplexer aufgebaut ganzen Zellen 8,21 zu verstehen. Die Zellbestandteile in dieser Studie konzentrierte sich auf sind S-Layer-Proteine. S-Layer-Proteine ​​sind Teile der äußeren Zellhülle von vielen Bakterien und Archaebakterien, und sie machen etwa 15 bis 20% der Gesamtproteinmasse dieser Organismen. Wie die erste Schnittstelle für die Umwelt, diese Zell Verbindungen beeinflussen die Bakterien Sorptionseigenschaften 3. S-Schicht-Proteine ​​mit Molekulargewichten im Bereich von vierzigHunderte von kDa sind innerhalb der Zelle produziert, aber außerhalb montiert, wo sie in der Lage, Schichten auf den Lipidmembranen oder polymere Zellwandbestandteile bilden. Nach der Isolierung fast alle S-Layer-Proteine ​​die intrinsische Eigenschaft, sich spontan durch Selbstorganisation in Suspension, an Grenzflächen oder auf Oberflächen bilden ebene oder röhrenförmige Gebilde 3. Die Dicke der Proteinmonoschicht hängt von den Bakterien und ist in einem Bereich von 5 bis 25 nm 24. Im Allgemeinen können die gebildeten S-Layer-Protein-Strukturen eine schräge (P1 oder P2), quadratisch (p4) oder hexagonal (p3 oder P6) symmetrisch Gitterkonstanten von 2,5 bis 35 nm 3,24 haben. Die Gitterbildung scheint in vielen Fällen abhängig von zweiwertigen Kationen und hauptsächlich Ca 2+ 25,26, Raff, J. et al. S-Layer-basierte Nanokomposite für industrielle Anwendungen in Proteinbasis Engineered Nanostrukturen. (Hrsg Tijana Z. Grove &amp; Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (eingereicht)). Dennoch ist die vollständige Reaktionskaskade des Monomers Faltung Monomer-Monomer-Wechselwirkung, die Bildung eines Gitters, und die Rolle, die aus unterschiedlichen Metallen, insbesondere zweiwertigen Kationen, wie Ca 2+ und Mg 2+, noch nicht vollständig verstanden. Die Gram-positive Stamm L. sphaericus JG-B53 27 (von Bacillus sphaericus, nachdem neue phylogenetische Einordnung umbenannt) wurde aus dem Uranbergbau Halde &quot;Haberland&quot; (Johanngeorgenstadt, Sachsen, Deutschland) 4,28,29 isoliert. Seine Funktions S-Layer-Protein (SLP1) einen quadratischen Gitter, ein Molekulargewicht von 116 kDa 30 und eine Dicke von ≈ 10 nm an lebenden Bakterienzellen 31. In früheren Studien wurde die in vitro Bildung einer geschlossenen und stabilen Proteinschicht mit einer Dicke von etwa 10 nm in weniger als 10 min 19 erreicht. Die verwandten Stammes L. sphaericus JG- angezeigtA12, auch ein Isolat aus dem &quot;Haberland&quot; Haufen, besitzt eine hohe Metallbindungskapazitäten und seiner isolierten S-Schicht-Protein hat eine hohe chemische und mechanische Stabilität und gute Sorptionsraten für Edelmetalle wie Au (III) gezeigt, Pt (II), und Pd (II) 4,32,33. Diese Bindung von Edelmetallen ist mehr oder weniger spezifisch für bestimmte Metalle und hängt von der Verfügbarkeit der funktionellen Gruppen auf der äußeren und inneren Proteinoberfläche des Polymers und die in ihren Poren, der Ionenstärke und dem pH-Wert. Relevante funktionelle Gruppen für die Metall-Wechselwirkung durch die Proteine ​​sind COOH-, NH 2 -, OH-, PO 4 -, SO 4 - und SO. Grundsätzlich Metallbindungskapazitäten eröffnen ein breites Spektrum von Anwendungen, Raff, J. et al. S-Layer-basierte Nanokomposite für industrielle Anwendungen in Proteinbasis Engineered Nanostrukturen. (Hrsg Tijana Z. Grove &amp; Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (eingereicht)). zB als biosorptive Komponenten zur Entfernung oder Wiederherstellungvon gelösten toxischen oder wertvolle Metalle, Vorlagen für die Synthese oder definierte Abscheidung von regelmäßig strukturierten metallischen Nanopartikeln (NPs) für die Katalyse und andere Bio-engineered Materialien wie Bio-sensorischen Schichten 3,5,18,33. Regelmäßig angeordnet NP Arrays wie Au (0) -NPs könnte für große Anwendungen, die von der molekularen Elektronik und Biosensoren, Ultrahochdichte-Speichergeräte, und Katalysatoren für die CO-Oxidation 34-37 verwendet werden. Die Entwicklung solcher Anwendungen und intelligente Design dieser Materialien erfordert ein tieferes Verständnis der zugrundeliegenden Metallbindungsmechanismen. Eine Voraussetzung für die Entwicklung solcher Materialien auf biologischer Basis ist die zuverlässige Ausführung eines Schnittstellenschicht zwischen dem Biomolekül und der technische Oberfläche 38,39. Zum Beispiel Polyelektrolyte mit der Schicht-für-Schicht (LBL) Technik 40,41 zusammengebaut wurden als Zwischenschicht zur Rekristallisation von S-Layer-Proteine ​​39 verwendet wurden </sup&gt;. Eine solche Schnittstelle bietet eine relativ einfache Möglichkeit, die Proteinbeschichtung auf eine reproduzierbare und quantitative Weise auszuführen. Durch Durchführung verschiedener Experimente mit und ohne Modifikation mit Klebevermittler, ist es möglich, Aussagen über die Beschichtungs Kinetik, Schichtstabilität und die Interaktion von Metallen mit Biomolekülen 19,42, Raff, J. et al machen. S-Layer-basierte Nanokomposite für industrielle Anwendungen in Proteinbasis Engineered Nanostrukturen. (Hrsg Tijana Z. Grove &amp; Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (eingereicht)). Jedoch ist die komplexen Mechanismen der Proteinadsorption und Protein-Oberflächen-Wechselwirkung nicht vollständig verstanden. Vor allem Informationen über Konformation, Muster Orientierung und Beschichtungsdichten fehlt noch. Quarzmikrowaage mit Verlustüberwachung (QCM-D) Technik hat sich die Aufmerksamkeit in den letzten Jahren als ein Werkzeug für die Untersuchung der Proteinadsorption, Beschichtungs Kinetik und Interaktion pro zogenProzesse auf der Nanometerskala 19,43-45. Diese Technik ermöglicht die detaillierte Erfassung der Masse Adsorption in Echtzeit und kann als Indikator für das Protein selbst Montage und die Kopplung der funktionellen Moleküle auf Proteingitter 19,20,42,46-48 verwendet werden. Darüber hinaus öffnen QCM-D-Messungen die Möglichkeit, Metallwechselwirkungsprozesse mit der proteinhaltigen Schicht unter natürlichen biologischen Bedingungen zu studieren. In einer neueren Studie der Wechselwirkung des S-Layer-Protein mit ausgewählten Metallen wie Eu (III), Au (III), Pd (II) und Pt (II) wurde mit der QCM-D 19,20 sucht. Die adsorbierte Proteinschicht kann als vereinfachtes Modell eines Zellwand von gram-positiven Bakterien dienen. Die Untersuchung dieses einzelne Komponente kann zu einem tieferen Verständnis der Metall-Wechselwirkung beitragen. Allerdings wissen nur QCM-D-Experimente nicht Aussagen in Bezug auf Oberflächenstrukturen und Einflüsse von Metallen, um Protein zu ermöglichen. Andere Techniken sind notwendig, um diese Informationen zu erhalten. Eine postung für Abbildungs ​​bio-Nanostrukturen und Gewinnung von Informationen über Struktureigenschaften ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM). Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Sorption von Gold (Au (III) und Au (0) -NPs) bis S-Layer-Proteine ​​zu untersuchen, insbesondere SLP1 von L. sphaericus JG-B53. 5.0 Verwendung von ICP-MS und immobilisiert S-Schichten unter Verwendung von QCM-D - Experimente wurden mit suspendierten Proteine ​​auf Ansatzgröße in einem pH-Bereich von 2,0 durchgeführt. Zusätzlich wurde der Einfluß der Metallsalzlösung auf dem Gitter Stabilität mit anschließender AFM-Studien untersucht. Die Kombination dieser Techniken trägt zu einem besseren Verständnis der in-vitro-Metall-Interaktionsprozesse als Werkzeug für das Lernen mehr über Bindungsereignisse auf ganze Bakterienzellen in Bezug auf bestimmte Metall Affinitäten. Diese Erkenntnis ist nicht nur wichtig für die Entwicklung von anwendbaren Filtermaterialien zur Rückgewinnung von Metallen für den Umweltschutz und zur Erhaltung der WiederQuellen 49, sondern auch für die Entwicklung von hoch geordneten Arrays von metallischen Nanopartikeln für verschiedene technische Anwendungen.

<table><tbody><tr><td>Equipment und Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor, Steam In Place 70L Pilotanlage</td><td>Applikon Biotechnology, Niederlande</td><td>Z6X</td><td>Inklusive dO2, pH-Sensoren von Applikon Biotechnology und BioXpert Software V2</td></tr><tr><td>Nichtinvasiver Biomassemonitor BugEye 2100</td><td>BugLab, Concord (CA), USA</td><td>Z9X</td><td>---</td></tr><tr><td>Spektrometer Ultrospec 1000</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Großbritannien</td><td>80-2109-10</td><td>Unternehmen jetzt GE Healthcare Life Sciences</td></tr><tr><td>MiniStar Mikrozentrifuge</td><td>VWR, Deutschland</td><td>521-2844</td><td>Zur Zentrifugation von Kultivierungsproben</td></tr><tr><td>Forschungssystemmikroskop BX-61</td><td>Olympus Germany LLC, Deutschland</td><td>037006</td><td>Mikroskop in Kombination mit der Bildgebungssoftware</td></tr><tr><td>Cell^P (Version 3.1)</td><td>Olympus Soft Imaging Solutions LLC, M&uuml; nster, Deutschland</td><td>---</td><td>zusammen mit Mikroskop</td></tr><tr><td>Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S</td><td>Carr Centritech, Florida, USA</td><td>9010PLT</td><td>Für die Biomasseernte</td></tr><tr><td>T18 basic Ultra Turrax</td><td>IKA Labortechnik, Deutschland</td><td>431-2601</td><td>Für die Geißelentfernung und Probenhomogenisierung</td></tr><tr><td>Sorvall Evolution RC Superspeed Zentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>728411</td><td>Wird bei der Proteinisolierung</td></tr><tr><td>verwendet Mobiler High-Shear-Fluid-Prozessor, M-110EH-30 Pilot</td><td>Microfluidics, Massachusetts, USA</td><td>M110EH30K</td><td>Wird für die Zellruptur</td></tr><tr><td>verwendet Alpha 1-4 LSC Gefriertrockner</td><td>Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Deutschland</td><td>102041</td><td>---</td></tr><tr><td>UV-VIS Spektrophotometrie (NanoDrop 2000c)</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>91-ND-2000C-L</td><td>Zur Bestimmung von Proteinen Konzentration</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN vertikale Elektrophoresekammer</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland</td><td>165-3322</td><td>Für SDS-PAGE</td></tr><tr><td>VersaDoc Imaging System 3000</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland</td><td>1708030</td><td>Zur Bildgebung von SDS-PAGE-Gelen</td></tr><tr><td>ICP-MS Elan 9000</td><td>PerkinElmer, Waltham (MA), USA</td><td>N8120536</td><td>Zur Bestimmung der Metallkonzentration</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Instruments, Worcestershire, Vereinigtes Königreich</td><td>ZEN3600</td><td>Zur Bestimmung der Nanopartikelgröße</td></tr><tr><td>Q-Sense E4 Gerät&nbsp;</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Schweden</td><td>QS-E4</td><td>bestellt über LOT quantum design (Software im Lieferumfang der E4-Plattform enthalten)</td></tr><tr><td>Q-Soft 401 (Datenaufzeichnung)</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Schweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Tools 3 (Datenauswertung und -modellierung)</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Schweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QCM-D Strömungsmodule QFM&nbsp; 401&nbsp;</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Schweden</td><td>QS-QFM401</td><td>bestellt über LOT quantum design</td></tr><tr><td>QSX&nbsp; 303 SiO2 piezoelektrische AT-Cut Quarzsensoren</td><td>Q-Sense AB, Göteborg, Schweden</td><td>QS-QSX303</td><td>bestellt über LOT quantum design</td></tr><tr><td>Ozonreinigungskammer</td><td>Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA</td><td>QS-ESA006</td><td>bestellt über LOT quantum</td></tr><tr><td>design Rasterkraftmikroskop MFP-3D Bio AFM</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA</td><td>MFP-3DBio</td><td>AFM Mess- und Bildgebungssoftware</td></tr><tr><td>Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA</td><td></td>---<td>Imaging-Software in Cat. Nein. MFP-3DBio</td></tr><tr><td>Igor Version Pro 6.3.2.3 Software</td><td>WaveMetrics, Inc., USA</td><td></td>---<td>Imaging Software in Cat. Nein. MFP-3DBio</td></tr><tr><td>BioHeater</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA</td><td>Bioheater</td><td>Probenheizer für AFM-Messungen</td></tr><tr><td>Biolever mini Cantilever,&nbsp; BL-AC40TS-C2</td><td>Olympus Germany LLC, Deutschland</td><td>&nbsp; BL-AC40TS-C2</td><td>Bevorzugter Ausleger für AFM-Messungen</td></tr><tr><td>WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)</td><td>Nanotec Electronica S.L. , Spanien</td><td>Freeware-Software</td><td>für die AFM-Analyse</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalognummer</td><td>><Kommentare</td></tr><tr><td>Reinigungsmittel und andere Geräte </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>saure Säure, 100 %, p.A.</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3738.5</td><td>Gefährliche, entzündbare und ätzende Flüssigkeiten und Dämpfe. Verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden.</td></tr><tr><td>Antischaum 204</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>A6426</td><td>Zur Schaumunterdrückung</td></tr><tr><td>Bromphenolblau, Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>B5525</td><td>---</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3862.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Desoxyribonuklease II aus Schweinemilz</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>D4138</td><td>Typ IV , 2.000 - 6.000&nbsp; Kunitz Einheiten/mg</td></tr><tr><td>Protein Ethanol, 95%</td><td>VWR, Deutschland</td><td>20827.467</td><td>Gefahr, brennbares</td></tr><tr><td>Glycerin, p.A.</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3783.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Guanidinhydrochlorid (GuHCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>0037.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma GmbH & Co. KG</td><td>9-307-011-4-507</td><td>---</td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl) (37%)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>4625.2</td><td>Gefahr; Korrosiv, wird zur pH-Einstellung</td></tr><tr><td>Lysozym aus Hühnereiweiß</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC verwendet.</td><td>Nr. L6876&nbsp;</td><td>Lyophilisiertes Pulver, Protein = 90 %, = 40.000 Einheiten/mg Protein (Sigma)</td></tr><tr><td>Magnetrührer mit Heizung&nbsp; MR 3000K</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Deutschland</td><td>504.10100.00</td><td>Standardrührer im Experiment</td></tr><tr><td>NB-Media DM180</td><td>Mast Diagnostica GmbH</td><td>121800---</td><td></td></tr><tr><td>Salpetersäure (HNO3)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>HN50.1</td><td>Gefahr; oxidierende, korrosierende</td></tr><tr><td>PageRuler Ungefärbte Proteinleiter</td><td>ThermoScientific-Pierce</td><td>26614---</td><td></td></tr><tr><td>Poly(sodium 4-styrolesulfonat) (PSS)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>243051</td><td>durchschnittlichen Mw ~70.000</td></tr><tr><td>Polyethylenimin (PEI), verzweigte</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>408727</td><td>Warnung; Schädlich, reizend, gefährlich für die Umwelt; durchschnittlich Mw ~25.000</td></tr><tr><td>Kaliumcarbonat wasserfrei (K2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>60108</td><td>Warnung; Schädliche</td></tr><tr><td>Ribonuklease A aus der Bauchspeicheldrüse des Rinders</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>R5503</td><td>Typ I-AS, 50 - 100 Kunitz Einheiten/mg Protein</td></tr><tr><td>Natriumazid (NaN3)</td><td>Merck KGaA</td><td>106688</td><td>Gefahr; sehr giftig und umweltgefährlich</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3957.2</td><td>---</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>L-5750</td><td>Gefahr; giftiges</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>6771.1</td><td>Gefahr; Korrosiv, zur pH-Regulierung in der Kultivierung und zur pH-Einstellung</td></tr><tr><td>Spectra/Por 6, Dialysemembran, MWCO 50.000&nbsp;</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>1893.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Schwefelsäure (H2SO4)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>HN52.2</td><td>Gefahr; Korrosiv, wird zur pH-Regulierung in der Kultivierung</td></tr> von <tr><td>Tanninsäure (C76H52O46)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC verwendet.</td><td>16201</td><td>---</td></tr><tr><td>TRIS HCl (C4H11NO3HCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>9090.2</td><td>---</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3051.3</td><td>Warnhinweis; Schädlich, gefährlich für die Umwelt</td></tr><tr><td>VIVASPIN 500, 50.000 MWCO Ultrafiltrationsrohre</td><td>Sartorius AG</td><td>VS0132---</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>M6250</td><td>Gefahr, giftig</td></tr></tbody></table>

au-wechselwirkung von slp1 polymere und monolayer aus<em&gt; lysinibacillus sphaericus</em&gt; jg-b53 - qcm-d, icp-ms und afm als werkzeuge für biomolekül-metallforschung

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

In dieser Veröffentlichung wird das Goldsorptionsverhalten von Oberflächenschichtproteinen (Slp1) von Lysinibacillus sphaericus JG-B53 beschrieben. Diese Biomoleküle ordnen sich in parakristallinen zweidimensionalen Anordnungen auf Oberflächen an, binden Metalle und sind somit für verschiedene biotechnische Anwendungen interessant, wie z.B. biosorptive Materialien zur Entfernung oder Rückgewinnung verschiedener Elemente aus der Umwelt und industrielle Prozesse. Die Abscheidung von Au(0)-Nanopartikeln auf S-Schichten, entweder durch S-Schicht-gerichtete Synthese 1 oder Adsorption von Nanopartikeln, eröffnet neue Möglichkeiten für vielfältige sensorische Anwendungen. Obwohl zahlreiche Studien die biosorptiven Eigenschaften der S-Schichten 2-5 beschrieben haben, bleibt ein tieferes Verständnis der Protein-Protein- und Protein-Metall-Wechselwirkung immer noch eine Herausforderung. In der folgenden Studie wurde die induktiv gekoppelte Massenspektrometrie (ICP-MS) zur Detektion der Metallsorption durch suspendierte S-Schichten eingesetzt. Dies wurde mit Messungen der Quarzkristall-Mikrowaage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D) korreliert, die den Online-Nachweis der Bildung und Metallabscheidung von proteinhaltigen Monolagen und damit ein detaillierteres Verständnis der Metallbindung ermöglicht.
Die ICP-MS-Ergebnisse zeigten, dass die Bindung von Au(III) an die suspendierten S-Schicht-Polymere pH-abhängig ist. Die maximale Bindung von Au(III) wurde bei pH 4,0 erreicht. Die QCM-D-Untersuchungen ermöglichten den Nachweis der Au(III)-Sorption sowie die Abscheidung von Au(0)-NPs in Echtzeit während der in situ Experimente. Darüber hinaus konnte mit dieser Methode der Einfluss der Metallbindung auf die Proteingitterstabilität von Slp1 untersucht werden. Die strukturellen Eigenschaften und die Stabilität der Proteinschicht konnten direkt nach dem QCM-D-Experiment mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie (AFM) sichtbar gemacht werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination dieser verschiedenen Methoden ein tieferes Verständnis der Metallbindung durch bakterielle S-Schicht-Proteine in Suspension oder als Monoschichten auf Bakterienzellen oder rekristallisierten Oberflächen ermöglicht.

Kultivierung von Mikroorganismen und SLP1 Charakterisierung Die aufgezeichneten Daten des Bakterienwachstums zeigt das Ende der exponentiellen Wachstumsphase bei etwa 5 Stunden. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass SLP1 können von diesem Zeitpunkt der Ernte (4,36 g / L nasser Biomasse (≈ 1,45 g / L (BDW)) mit einer maximalen Ausbeute 19 isoliert werden. Dennoch Optimierung der Kultivierung mit...

Um grundlegende Informationen über die Sorption und das Recycling von Gold aus wässrigen Systemen zu erhalten, wurde die Wechselwirkung von Au(III)- und Au(0)-Nanopartikeln auf S-Schicht-Proteinen untersucht. Die Sorption von Proteinpolymeren wurde mittels ICP-MS und die von proteinhaltigen Monolayern mit QCM-D untersucht. Ein anschließendes AFM ermöglicht die Abbildung der Nanostrukturen.

Au-Wechselwirkung von SLP1 Polymere und Monolayer aus<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS und AFM als Werkzeuge für Biomolekül-Metallforschung

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, das Goldsorptionsverhalten von S-Schicht-Proteinen des vorgestellten Bakterienstamms aus ökologischer und technologischer Sicht zu untersuchen. Diese Methoden können zentrale Fragen in umweltbezogenen wissenschaftlichen Bereichen beantworten, wie beispielsweise in den Feldern der Sorptionsprozesse sowie der Entfernung und Rückgewinnung von Metallen. Der Hauptvorteil dieser Techniken liegt darin, dass Sie Metallsorption und Nanopartikeladsorption in einem anderen Größenbereich nachweisen können.Mithilfe der QCM-D ist es möglich, dies in einer Echtzeitmessung nachzuweisen. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie die Fluidzellen mit Sensordummies ausstatten. Pumpen Sie mindestens 20 Milliliter pro Modul eines 2 %igen alkalischen flüssigen Reinigungsmittels in ultrareinem Wasser durch das QCM-D- und Schlauchsystem. Danach eine fünffache Menge pro Modul an ultrareinem Wasser gemäß Herstellervorschrift mit einer Flussrate von bis zu 300 Mikrolitern pro Minute durch das System pumpen. Die Siliziumdioxidsensoren außerhalb der Durchflussmodule durch Inkubation in einer 2%igen Natriumdodecylsulfatlösung mindestens 20 Minuten lang reinigen. Anschließend die Sensoren mehrmals mit ultrareinem Wasser spülen.Nachdem die Kristalle mit gefilterter Druckluft getrocknet wurden, bringen Sie sie 20 Minuten lang in eine Ozonreinigungskammer. Danach wiederholen Sie den Reinigungsvorgang zweimal, um alle organischen Bestandteile zu entfernen. Um gebundene Metalle von der Sensorsoberfläche zu entfernen, spülen Sie die Sensoren mit einmolarer Salpetersäure ab.Anschließend spülen Sie die Sensoren mehrmals mit ultrareinem Wasser ab. Danach modifizieren Sie die Sensoren durch Tauchbeschichtung mit abwechselnden Schichten von Polyethylenimin und Polystyrolsulfonat in einer Konzentration von drei Gramm pro Liter, und zwar mittels der Schicht-für-Schicht- oder LBL-Technik. Legen Sie die Sensoren in die entsprechende Polyelektrolytlösung in Deep-Well-Platten und inkubieren Sie diese 10 Minuten bei Raumtemperatur.Entfernen Sie anschließend die Sensoren aus der Polyelektrolytlösung und spülen Sie sie zwischen jedem Tauchbeschichtungsschritt intensiv mit ultrareinem Wasser ab. Sobald die externe Modifizierung abgeschlossen ist, platzieren Sie die Sensoren im Durchflussmodul. Äquilibrieren Sie die Sensoren, indem Sie sie vor Beginn der Experimente mit ultrareinem Wasser spülen.Lösen Sie an dieser Stelle zuvor isoliertes und gereinigtes Slp1 in Formelharnstoff auf, um die Polymere in Monomere umzuwandeln. Zentrifugieren Sie die monomerisierten Proteine bei 15.000 × g und 4 °C eine Stunde lang, um größere Proteinagglomerate zu entfernen. Mischen Sie das solubilisierte und zentrifugierte Slp1-Supernatant mit Rekristallisationspuffer, um eine endgültige Protein-Konzentration von 0,2 Gramm pro Liter zu erreichen.Nach erfolgreicher Proteinumkristallisation auf den mit Polyelektrolyten modifizierten Sensoren innerhalb der Flussmodule spülen Sie die beschichteten Sensoren intensiv mit Umkristallisationspuffer bei einer Flussrate von 125 Mikrolitern pro Minute, bis stabile Werte von Frequenz- und Dissipationsänderungen erfasst werden. Nach erfolgreicher Beschichtung mit Slp1 in den Flussmodulen spülen Sie die erhaltene Slp1-Schicht intensiv mit 1,6 Millimolar Citratpuffer, pH 5,0, bis stabile Werte von Frequenz- und Dissipationsänderungen erfasst werden. Als Nächstes pumpen Sie eine zuvor hergestellte einmillimolare Nanopartikellösung mit einer Flussrate von 125 Mikrolitern pro Minute in die Flussmodule.Verfolgen Sie anschließend die Massenadsorption an die Slp1-Schicht. Nach Abschluss der Wechselwirkung mit den Metallnanopartikeln spülen Sie die Schicht mit nanopartikelfreier Pufferlösung, um schwach gebundene Metalle oder Nanopartikel zu entfernen. Nehmen Sie Bilder in Flüssigkeit mithilfe eines Atomkraftmikroskops oder AFM in Kombination mit einem invertierten optischen Mikroskop direkt auf den beschichteten QCM-D-Sensoren unter Verwendung von ultrareinem Wasser auf.Spülen Sie die Sensoren nach den QCM-D-Experimenten mit ultrareinem Wasser und platzieren Sie sie in der AFM-Flüssigkeitszelle. Verwenden Sie einen Cantilever mit einer Resonanzfrequenz von etwa 25 Kilohertz in Wasser und einer Steifigkeit von weniger als 0,1 Newton pro Meter. Stellen Sie die Abtastgeschwindigkeit zwischen 2,5 und 10 Mikrometern pro Sekunde ein.Nehmen Sie Bilder im dynamischen Kontaktmodus auf, während der Cantilever durch ein Piezo bei seiner Resonanzfrequenz angeregt wird. Bestimmen Sie schließlich den Abstand des Cantilevers zur Oberfläche anhand der Schwingungsdämpfung. Die maximalen Metallbindungs­kapazitäten von Gold drei durch suspendiertes Slp1 zeigen, dass es während der 24-stündigen Inkubation im untersuchten pH-Bereich stabil gebunden war.Die unmittelbare Abnahme der Frequenz weist auf eine schnelle Adsorption und eine hohe Affinität der Proteine zur polyelektrolytmodifizierten Oberfläche hin. Die Dissipation nimmt ebenfalls sofort zu, was auf eine Adsorption viskoelastischer Moleküle an der Oberfläche schließen lässt, da eine schnelle Dämpfung zu steigenden Dissipationswerten führt. Vorsynthetisierte goldene Null-Nanopartikel wurden mit Slp1 inkubiert und mittels SDS-PAGE analysiert, was die QCM-D-Daten bestätigte und zeigte, dass die Nanopartikel die Slp1-Struktur nicht stören.Die Adsorption von präsynthetisierten metallischen Gold-Null-Nanopartikeln wird für QCM-D-Experimente in Delta-F-Delta-D-Diagrammen sowie als Dicke- und Massenprofile dargestellt. Das Proteinlattice von Slp1, das auf mit Polyelektrolyten modifizierten Sensoren rekristallisiert wurde, ist hier gezeigt. Die Gitterkonstante wurde zu 13 bis 14 Nanometern bestimmt und die Schichtdicke betrug 10 ± 2 Nanometer.AFM-Studien bestätigten, dass nach der Gold-drei-Wechselwirkung das Slp1-Lattice vollständig intakt blieb, was die QCM-D-Ergebnisse bestätigt, die die Stabilität der Beschichtung vorhergesagt hatten. Die AFM verifiziert die Adsorption von Gold-Null-Nanopartikeln auf dem Slp1-Lattice, jedoch folgen diese aufgrund ihrer Partikelgröße nicht der p4-Symmetrie von Slp1. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb eines Arbeitstages durchgeführt werden.Mit diesen Methoden können weitere Techniken wie die Infrarotspektroskopie oder die Helium-Ionen-Mikroskopie angewendet werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise bezüglich spezifischer Bindungsstellen oder der Wechselwirkung mit Gold oder Goldnanopartikeln. Die vorgestellte Technik ebnete den Weg dafür, dass Uzrachem die Wechselwirkungen von Biomolekülen mit Metallen untersuchen kann, sowie beispielsweise das Adsorptions- und Desorptionsverhalten auf unterschiedlichen Oberflächen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Wechselwirkungen von Metallen mit biologischen Lösungsmitteln untersucht. Bitte vergessen Sie beim Anwenden dieser Methode nicht, Schutzbrille, Laborkittel und natürlich auch Handschuhe zu tragen.

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Chemie

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Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Systemen des Cellulosom mit AFM-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Ein Protokoll zur kovalenten Kopplung einer Vielzahl von Einzelmolekülen an eine AFM-Spitze wird vorgestellt. Es werden Verfahren und Beispiele zur Bestimmung der Adhäsionskraft und freien Energie dieser Moleküle auf festen Trägern und Bio-Grenzflächen vorgestellt.

Untersuchung von Einzelmolekül Haftung durch Rasterkraftspektroskopie

Wir beschreiben die Herstellung und Charakterisierung nanobiologischer Systeme, indem wir nanostrukturierte Substrate mit immobilisierten Proteinen und Aptameren verbinden. Die relevanten experimentellen Schritte, die die lithographische Herstellung nanostrukturierter Substrate, die Biofunktionalisierung und die charakterisierte oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS) umfassen, werden berichtet. Die SERS-Detektion von oberflächenimmobilisierten Proteinen und die Untersuchung der...

Oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie Detektion von Biomolekülen Mit EBL Fabricated nanostrukturierte Substrate

Die Herstellung von proteinfunktionalisierten planaren glasgestützten Lipiddoppelschichten, die Bestimmung der Proteinmobilität innerhalb und die Messung von Proteindichten wird hier gezeigt. Es wird eine Roadmap zum Bau eines rauschreduzierten Totalreflexionsmikroskops skizziert, das die Visualisierung von in einzelnen Doppelschichten residenten Fluorochromen mit hoher raumzeitlicher Auflösung ermöglicht.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

Diese Arbeit stellt ein Protokoll für die Flüssigkeitshandhabung und Probenaufgabe zu einem Mikrokanal zur in situ-Time-of-Flight-Sekundärionen-Massenspektrometrie-Analyse von Protein Biomolekülen in einer wässrigen Lösung.

In-situ-Charakterisierung von Hydrated Proteine ​​in Wasser durch SALVI und TOF-SIMS

Wir stellen ein Protokoll Glas mit nanometrischer Proteinflecken von einem Fluid Lipiddoppelschicht umgeben funktionalisieren. Diese Substrate sind kompatibel mit den fortschrittlichen optischen Mikroskopie und sollen als Plattform für die Zelladhäsion und Migration Studien dienen.

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Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Montage und Demontage der Biolayer Interferometrie (BLI) mit Milzbrand-Toxin zu überwachen. Nach Montage/Demontage auf der Biosensor-Oberfläche sind von der Oberfläche zur Visualisierung und Identifikation von Komponenten der komplexe mit Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie, bzw. die große Proteinkomplexe veröffentlicht.

Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt die kovalente Immobilisierung von Proteinen mit einer Heterobifunctional Silan Haftvermittler auf Siliziumoxid Oberflächen für die atomic Force Mikroskopie basierend Einzelmolekül Kraft Spektroskopie entwickelt die am Beispiel der Interaktion von RrgA (Pilus-1 Tipp adhäsin des Streptococcus Pneumoniae) mit Fibronektin.

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

Hier stellen wir ein Protokoll zur Konjugierung von Proteinmonomer durch Enzyme vor, die Proteinpolymere mit einer kontrollierten Sequenz bilden, und immobilisieren es auf der Oberfläche für Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Studien.

OaAEP1-Vermittelte enzymatische Synthese und Immobilisierung von polymerisiertem Protein für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

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Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen

Erfahren Sie die Gold-Sorption durch S-Layer-Proteine von Lysinibacillus sphaericus JG-B53 mittels QCM-D, ICP-MS und AFM in Echtzeit. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Biomolekül-Metall-Wechselwirkungen.

Au-Wechselwirkung von SLP1 Polymere und Monolayer aus Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS und AFM als Werkzeuge für Biomolekül-Metallforschung (Video) | JoVE Journal

Au-Wechselwirkung von SLP1 Polymere und Monolayer aus

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