Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

Das übergeordnete Ziel dieses Bildgebungsprotokolls ist es, die CD4-positive T-Zell-Dynamik in der entzündeten Haut sichtbar zu machen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Immunologie zu beantworten, z. B. welche Mechanismen der Beweglichkeit und Funktion von Immunzellen in entzündeten Geweben zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine minimal-invasive Möglichkeit bietet, das dynamische Verhalten von CD4-T-Zellen in Situ zu untersuchen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Vorbereitung des Ohrs für die Bildgebung schwer zu erlernen sind und die richtige Positionierung des Ohrs erforderlich ist, um qualitativ hochwertige Bilder aufzunehmen. Ich bin Alison Gaylo, eine Doktorandin, und ich werde die Demonstration dieses Protokolls durchführen. Beginnen Sie mit der Aspiration von 300 Mikrolitern fluoreszenzmarkierter Effektor-T-Zell-Suspension pro Maus in eine Spritze, die mit einer 27,5-Gauge-Nadel ausgestattet ist.

Drehen Sie dann die Spritzennadel nach oben, schnippen Sie vorsichtig mit dem Schaft der Spritze, wobei Sie den Kolben nach Bedarf auf und ab bewegen, um Blasen zu entfernen. Wenn die Zellen fertig sind, bringen Sie die Mäuse in einen sauberen Käfig und legen Sie sie unter eine Wärmelampe, bis die Schwanzvenen vasoerweitert sind. Setze dann die erste Maus in den Zurückhalter und wische den Schwanz mit einem Alkoholtupfer ab.

Nachdem Sie eine seitliche Schwanzvene identifiziert haben, injizieren Sie langsam 200 Mikroliter Zellen in die Vene. Wenn alle Zellen übertragen wurden, ziehen Sie 50 Mikroliter der vollständigen Fluoreszenzemulsion in eine 28 1/2 Gauge starke Insulinspritze und drücken Sie fest auf den Kolben, um alle großen Luftblasen zu entfernen. Legen Sie dann einen Fingerhut auf den linken Zeigefinger und fassen Sie das Ohr der Maus vorsichtig zwischen linkem Daumen und Fingerhut, wobei das Bauchohr nach oben zeigt.

Schieben Sie dann die Nadel mit der abgeschrägten Seite nach oben in die Dermis im äußeren Drittel der Ohrmuschel und etwas außerhalb der Mitte und injizieren Sie langsam zehn Mikroliter Emulsion in das Gewebe. Nachdem Sie alle Tiere injiziert haben, überwachen Sie die Mäuse, bis sie sich vollständig erholt haben. Drei Tage nach der Immunisierung vasodilatieren Sie die Schwanzvenen der injizierten Tiere, wie gerade gezeigt.

Nach der Betäubung den Schwanz der ersten Maus mit einer Pinzette ruhigstellen. Wischen Sie den Schwanz mit einem Alkoholtupfer ab, schieben Sie dann vorsichtig einen 30 1/2 Gauge starken Nadelkatheter in eine seitliche Schwanzvene und prüfen Sie die Durchgängigkeit durch sanften Druck auf den Spritzenkolben. Wenn der Katheter an Ort und Stelle ist, tragen Sie ein bis zwei Tropfen Cyanacrylat-Gewebekleber auf die Injektionsstelle auf und lassen Sie den Klebstoff etwa 30 Sekunden lang trocknen.

Schneiden Sie dann mit einer Schere vorsichtig die Schnurrhaare und die Haare von der Rückseite und den Seiten des Ohrs ab. Verwenden Sie als Nächstes ein Wattestäbchen, um die Innenseite des Ohrs mit PBS zu befeuchten. Drehen Sie dann die Maus und flachen Sie das injizierte Ohr auf einem 24 x 50 Millimeter großen Abdeckglas ab, bis es bündig mit dem Glas abschließt.

Tupfen Sie das überschüssige PBS ab. Fassen Sie dann mit zwei Paar gebogenen Pinzetten ein etwa 20 Millimeter langes Stück Gewebeband in Längsrichtung an den oberen Ecken und legen Sie die Unterseite des Bandes auf den Deckschirm oben am Ohr der Maus. Rollen Sie das Klebeband über den Rest des Ohrs, schieben Sie die überschüssigen Haare bei Bedarf mit der Pinzette aus dem Weg und drücken Sie das Klebeband mit einem trockenen Wattestäbchen vorsichtig um das Ohr, um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten, und achten Sie darauf, nicht auf das Ohr selbst zu drücken.

Es ist wichtig, dass das Ohr richtig mit dem Deckglas verklebt wird, mit einer guten Abdichtung auf beiden Seiten und mit minimalen Luftblasen, da dies die Qualität der Bilder, die erhalten werden können, beeinträchtigt. Kleben Sie nun eine Fluoreszenzmikroskop-Bildgebungsplattform auf einen 37 Grad Celsius heißen Block und tragen Sie Vakuumfett auf beide Seiten des Ohrbereichs der Plattform auf. Drehen Sie die Maus, um das Deckglas auf der Plattform zu platzieren, und achten Sie darauf, das Ohr in der Mitte des Filzes auszurichten.

Wenn das Ohr an Ort und Stelle ist, rasten Sie den Isofluran-Nasenkegel in die Halterung auf der Plattform ein, um sicherzustellen, dass der Kegel sicher sitzt und die Nase der Maus vollständig bedeckt. Drücken Sie dann mit einem Wattestäbchen das Deckglas fest, aber vorsichtig auf die Bildgebungsplattform und verteilen Sie das Vakuumfett unter dem Deckglas. Wickeln Sie zwei 20-Millimeter-Stücke und zwei längere Stücke Klebeband um den oberen Teil der Plattform, um den Deckglas auf der Plattform zu befestigen.

Bewegen Sie anschließend die Maus auf den Mikroskoptisch. Befestigen Sie die Plattform mit mehr Klebeband und spritzen Sie eine doppelte Schicht Vakuumfett auf den Deckschirm um das Ohr. Wickeln Sie dann eine mit Wasser gefüllte Heizdecke um die Maus und füllen Sie den Vakuum-Fettbehälter mit 37 Grad Celsius destilliertem Wasser.

Für die In-Vivo-Zeitrafferbildgebung positionieren Sie zunächst das Objektiv über der Mitte des Ohrs und senken das Objektiv, bis es gerade die Wasseroberfläche im Reservoir berührt. Senken Sie dann mit einer externen Lichtquelle das Objektiv langsam ab, bis die Oberfläche des Ohrs scharf wird. Senken Sie dann die inneren und äußeren Vorhänge um den Mikroskoptisch ab und stellen Sie die Laserwellenlänge auf 900 Nanometer im MP-Lasercontroller-Fenster, die Laserleistung im Laserfenster für die Aufnahmeeinstellung und die PMT-Spannungen im Steuerfenster für die Bildaufnahme ein.

Stellen Sie das Mikroskop in den Fenstern für die Aufnahmeeinstellung für Größe und Modus auf eine Auflösung von fünf x fünf mal fünf zwölf Pixeln mit einer Verweilzeit von zwei Mikrosekunden pro Pixel ein und wählen Sie XY-Wiederholung, um einen Live-Imaging-Modus für das Scannen des Gewebes zu aktivieren. Sobald Sie ein geeignetes Bildfeld gefunden haben, suchen Sie die höchste Zelle in der Dermis und klicken Sie auf die Schaltfläche Null setzen, um die Z-Position auf Null zu setzen. Scrollen Sie in Z-Richtung nach unten, um die Ausdehnung der Zellentiefe zu messen.

Legen Sie dann die Start- und Endpositionen im Mikroskopfenster für die Aufnahmeeinstellung fest und passen Sie die PMT-Spannungen und die Laserleistung des Instruments im hellen Z-Fenster an, um die Visualisierung der Zellen über die gesamte Tiefe des Bildgebungsfeldes zu optimieren. Aktivieren Sie die Schaltflächen für die Tiefen- und Zeit, und stellen Sie einen allgemeinen Filter ein, um das Bild dreimal pro Zeile im Filtermodusfenster der Bildaufnahmesteuerung zu scannen. Passen Sie die Tiefe der Z-Schicht im Fenster des Bildaufnahmemikroskops so an, dass es etwa eine Minute dauert, einen vollständigen Stapel zu erfassen, wie im Zeitansichtsfenster angegeben.

Um dann die Stabilität des Gewebes zu beurteilen, setzen Sie die Anzahl der Wiederholungen im Zeitscanfenster der Aufnahmeeinstellung auf fünf und klicken Sie auf die Scan-Schaltfläche, um ein fünfminütiges Zeitrafferbild des Bereichs aufzunehmen. Wenn das Gewebe nach fünf Minuten stabil ist, stellen Sie die Anzahl der Wiederholungen auf 30 bis 45 im Zeitscanfenster der Aufnahmeeinstellung ein und nehmen Sie ein Zeitrafferbild von 30 bis 45 Minuten auf, wobei Sie während der Bildaufnahme auf geringfügige Gewebedrift achten. Speichern Sie das Präantikörperbild im entsprechenden Format und ziehen Sie dann das Antikörpergemisch in eine Ein-Milliliter-Tuberkulinspritze, wobei Sie darauf achten, dass alle Luftblasen entfernt werden.

Drücken Sie vorsichtig auf den Kolben, so dass die Antikörperlösung am Ende der Nadel einen Tropfen bildet, und heben Sie die Vorhänge um die Bühne an, um den Katheter zu positionieren. Ersetzen Sie die PBS-Spritze durch die Spritze mit dem Antikörper und injizieren Sie die Antikörper dann langsam in den Katheter. Wenn die Antikörper erfolgreich injiziert wurden, senken Sie die Vorhänge wieder und notieren Sie den Zeitpunkt der Injektion.

Beginnen Sie dann sofort mit der Entnahme einer neuen 20- bis 40-minütigen Bildgebungssequenz am selben Ort und mit denselben Geräteeinstellungen wie das Prä-Antikörper-Bild. Speichern Sie abschließend die Post-Antikörper-Bilddatei im entsprechenden Format, nehmen Sie die Maus vorsichtig vom Mikroskoptisch und überwachen Sie das Tier, bis es vollständig genesen ist. Die Bildgebung der intakten Ohrdermis mit diesem Protokoll ermöglicht die Aufnahme von hochauflösenden und Zeitrafferbildern der Effektor-T-Zelldynamik in der entzündeten Dermis.

In diesem Film kann man beobachten, wie sich die grünen adoptiv übertragenen Effektor-T-Zellen durch das Hautgewebe bewegen. Nach der Verabreichung von Antibeta 1 und Antibeta drei Entogrin blockierenden Antikörpern durch den Katheter verharren die zuvor beweglichen Zellen jedoch in der Dermis. Die Zellen weisen nach der Verabreichung von Antikörpern eine verringerte durchschnittliche Geschwindigkeit sowie eine signifikante Abnahme ihres Mäanderindex auf.

Das heißt, das Verhältnis der Gesamtverschiebung zur Gesamtgleislänge. Autofluoreszierende Fluoreszenzen von Haarfollikeln, Abschattungen und Autofluoreszenzen von darüber liegenden Haaren sowie Luftblasen, die zwischen der Ohroberfläche und dem Deckglas eingeschlossen sind, können zu bildgebenden Artefakten führen, die die Visualisierung der T-Zellen verdecken und die automatisierte Bildanalysesoftware beeinträchtigen. Darüber hinaus kann die Verwendung mehrerer Wärmequellen zu Problemen mit der Gewebestabilität führen, was zu großen Schwingungen während der Bildgebung führt, die die Interpretation der Ergebnisse erschweren.

Einmal gemeistert, kann die Bildgebung der CD4-T-Zellen in der Dermis in zwei bis drei Stunden abgeschlossen sein, wenn der Eingriff korrekt durchgeführt wurde. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die entsprechenden Richtlinien für die Tierpflege und -verwendung für die Arbeit mit Mäusen zu befolgen. Dieses Verfahren kann angepasst werden, um andere T-Zell-Untergruppen oder Arten von Immunzellen im Ohr sichtbar zu machen, wobei verschiedene Infektionsmodelle oder verschiedene Methoden zur Induktion von Entzündungen verwendet werden.

Nach ihrer Entwicklung ebnete die Intravital-Bildgebung den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um die Dynamik der laufenden Immunantworten bei lebenden Tieren zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Multi-Phosphor-Laser äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. eine ordnungsgemäße Abschirmung. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Entzündung in einer Mausohrdermis induziert und wie man die intravitale Bildgebung verwendet, um die Zeitrafferbilder der CD4-T-Zellaktivität vor und nach der Verabreichung von Antikörpern aufzunehmen.