Name: Induktion einer Isoelektrischer Gehirn Staat die Auswirkungen der Endogene synaptische Aktivität auf neuronaler Erregbarkeit zur Untersuchung In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Erfahren Sie die Induktion eines isolektrischen Hirnzustands zur Untersuchung neuronaler Eigenschaften ohne synaptische Eingänge in vivo. Diese Methode ermöglicht intrazelluläre Aufzeichnungen von Einzelneuronen bei Ratten.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus der Fondation de France unterstützt, das Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale, der Pierre &amp; Marie Curie Universität und das Programm &quot;Investissements d&#39;avenir&quot; ANR-10-IAIHU-06.

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Europäischen Union (Richtlinie 2010/63 / EU) und genehmigt von der Charles Darwin Ethikkommission für Tierversuche durchgeführt. Wir beschreiben hier das Verfahren, das wir routinemäßig in unserem Labor verwenden, jedoch können die meisten Schritte angepasst werden jeden spezifischen Bedürfnisse angepasst. 1. Chirurgische Vorbereitung Hinweis: Alle Einschnitt und Druckstellen sollten immer wieder mit einem Lokalanästhetikum (Lidocain oder Bupivacain) infiltriert werden. Das vorliegende Verfahren ist ein Terminal aus, eine aseptische Zubereitung ist, sollten umgesetzt werden, um mehrere Änderungen erforderlich. <ol><li> Anästhesieren eine Ratte mit Natriumpentobarbital (40 mg / kg) und Ketamin (50 mg / kg) in zwei örtlich getrennten intraperitoneale (IP) Injektionen. </li><li> Lassen Sie das Tier in Narkose gehen und immer wieder überprüfen, ob eine chirurgische Ebene der Anästhesie (keine Reaktion auf Zehen Kneifen) erreicht wird. Legen Sie die Ratte auf einem feedback Heizdecke und legen Sie eine rektale Sonde Kerntemperatur um 37 ° C zu halten. </li><li> Platzieren eines Katheters in die Bauchhöhle zu erleichtern anschließende Injektion von Anästhetika und zu vermeiden Organe durch wiederholte Nadeleinstiche 30 zu perforieren. <ol><li> Clip das Haar über eine kleine (~ 2 - 3 mm) Bereich oberhalb einer Region innerhalb der Magen des unteren rechten oder linken Quadranten. Hinweis: Enthaarungscreme auch verwendet werden können. </li><li> Machen Sie eine 2 - 3 mm Schnitt auf der Haut mit einer scharfen Schere oder einem Skalpell. Mit stumpfen Dissektion, entfernen Fett und Muskelschichten, bis die Bauchhöhle beobachtet wird. </li><li> Legen Sie ca. 1 - 2 cm die eines kleinen Katheters in den Hohlraum ein und schließen Sie die Wunde mit chirurgischen Klebstoff. (. ZB 2 Französisch - das entspricht 0.043 mm Innendurchmesser): Hinweis : Der Durchmesser und die Gesamtlänge des Katheters sollte minimal sein Totvolumen zu reduzieren. Polyurethan-Schläuche sind am besten geeignet. </li><li> Machen Sie eine Schleife und Naht ter Katheter an der Haut es an Ort und Stelle zu sichern. </li></ol></li><li> Installieren Sie einen Trachealtubus Belüftung während der künstlichen Beatmung zu steuern. <ol><li> Wie für den vorherigen Schritt, bereiten den Bereich von Interesse (1 - 2 cm über die Luftröhre direkt über dem Manubrium), entfernen Sie das Haar und die Haut einzuschneiden. </li><li> Blunt die ersten Schichten von Fett und Muskeln zu sezieren, dann die Speicheldrüse zur Seite schieben und die Luftröhre aussetzen, indem Sie vorsichtig die letzte Schicht der Muskeln zu sezieren. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Gewebe über die Trachea und schieben Sie einen Faden darunter kleine Pinzette. Machen Sie einen Knoten des Chirurgen mit dem Faden, aber nicht eng es noch nicht. </li><li> Inzision in die Luftröhre quer zwischen zwei knorpeligen Ringen. Swab Blut in die Trachea, falls vorhanden. </li><li> Legen Sie eine Trachealtubus mit dem entsprechenden Durchmesser und ziehen Sie die Knoten des Threads das Rohr stetig zu sichern. Für zusätzliche Stabilität kann der Faden weiter an einem höheren Punkt des Endotrachealtubus angebracht werden. </li><li> Suture die Wunde zu schließen oder chirurgische Klammern verwenden. Vermeiden chirurgische Kleber hier, wenn der Trachealtubus wiederverwendet werden soll. </li></ol></li><li> Installieren Sie das Tier in einem stereotaktischen Rahmen und sorgfältig die folgenden physiologischen Variablen überwachen: ECoG, SpO 2, EtCO 2, Herzfrequenz (über ein Elektrokardiogramm, EKG) und Innentemperatur. Monitor ein und stellen diese Variablen eine richtige Tiefe der Anästhesie und physiologischen Zustand zu halten. Insbesondere ergänzen Anästhesie mit einer kleinen Dosis (10 mg / kg) Natrium-Pentobarbital, falls erforderlich. </li><li> Bewerben Augensalbe auf beiden Augen Austrocknung zu vermeiden. Clip das Haar auf der Kopfhaut, ein Längsschnitt machen (~ 2 cm) und resect das Bindegewebe über dem Schädel mit einem Skalpell oder einem scharfen Löffel verwenden. </li><li> Machen Sie eine kleine (~ 1,5 mm Durchmesser) Kraniotomie über die Region von Interesse mit einem Zahnbohrer. Anmerkung: Hier wird das Fass Feld des primären somatosensorischen Kortex gezielte (7 - 8 mm ventral der interauralen Linie, 4.5- 5,5 mm lateral zur Mittellinie 31). Spülen wiederholt Wärme abzuführen. </li><li> Seien Sie besonders feinen Pinzette vorsichtig ein kleines Loch in der Dura zu machen. Reservieren Sie sich einen ~ 0,5 mm-Bereich innerhalb der Schädel Trepanation die ECoG-Elektrode zu platzieren (siehe nächster Schritt). Dauerhaft halten die Rinde feucht mit 0,9% NaCl-Lösung (oder künstliche Zerebrospinalflüssigkeit). </li><li> Legen Sie eine niedrige Impedanz (~ 60 kOhm) Silberelektrode (die ECoG-Elektrode) auf der Dura, die kortikale Region vermieden wird nicht von den Meningen bedeckt, und legen Sie die Referenzelektrode auf einem Kopfhaut Muskel auf der anderen Seite des Kopfes. </li><li> In dieser Phase (30 min nach der letzten Injektion Natriumpentobarbital) Aufrechterhaltung der Anästhesie durch wiederholte Injektionen von Natriumpentobarbital (10-15 mg / kg / h) oder Fentanyl (3-6 ug / kg / h) über den Katheter IP. Erstere führt zu einem langsamen Schwingungs, schlafähnlichen, ECoG Muster während letztere in einem desynchronisierenden Wach-like, kortikale Profil führen. </li><li> Stellen Sie die künstliche vLüftungstechnisches System , so dass die Atemfrequenz und das Volumen sind ähnlich denen der spontanen Atmung der Ratte (Normalbereich 70-115 Atem / min 32). Verbinden Sie dann die mechanische Belüftung des Trachealtubus und überprüfen Sie die richtige Brustkorb Inflation (auf beiden Seiten). Falls nicht, stellen Sie die Position des Belüftungsschlauch in der trachealen Achse. Falls erforderlich, saugen die Sekretion in die Trachea mit einem Katheter nach oben mit einer Spritze oder einer Vakuumpumpe. </li><li> Wenn alle physiologischen Variablen 32-35 und ECoG 29,36 Muster eine stabile chirurgische Ebene der Anästhesie zu reflektieren, in jedem Schenkel eine intramuskuläre Injektion von Gallamin Triethiodid tun , um die Ratte zu paralysieren, 40 mg / kg für die erste Injektion und dann 20 mg / kg , jede 2hr 19,29,36,50. </li></ol> 2. intrazellulärer Recordings <ol><li> Ziehen Sie ein Glas-Mikropipette (scharfe Mikroelektrode) mit einem ~ 0,2 &amp; mgr; m Spitze, wie seine Widerstandsbereiche between 50 und 80 MOhm einmal mit 2 M Kaliumacetat (KAc) gefüllt ist. </li><li> Platzieren Sie die Pipette in einem bestimmten Halter mit einer Silber / Silberchlorid (Ag / AgCl) Draht, der die Pipettenlösung zu einem intrazellulären Verstärker anschließen (über einen Kopfstufe). Der Halter sollte an einem Mikromanipulator angebracht werden. Legen Sie eine Ag / AgCl-Referenzelektrode auf der Nackenmuskulatur der Ratte. </li><li> einfügen langsam die Pipette in das Gehirn bis in die Region von Interesse und überprüfen ihren Widerstand durch Überwachen der Spannung fällt in Reaktion auf Stromstufen. Verwenden Sie die Summen (oder zappen) Taste des Verstärkers mit der Pipette zu löschen, wenn nötig. </li><li> Verwenden Sie Wattestäbchen oder synthetischen Absorptionsdreiecke die Kraniotomie trocknen (darauf achten, nicht die ECoG oder intrazelluläre Elektroden zu berühren), bevor sie mit Silikon-Elastomer oder 4% igen Abdeckung Gehirn Bewegungen zu reduzieren. </li><li> Senken Sie die Pipette in 1 bis 2 &amp; mgr; m Schritte, bis sein Widerstand zunimmt, wenn eine Zelle nähert. Dann nutzen Sie die Summenfunktion des Verstärkers penetrate in das Neuron. </li></ol> 3. Induce den isoelektrischen Zustand <ol><li> Führen Sie die entsprechende experimentelle Protokoll (zB Antworten Brennen intrazellulär injizierten Ströme, Strom-Spannungs - Beziehungen, Sinnesreize Antworten) in diesem Stadium , während gleichzeitig das Membranpotential des Neurons Überwachung, die ECoG und die physiologischen Variablen. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die intrazelluläre Elektrode in der Zelle stabil ist durch die Stetigkeit der Analyse sowohl das Membranpotential und das Aktionspotential Eigenschaften während der Aufnahme-Session. Wenn nicht, gehen Sie nicht auf den nächsten Schritt, und warten Sie, bis die Aufzeichnung wieder stabil wird oder nach einem anderen Neuron suchen. </li><li> Spritzen Sie einen hohen, aber infra letalen Dosis von Natrium-Pentobarbital (~ 90 mg / kg, kann so niedrig wie 35 mg / kg von der Pentobarbital ursprünglichen Zustand sein und bis zu 155 mg / kg von der Fentanyl Anfangsbedingung) über die IP-Leitung. Hinweis: Innerhalb von 15 bis 20 min die intrazelluläre und ECoG waveforms sollte mit intermittierender elektrischer Schweigen verlangsamen übergangsweise die so genannte &quot;Burst-Unterdrückung&quot; Profil 37,38 zu erreichen, die schrittweise zu einem vollständigen isoelektrischen Zustand zusammenbricht. Es wird erwartet , dass die Herzfrequenz verlangsamt sich deutlich (von ~ 10 - 20%) , aber die SpO 2 und EtCO 2 sollte relativ stabil bleiben. </li><li> Wenn der isoelektrischen Zustand nicht erreicht ist, zu injizieren, eine kleine Menge von Natrium-Pentobarbital (~ 10% der Schritt 3.1 Dosis). Warten Sie 15 Minuten vor mehr Betäubung, wenn der isoelektrischen Zustand Zugabe wird noch nicht erreicht. </li><li> Wiederholen Sie das Versuchsprotokoll die Auswirkungen der Netzwerk-Dynamik auf dem aufgezeichneten Neurons integrativen Eigenschaften zu vergleichen. Hinweis: Nach Beendigung der Narkose Injektionen sollte die elektrische Gehirnaktivität vollständig innerhalb von 3 bis 4 Stunden erholen. </li><li> Am Ende des Experiments, injizieren einer letalen Dosis von Natrium-Pentobarbital (200 mg / kg, IP), um die Ratte euthanize. </li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir beschreiben hier eine neue Methode in vivo spontanen zerebralen elektrischen Aktivität zu unterdrücken sowohl auf Netzwerk und zellulärer Ebene. Dieses Verfahren führt zu einem extremen Zustand des Gehirns, bekannt als isoelektrischen komatösen 41. Aus klinischer Sicht ein solches electrocerebral Inaktivität ist die schwerste Abnormalität, die auf dem EEG zu sehen ist. Es ist vor allem mit einem irreversiblen Koma, bei allen Patienten in Zusammenhang gebracht , entweder zu sterben oder in einem W...

In Abwesenheit von irgendwelchen Umweltreize oder Verhaltens Aufgaben erzeugt der &quot;Ruhe&quot; brain einen kontinuierlichen Strom der elektrischen Aktivität, die von der Kopfhaut aufgenommen werden kann, wie elektroenzephalographischen (EEG) Wellen. Die intrazelluläre Korrelat dieser endogenen Hirnaktivität wird durch Hintergrundmembranspannungsschwankungen (auch bekannt als &quot;synaptischen Rauschen&quot;) aus, die aus einer Kombination von erregenden und hemmenden synaptischen Potentiale zusammengesetzt sind, die die laufende Tätigkeit der zuführenden Netzwerke 1,2 reflektieren. Diese spontane Aktivität variiert in Frequenz und Amplitude mit den verschiedenen Staaten der Wachsamkeit. Die Aufklärung , die Auswirkungen der Netzwerkaktivität auf der Erregbarkeit und Ansprechbarkeit einzelner Neuronen ist eine der großen Herausforderungen der Neurowissenschaften 3,4. Viele experimentelle und theoretische Studien haben die funktionellen Auswirkungen der laufenden synaptische Aktivität auf dem integrativen propertie erforschts von Neuronen. die Rolle der verschiedenen neuronalen Parameter durch das Hintergrundrauschen beeinflusst synaptic bleibt jedoch unklar. Zum Beispiel hat sich die mittlere Ebene der Membrandepolarisierung wurde positiv oder negativ 5,6 7-9 korreliert mit der Fähigkeit der sensorischen Input auslösen Aktionspotentiale gefunden. Außerdem, während einige Untersuchungen legen nahe , dass Schwankungen des Membranpotentials, die sich aus einem kontinuierlich von afferenten synaptischen Eingaben variierenden Strom, stark das Ansprechverhalten der einzelnen Neuronen beeinflussen , indem die Verstärkung ihrer Eingangs-Ausgangs - Beziehung Modulieren 3,10-13, andere zeigen , daß Änderungen in der Leitfähigkeit Membran Eingabe durch Rangier- Hemmung vermittelt sind ausreichend , um die neuronale Verstärkung unabhängig von der Größe der Membranschwankungen 14,15 zu modulieren. Schließlich auf wach Tieren durchgeführt jüngsten Studien betont, wie die Verarbeitung von Sinnesinformationen in einzelnen Neurons, hängt entscheidend von dem Zustand der Wachsamkeit einnd die aktuelle Verhaltens Nachfrage 16,17. Eine einfache Strategie, um die funktionelle Rolle eines gegebenen Prozesses in einer stark vernetzten System zu erläutern ist, um zu bestimmen, wie seine Abwesenheit spezifisch die Funktion des Systems verändert. Diese Methode wurde in der neurowissenschaftlichen Forschung, zum Beispiel unter Verwendung von experimentellen Läsionen oder Inaktivierung von verschiedenen Hirnarealen 18-21 oder pharmakologische Blockade von bestimmten Ionenkanälen 22,23 ausgiebig genutzt. Bemerkenswert ist , wurde in vivo angewendet zu enthüllen , wie funktionelle Konnektivität und Netzwerk - Dynamik 24-27 einzelne Zelle Berechnung beeinflussen. Allerdings lokale Manipulationen bisher soll die Feuern von Neuronen und / oder stören ihre grundlegenden biophysikalischen Eigenschaften zu blockieren können relativ kleine Gehirne 28 teilweise wirksam und begrenzt sein. Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelten wir einen neuen in vivo experimentellen Ansatz indie Ratte die elektrophysiologischen Eigenschaften von einzelnen Neuronen in einem bestimmten Gehirnzustand, dh eingebettet in einem bestimmten Netzwerk dynamisch, auf diejenigen , die erhalten nach der vollständigen Unterdrückung des gesamten Gehirns synaptische Aktivität 29 aufgezeichnet zu vergleichen. In den Kontrollbedingungen zwei verschiedene könnte kortikalen Dynamik erzeugt werden. Schlaf-like electrocorticographic (ECoG) Muster wurden durch Injektion von moderaten Dosen von Natrium-Pentobarbital induziert. Alternativ schnell ECoG Wellen mit kleiner Amplitude vergleichbar mit der kortikalen Aktivität Wachzustand (Wachartiges Muster) zugrunde liegen könnte durch Injektion von Fentanyl hergestellt werden. Anschließend, während die gleiche ECoG und intrazelluläre Aufnahme aufrechterhalten wird, eine vollständige Silencing des endogenen elektrische Aktivität des Gehirns wurde durch systemische Injektion einer hohen Dosis von Natrium-Pentobarbital erhalten durch isoelektrische ECoG und intrazellulären Aktivitäten gekennzeichnet. Da die Induktion einer solchen extremen komatösen könnte potenziell tödlich FOLGEces auf biologische Funktionen, eine sorgfältige und kontinuierliche Überwachung der physiologischen Variablen war von wesentlicher Bedeutung. Daher folgten wir genau die Herzschlagfrequenz, die endexspiratorische CO 2 -Konzentration (EtCO 2), die O 2 -Sättigung (SpO 2) und die Kerntemperatur der Ratte in den Experimenten. Wir bewerten einzelne Neuronen Eigenschaften in diesen verschiedenen Zuständen mit scharfen Mikroelektroden, die für lange und stabile Aufnahmen in vivo besonders geeignet sind. Das hier beschriebene Verfahren kann mit anderen elektrophysiologischen und bildgebenden Methoden kombiniert werden und könnte auch auf andere Tiermodelle ausgedehnt werden.

<table><tbody><tr><td>Natrium-Pentobarbital-Centravet</td><td></td><td>Pentobarbital-Ketamin</td><td></td></tr><tr><td>500</td><td>Merial</td><td>Imalg&egrave; ne 500</td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl&nbsp;</td><td>Janssen-Cilag</td><td>Fentanyl</td><td></td></tr><tr><td>Xylocain</td><td>Centravet</td><td>Xylovet</td><td></td></tr><tr><td>Gallamine Triethiodid</td><td>Sigma</td><td>G8134</td><td></td></tr><tr><td>ECoG-Verstärker</td><td>A-M Systems AC-Verstärker</td><td>, Modell 1700</td><td></td></tr><tr><td>Intrazellulärer Verstärker</td><td>Molecular Devices</td><td>Axoclamp 900A</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungsschnittstelle</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>CED-Leistung 1401-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Datenanalyse-Software</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>Spike2 Version 7</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Scientifica</td><td>IVM-3000</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarabzieher</td><td>Narishige</td><td>PE-2</td><td></td></tr><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas</td><td>Harvard Apparatur</td><td>GC150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Silberdraht 0,125 mm (intrazelluläre Aufzeichnung)</td><td>WPI</td><td>AGT0525</td><td></td></tr><tr><td>Ag-AgCl-Referenz</td><td>Phymep</td><td>E242</td><td></td></tr><tr><td>Silberdraht 0,25 mm (ECoG-Aufzeichnung)</td><td>WPI</td><td>AGT1025</td><td></td></tr><tr><td>Beatmungssystem</td><td>Minerve</td><td>Alpha Lab</td><td></td></tr><tr><td>Überwachung physiologischer Parameter</td><td>Digicare</td><td>LifeWindow Lite</td><td></td></tr><tr><td>Heizdecke</td><td>Harvard Apparatus</td><td>507215</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>FST</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont #5</td><td>FST</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont #5SF</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>IP Polyurethan-Katheter - 0,43x0,69 mm&nbsp; &nbsp;</td><td>Instech</td><td>BTPU-027</td><td></td></tr><tr><td>Silikon-Elastomer</td><td>WPI</td><td>KWIK-CAST</td><td></td></tr><tr><td>Dentalbohrer</td><td>NSK</td><td>Y1001151 und P496</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgischer Kleber</td><td>3M</td><td>vetbond</td><td></td></tr></tbody></table>

induktion einer isoelektrischer gehirn staat die auswirkungen der endogene synaptische aktivität auf neuronaler erregbarkeit zur untersuchung<em&gt; in vivo</em

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Die Art und Weise Neuronen Prozessinformationen hängt sowohl von ihrer intrinsischen Membraneigenschaften und auf die Dynamik des afferenten synaptischen Netzwerkes. Insbesondere endogen erzeugten Netzwerkaktivität, die in Abhängigkeit von dem Zustand der Wachsamkeit stark variiert, moduliert signifikant neuronale Berechnung. Um zu untersuchen , wie verschiedene spontane Hirn Dynamik einzelner Neuronen &quot;integrative Eigenschaften auswirken, entwickelten wir eine neue experimentelle Strategie bei der Ratte die darin besteht, mittels einer systemischen Injektion einer hohen Dosis von Natrium - Pentobarbital in vivo alle Hirnaktivität zu unterdrücken. Cortical Aktivitäten kontinuierlich durch kombinierte Elektrokortikogramm überwacht (ECoG) und intrazelluläre Aufnahmen werden zunehmend verlangsamt, zu einem stetigen isoelektrischen Profil führt. Diese extreme Gehirnzustand, die Ratte in einen tiefen komatösen setzen, wurde durch Messen der physiologischen Konstanten des Tieres während des gesamten Experiments sorgfältig überwacht. intrazellulärer recordings erlaubt es uns, die integrative Eigenschaften des gleichen Neuron in physiologisch relevanten kortikalen Dynamik, wie sie in den Schlaf-Wach-Zyklus, und wenn das Gehirn war völlig still begegnet eingebettet zu charakterisieren und zu vergleichen.

Induzierende und einen isoelektrischen Zustand des Gehirns die Aufrechterhaltung ist eine heikle in vivo experimentelle Verfahren. Es ist erwiesen , ein mächtiges Werkzeug , um direkt die Auswirkungen der kortikalen Netzwerk - Aktivität auf die neuronale Erregbarkeit und Übertragungsfunktion zu untersuchen 29. Abbildung 1 zeigt die Multiparameter - Überwachung, einschließlich ECoG und vital Konstanten, der den physiologischen Zustand des Tieres vor <s...

Dieses Verfahren führt langanhaltende in vivo intrazelluläre Aufnahmen von einzelnen Neuronen während physiologisch relevanten Hirnzustände und nach der vollständigen Abschaffung der laufenden elektrischen Aktivitäten, in einem isoelektrischen Zustand des Gehirns führt. Die physiologischen Konstanten des Tieres während des Übergangs zur künstlichen komatösen Zustand sorgfältig überwacht.

Induktion einer Isoelektrischer Gehirn Staat die Auswirkungen der Endogene synaptische Aktivität auf neuronaler Erregbarkeit zur Untersuchung<em&gt; In Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, einen allgemeinen Zustand zerebraler Inaktivität in vivo hervorzurufen, um integrierte Eigenschaften einzelner Neuronen ohne synaptische Eingaben zu untersuchen. Die hier vorgestellte Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neurophysiologie zu beantworten, beispielsweise die Auswirkung der Netzwerkaktivität auf die Berechnungen einzelner Zellen zu bewerten oder die Reaktionsfähigkeit von Neuronen in komatösen Zuständen zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass neuronale Eigenschaften in einer intakten in-vivo-Präparation isoliert vom Netzwerk untersucht werden können.Um dieses Verfahren zu beginnen, stellen Sie eine vollständig anästhesierte Ratte auf eine Heizdecke. Führen Sie eine rektale Sonde beim Tier ein, um die Kerntemperatur bei etwa 37 Grad Celsius zu halten. Um einen Katheter in der Bauchhöhle zu platzieren, um anschließende Injektionen von Anästhetika zu erleichtern, entfernen Sie zunächst die Haare über einem kleinen Bereich im unteren rechten oder linken Quadranten des Bauches mit einer Enthaarungscreme.Nach der Injektion des Lokalanästhetikums wird der Operationsbereich sterilisiert und mit einer scharfen Schere ein zwei bis drei Millimeter großer Schnitt in die Haut gesetzt. Mit einer stumpfen Schere werden die Fett- und Muskelgewebeschichten entfernt, bis die Peritonealhöhle sichtbar ist. Anschließend wird etwa ein bis zwei Zentimeter eines kleinen Katheters in die Höhle eingeführt und die Wunde mit chirurgischem Kleber verschlossen.Bilden Sie eine Schleife und nähen Sie den Katheter zur Befestigung an der Haut fest. Um eine Trachealtube zur Steuerung der Beatmung während der künstlichen Beatmung einzusetzen, entfernen Sie das Haar, desinfizieren Sie die Stelle und schneiden Sie die Haut über der Luftröhre direkt oberhalb des Manubriums auf. Lösen Sie die erste Fettschicht und die Muskeln stumpf.Verschieben Sie die Speicheldrüse beiseite und legen Sie die Luftröhre frei, indem Sie vorsichtig die letzte Muskelschicht dissezieren. Isolieren Sie die Luftröhre vorsichtig und schieben Sie mit einer kleinen Pinzette einen Faden darunter. Knoten Sie dann einen lockeren Chirurgenknoten mit dem Faden. Schneiden Sie die Luftröhre quer zwischen zwei knorpeligen Ringen ein. Führen Sie anschließend einen Luftröhrenkatheter mit dem geeigneten Durchmesser ein, und ziehen Sie den Fadenknoten fest, um den Katheter zu sichern. Für zusätzliche Stabilität kann der Faden zusätzlich an einem höheren Punkt des Luftröhrenkatheters befestigt werden.Nähen Sie die Wunde oder verschließen Sie sie mit chirurgischen Klammern. Danach überführen Sie das Tier in einen stereotaktischen Halter und tragen Augensalbe auf, um Austrocknung zu vermeiden. Anschließend platzieren Sie geeignete Sonden zur Überwachung physiologischer Parameter wie das Elektrokardiogramm, die Blutsauerstoffsättigung und den endexspiratorischen Kohlendioxidpartialdruck.Anschließend entfernen Sie die Haare über der Kopfhaut und desinfizieren die Operationsstelle. Führen Sie einen zwei Zentimeter langen Längsschnitt durch und entfernen Sie mit einem Skalpell das Bindegewebe, das den Schädel bedeckt. Tragen Sie dann chirurgischen Kleber auf Schädel und Gewebe auf, um die Präparation zu stabilisieren.Anschließend führen Sie mit einem Zahnbohrer eine kleine Kraniotomie mit einem Durchmesser von 1,5 Millimeter über dem interessierenden Bereich durch. Danach erzeugen Sie vorsichtig mit einer feinen Pinzette und Venenscheren ein kleines Loch in der Dura. Halten Sie einen Bereich von 0,5 Millimeter innerhalb der Schädelöffnung frei, um die Elektrokortikographie-Elektrode zu platzieren.Stellen Sie sicher, dass die Hirnrinde stets mit einer 0,9 %igen Natriumchloridlösung oder aCSF feucht gehalten wird. Bringen Sie als Nächstes eine Referenzelektrode auf dem kontralateralen Kopfhautmuskel an und platzieren Sie eine Elektrode mit niedriger Impedanz für die Elektrokortikographie auf der Dura. Stellen Sie das künstliche Beatmungssystem so ein, dass Frequenz und Atemzugvolumen denen der spontanen Atmung der Ratte ähneln.Wenn alle physiologischen Variablen und elektrokortikographischen Muster innerhalb der normalen Werte liegen, injizieren Sie Gallamin-Triethiodid in jedes Bein, um das Tier zu paralysieren. Anschließend verbinden Sie die mechanische Beatmung mit dem Trachealtubus und überprüfen die korrekte Aufblähung des Brustkorbs auf beiden Seiten. Ziehen Sie in diesem Schritt eine Glas-Mikropipette mit einer Spitze von 0,2 Mikrometern und füllen Sie sie mit einer zwei Molaren Kaliumacetatlösung.Platzieren Sie die Pipette in einem speziellen Halter mit einem Silber/Silberchlorid-Draht, um die Pipettenlösung mit einem intrazellulären Verstärker zu verbinden. Anschließend platzieren Sie eine Silber/Silberchlorid-Referenzelektrode auf den Nackenmuskeln der Ratte. Bringen Sie die Pipette über dem interessierenden Bereich an.Führen Sie die Pipette langsam bis zur gewünschten Tiefe in das Gehirn ein und nutzen Sie bei Bedarf den Buzz-Knopf des Verstärkers, um die Pipette freizuspülen. Kompensieren Sie den Pipettenwiderstand, indem Sie mithilfe der Brückenschaltung des Verstärkers die Spannungsabfälle als Reaktion auf Stromschritte auf Null setzen. Danach trocknen Sie die Kraniotomie mit Wattestäbchen oder synthetischen Absorptionsdreiecken ab und bedecken sie mit Silikonelastomer oder 4 % Agarose, um Gehirnbewegungen zu reduzieren.Anschließend die Pipette in ein- oder zweimikrigen Schritten absenken, bis der Widerstand beim Annähern an eine Zelle ansteigt. Nutzen Sie die Buzzer-Funktion des Verstärkers, um in das Neuron einzudringen. Sobald die Aufnahme stabil ist, kompensieren Sie den Elektrodenwiderstand, indem Sie den Bridge-Parameter anpassen, während kleine Stromimpulse in das Neuron injiziert werden.Führen Sie anschließend das geeignete experimentelle Protokoll durch, beispielsweise die intrazelluläre Injektion von Strom, um die intrinsischen Eigenschaften des Neurons zu ermitteln, oder führen Sie sensorische Stimuli durch. Danach injizieren Sie eine hohe, aber subletale Dosis Natriumpentobarbital über die intraperitoneale Leitung. Innerhalb von 15 bis 20 Minuten sollten die intrazellulären und elektrokortikographischen Aktivitäten langsamer werden und intermittierende elektrische Stillephasen aufweisen, bis vorübergehend das sogenannte Burst-Suppression-Muster erreicht wird, das sich schrittweise zu einem vollständig isoelektrischen Zustand auflöst.Es wird erwartet, dass die Herzfrequenz deutlich abnimmt, aber die SPO2- und EtCO2-Werte sollten relativ stabil bleiben. Anschließend sollte das Stimulationsprotokoll wiederholt werden, um die Auswirkung der Netzwerkdynamik auf die integrierenden Eigenschaften der aufgezeichneten Neuronen zu vergleichen. Nach Beendigung der Anästhetikainjektionen sollte sich die elektrische Hirnaktivität innerhalb von drei bis vier Stunden vollständig erholen.Diese Abbildung zeigt spontane intrazelluläre Aktivitäten und Elektrokortikogramm-Aktivitäten unter zwei Narkosebedingungen, die der kortikalen Dynamik ähneln, wie sie endogen in den frühen Schlafphasen oder im Wachzustand erzeugt wird. Der schlafähnliche Zustand wird durch Injektion von Natriumpentobarbital induziert, der wachähnliche Zustand durch Fentanyl. In beiden Fällen führte die anschließende Injektion einer hohen Dosis Natriumpentobarbital zu einer vollständigen Abschaltung der spontanen Aktivität im ECOG und in den gleichzeitig aufgezeichneten Neuronen, weshalb der Begriff isoelektrisch verwendet wird.Die Unterdrückung der fortgesetzten synaptischen Aktivität führte zu einer signifikanten Hyperpolarisation des neuronalen Membranpotentials. Stromvermittelte Antwortpotentiale können vor und nach der Induktion des isoelektrischen Zustands erzeugt werden. Dies ermöglicht den Vergleich unterschiedlicher zerebraler Aktivitäten bezüglich der Eingangs-Ausgangs-Übertragungsfunktion von Neuronen, ausgedrückt als die durch Stromsprünge mit zunehmender Intensität hervorgerufene durchschnittliche Feuerrate.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Tier unter den bestmöglichen physiologischen Bedingungen zu halten, um qualitativ hochwertige Aufnahmen in Verbindung mit zuverlässigen zerebralen Dynamiken zu erhalten. Dieser Ansatz kann zukünftig als Modell zur Untersuchung der Neuronenreaktivität in irreversiblen oder reversiblen tiefen Koma-Zuständen eingesetzt werden.

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Dieses Video zeigt die Aufzeichnung elektrischer Signale von einzelnen Gehirnneuronen mit einer Mikropipette aus Glas mit feiner Spitze und einem speziellen Aufbau. Die Mikropipette wird vorsichtig in das Gehirn der Ratte eingeführt und gesummt, um in das Neuron einzudringen und interne neuronale elektrische Signale aufzuzeichnen.

In vivo Aufzeichnung intrazellulärer Signale von einem einzelnen Neuron

Studien haben gezeigt, dass die kathodale transkranielle Gleichstromstimulation suppressive Effekte auf arzneimittelresistente Anfälle haben kann. In dieser Studie wurde ein in vitro Versuchsaufbau entwickelt, in dem die Gleichstromstimulation und die Aufzeichnung der anfallsähnlichen Aktivität durch Multielektrodenarrays bei der Präparation von Hirnschnitten von Mäusen evaluiert wurden. Die Gleichstrom-Stimulationsparameter wurden ausgewertet.

Gleichstrom-Stimulation und Multi-Elektroden-Array-Aufnahme von Seizure-ähnliche Aktivität in Mäuse-Gehirn Scheibe Vorbereitung

Wir stellen Methoden zur Konstruktion von Elektroden vor, um gleichzeitig extrazelluläre neuronale Aktivität aufzuzeichnen und mehrere neuroaktive Substanzen in der Nähe der Aufzeichnungsstellen bei wachen Mäusen freizusetzen. Diese Technik ermöglicht die detaillierte Analyse mutmaßlicher lokaler synaptischer Eingaben an das interessierende Neuron.

Die extrazelluläre Aufnahme neuronaler Aktivität in Kombination mit Microiontophoretic Anwendung von neuroaktiven Substanzen in Awake Mäuse

In dieser Studie wird die Methodik vorgestellt, wie man mehrfache in vivo elektrophysiologische Aufnahmen aus dem hyperdirekten Weg unter Urethananästhesie durchführt.

Akut<em&gt; In vivo</em&gt; Elektrophysiologische Aufzeichnungen von lokalen Feldpotentialen und Multi-Unit-Aktivitäten von der Hyperdirect-Pathway in anästhesierten Ratten

Wir veranschaulichen, Aufzeichnungs- und elektrische Modulation von 4-Aminopyridine-induzierte epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben mit Mikroelektrode Arrays durchzuführen. Eine benutzerdefinierte Aufnahme Kammer unterhält Gewebe Lebensfähigkeit während längerer experimentelle Sessions. Elektrode Zuordnung zu leben und Auswahl an anregenden Paare von eine benutzerdefinierte Benutzeroberfläche durchgeführt werden.

Aufnahme und Modulation der Epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben gekoppelt mit Mikroelektrode Arrays

Akuter Anfall Modelle sind wichtig für die Untersuchung der Mechanismen, die epileptiformen Veranstaltungen. Darüber hinaus bietet die Möglichkeit, epileptiformen Ereignisse auf Abruf erzeugen eine äußerst effiziente Methode um die genaue Abfolge der Ereignisse zugrunde liegen ihre Einleitung zu studieren. Hier beschreiben wir die akute 4-Aminopyridine kortikalen Beschlagnahme Modelle Maus und menschlichem Gewebe gegründet.

Generation und On-Demand Einleitung der akuten iktale Aktivität in Nagetier und menschlichem Gewebe

Brainstem evozierte Reaktion Audiometrie ist ein wichtiges Werkzeug in der klinischen Neurophysiologie. Heutzutage wird die Hirnstamm-Evokologie auch in der Grundlagenforschung und in präklinischen Studien angewendet, an denen sowohl pharmakologische als auch genetische Tiermodelle beteiligt sind. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung, wie auditive Hirnstammreaktionen erfolgreich bei Mäusen aufgezeichnet und analysiert werden können.

Datenerfassung und -analyse in Brainstem Evokierte Reaktion Audiometrie bei Mäusen

Ex-vivo-Gehirnschnitte können verwendet werden, um die Auswirkungen von flüchtigen Anästhetika auf evozierte Reaktionen auf afferente Inputs zu untersuchen. Optogenetik wird eingesetzt, um thalamokortikale und kortikokkortikale Afferenzen für nicht-primären Neokortex unabhängig zu aktivieren, und synaptische und Netzwerkantworten werden mit Isofluran moduliert.

Optogenetische Aktivierung afferenter Signalwege in Hirnschnitten und Modulation von Reaktionen durch flüchtige Anästhetika

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die virale Transduktion diskreter Hirnregionen mit optogenetischen Konstrukten beschreibt, um eine synapsenspezifische elektrophysiologische Charakterisierung in akuten Nagetierhirnschnitten zu ermöglichen.

Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex

Wir beschreiben ein Protokoll zur Beurteilung von Dosis-Wirkungs-Kurven für extrakranielle Stimulation in Bezug auf elektrische Feldmessungen des Gehirns und einen relevanten Biomarker-zerebralen Blutfluss. Da bei diesem Protokoll eine invasive Elektrode in das Gehirn eingeführt wird, ist eine Vollnarkose erforderlich, wobei die Spontanatmung der kontrollierten Atmung vorgezogen wird.

[Platzierung von extrakraniellen Stimulationselektroden und Messung des zerebralen Blutflusses und intrakranieller elektrischer Felder bei anästhesierten Mäusen

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion der langfristigen Plastizität der neuronalen intrinsischen Erregbarkeit in Relaisneuronen aus dem dorsalen lateralen Genikulatkern, der in ex vivo Hirnschnitten erhalten bleibt.

Induktion der Langzeitplastizität der intrinsischen neuronalen Erregbarkeit in Neuronen des dorsalen lateralen Genikulatkerns

Erfahren Sie die Induktion eines isolektrischen Hirnzustands zur Untersuchung neuronaler Eigenschaften ohne synaptische Eingänge in vivo. Diese Methode ermöglicht intrazelluläre Aufzeichnungen von Einzelneuronen bei Ratten.

Induktion einer Isoelektrischer Gehirn Staat die Auswirkungen der Endogene synaptische Aktivität auf neuronaler Erregbarkeit zur Untersuchung In Vivo (Video) | JoVE Journal

Induktion einer Isoelektrischer Gehirn Staat die Auswirkungen der Endogene synaptische Aktivität auf neuronaler Erregbarkeit zur Untersuchung

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