Imaging CD4 T-Zell-Interstitial Migration in den entzündeten Dermis

Das übergeordnete Ziel dieses Bildgebungsprotokolls besteht darin, die Dynamik von CD4-positiven T-Zellen in entzündeter Haut sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, beispielsweise, welche Mechanismen der Beweglichkeit und Funktion von Immunzellen in entzündetem Gewebe zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine minimalinvasive Möglichkeit bietet, das dynamische Verhalten von CD4-T-Zellen in situ zu untersuchen.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zur Vorbereitung des Ohrs für die Bildgebung schwer zu erlernen sind und eine korrekte Positionierung des Ohrs notwendig ist, um hochwertige Bilder zu erhalten. Ich bin Alison Gaylo, eine Doktorandin, und werde diese Protokolldemonstration durchführen. Beginnen Sie damit, 300 Mikroliter einer mit Fluoreszenzmarkierung versehenen Suspension von Effektor-T-Zellen pro Maus in eine Spritze mit einer Nadel der Größe 27½ aufzuziehen.

Drehen Sie dann die Spritze mit der Nadel nach oben und klopfen Sie vorsichtig auf den Schaft der Spritze, wobei der Kolben bei Bedarf leicht auf und ab bewegt wird, um eventuelle Luftblasen zu entfernen. Sobald die Zellen bereit sind, überführen Sie die Mäuse in einen sauberen Käfig und stellen sie unter eine Wärmelampe, bis die Schwanzvenen vasodiliert sind. Überführen Sie dann die erste Maus in die Fixiervorrichtung und wischen Sie den Schwanz mit einem Alkoholtupfer ab.

Nachdem eine seitliche Schwanzvene identifiziert wurde, langsam 200 Mikroliter Zellen in die Vene injizieren. Wenn alle Zellen übertragen wurden, 50 Mikroliter vollständige Fluorescein-Emulsion in eine 28½-Zoll-Insulin-Spritze aufziehen und den Kolben fest nach unten drücken, um eventuelle große Luftblasen zu entfernen. Danach einen Fingerhut über den linken Zeigefinger stülpen und vorsichtig das Mausohr zwischen linkem Daumen und Fingerhut fassen, wobei die ventrale Seite des Ohrs nach oben zeigt.

Dann schieben Sie die Nadel mit der Schräge nach oben in die Dermis im äußeren Drittel der Ohrmuschel und leicht seitlich versetzt und injizieren langsam zehn Mikroliter Emulsion in das Gewebe. Nach der Injektion aller Tiere beobachten Sie die Mäuse, bis sie sich vollständig erholt haben. Drei Tage nach der Immunisierung weiten Sie die Schwanzvenen der injizierten Tiere wie gerade gezeigt durch Vasodilatation.

Nach der Anästhesie immobilisieren Sie den Schwanz der ersten Maus mit einer Pinzette. Wischen Sie den Schwanz mit einem Alkoholtupfer ab und schieben Sie vorsichtig einen Katheter mit einer Nadel der Größe 30½ in eine seitliche Schwanzvene, wobei Sie die Durchgängigkeit durch sanften Druck auf den Spritzenkolben überprüfen. Sobald der Katheter sitzt, tragen Sie ein bis zwei Tropfen Cyanoacrylat-Gewebekleber an der Injektionsstelle auf und lassen Sie den Kleber etwa 30 Sekunden lang trocknen.

Verwenden Sie dann eine Schere, um die Schnurrhaare sowie die Haare vom Rücken und den Seiten des Ohrs vorsichtig zu entfernen. Befeuchten Sie anschließend die Innenseite des Ohrs mit einem Wattestäbchen und PBS. Drehen Sie danach die Maus und legen Sie das injizierte Ohr flach auf eine 24 mal 50 Millimeter große Deckglasnummer eins Komma fünf, bis es bündig mit dem Glas liegt.

Entfernen Sie das überschüssige PBS durch Abtupfen. Verwenden Sie dann zwei Paar gebogene Pinzetten, um ein etwa 20 Millimeter langes Stück Gewebeklebeband längs an den oberen Ecken zu fassen, und platzieren Sie das untere Ende des Klebebands auf der Deckglasabdeckung am oberen Rand des Mausohrs. Rollen Sie das Klebeband über den restlichen Teil des Ohrs, schieben Sie bei Bedarf mit den Pinzetten das überschüssige Fell beiseite, und verwenden Sie einen trockenen Wattestäbchen, um das Klebeband vorsichtig am Ohrrand festzudrücken, um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten; achten Sie dabei darauf, nicht direkt auf das Ohr selbst zu drücken.

Es ist entscheidend, dass das Ohr ordnungsgemäß mit Klebeband auf der Deckglasunterlage befestigt wird, wobei auf beiden Seiten eine gute Abdichtung und möglichst wenige Luftblasen gewährleistet sein müssen, da dies die Qualität der erzielbaren Bilder beeinflusst. Befestigen Sie nun eine fluoreszenzmikroskopische Bildgebungsplattform mit Klebeband auf einem Heizblock mit 37 Grad Celsius und tragen Sie Vakuumfett auf beiden Seiten des Ohrbereichs der Plattform auf. Drehen Sie die Maus, um das Deckglas auf die Plattform zu setzen, und achten Sie darauf, das Ohr mittig im Filz auszurichten.

Wenn das Ohr an der richtigen Stelle sitzt, setzen Sie die Isofluran-Nasenkappe in den Halter auf der Plattform ein, wobei sichergestellt werden muss, dass die Kappe fest sitzt und die Nase der Maus vollständig abdeckt. Anschließend verwenden Sie einen Wattestäbchen, um die Deckglaskappe vorsichtig, aber fest auf die Bildgebungsplattform zu drücken und dabei das Vakuumfett unter der Deckglaskappe zu verteilen. Wickeln Sie zwei 20 Millimeter lange Stücke und zwei längere Stücke Klebeband um den oberen Teil der Plattform, um die Deckglaskappe an der Plattform zu befestigen.

Bewegen Sie danach die Maus auf den Mikroskopständer. Sichern Sie die Plattform mit weiterem Klebeband und geben Sie eine doppelte Schicht Vakuumfett auf die Deckglasränder um das Ohr herum. Wickeln Sie dann eine mit Wasser gefüllte Heizdecke um die Maus und füllen Sie das Vakuumfett-Reservoir mit destilliertem Wasser bei 37 Grad Celsius.

Beginnen Sie für die In-vivo-Zeitrafferaufnahme damit, das Objektiv über der Mitte des Ohrs zu positionieren, und senken Sie das Objektiv so weit ab, bis es gerade die Wasseroberfläche im Reservoir berührt. Senken Sie anschließend mithilfe einer externen Lichtquelle das Objektiv langsam ab, bis die Oberfläche des Ohrs scharf gestellt ist. Schließen Sie danach die inneren und äußeren Vorhänge um den Mikroskoptisch und stellen Sie die Laserwellenlänge im MP-Lasersteuerungsfenster auf 900 Nanometer, die Laserleistung im Laserfenster der Aufnahmeeinstellungen und die PMT-Spannungen im Fenster der Bildaufnahmesteuerung ein.

Stellen Sie in den Einstellungsfenstern für Größe und Modus die Mikroskopauflösung auf 512 × 512 Pixel mit einer Verweilzeit von zwei Mikrosekunden pro Pixel ein und wählen Sie „XY-Wiederholung“, um einen Live-Bildgebungsmodus für die Scannung durch das Gewebe zu aktivieren. Sobald ein geeignetes Bildfeld lokalisiert wurde, finden Sie die oberste Zelle in der Dermis und klicken Sie auf die Schaltfläche „Null setzen“, um die Z-Position auf null festzulegen. Blättern Sie in Z-Richtung nach unten, um die Tiefe der Zelle zu messen.

Danach die Start- und Endpositionen im Mikroskop-Fenster für die Aufnahmeeinstellungen festlegen und die PMT-Spannungen sowie die Laserleistung im hellen Z-Fenster anpassen, um die Visualisierung der Zellen über die gesamte Tiefe des Bildfelds zu optimieren. Die Tiefen- und Zeitfunktionen überprüfen und einen gemeinsamen Filter im Fenster für den Bildaufnahmesteuerungs-Filtermodus einstellen, um das Bild dreimal pro Zeile zu scannen. Die Z-Schichttiefe im Mikroskop-Fenster für die Bildaufnahme so anpassen, dass die Aufnahme eines kompletten Stacks etwa eine Minute dauert, wie im Zeitansichtsfenster angegeben.

Danach, um die Stabilität des Gewebes zu beurteilen, die Anzahl der Wiederholungen im Erfassungseinstellungs-Fenster für die Zeitscan-Dauer auf fünf setzen und den Scan-Button anklicken, um ein Fünf-Minuten-Zeitrafferbild des Bereichs aufzunehmen. Falls das Gewebe nach fünf Minuten stabil ist, die Anzahl der Wiederholungen im Erfassungseinstellungs-Fenster für die Zeitscan-Dauer auf 30 bis 45 einstellen und ein 30 bis 45 Minuten langes Zeitrafferbild aufnehmen, wobei auf eventuelle geringfügige Gewebeverschiebungen während der Bildaufnahme geachtet wird. Das Prä-Antikörper-Bild im geeigneten Format speichern und anschließend die Antikörperlösung in eine Ein-Milliliter-Tuberkulinspritze aufziehen, wobei darauf geachtet wird, alle Luftblasen vollständig zu entfernen.

Drücken Sie den Kolben vorsichtig, sodass eine Tropfen der Antikörperlösung an der Nadelspitze entsteht, und heben Sie die Vorhänge um die Plattform an, um den Katheter zu lokalisieren. Ersetzen Sie die PBS-Spritze durch die Spritze mit Antikörpern und injizieren Sie die Antikörper langsam in den Katheter. Sobald die Antikörper erfolgreich injiziert wurden, senken Sie die Vorhänge erneut und notieren Sie den Zeitpunkt der Injektion.

Danach unverzüglich eine neue 20 bis 40 minütige Bildaufnahmesequenz am selben Ort mit denselben Geräteeinstellungen wie beim präantikörper-Bild starten. Abschließend die Bilddatei nach der Antikörpergabe im geeigneten Format speichern und die Maus vorsichtig vom Mikroskopständer entfernen, wobei das Tier bis zur vollständigen Erholung überwacht wird. Die Bildgebung der intakten Ohrdermis mittels dieses Protokolls ermöglicht die Gewinnung hochauflösender und Zeitrafferaufnahmen der Dynamik von Effektor-T-Zellen in der entzündeten Dermis.

In diesem Film sind die grün markierten adoptiv übertragenen Effektor-T-Zellen zu sehen, die sich durch das Bindegewebe der Haut bewegen. Nach der Gabe von blockierenden Antikörpern gegen Beta-eins- und Beta-drei-Entogrin über einen Katheter verharren die zuvor beweglichen Zellen jedoch in der Dermis. Die Zellen weisen nach der Antikörpergabe eine verminderte mittlere Geschwindigkeit sowie eine signifikante Abnahme ihres Irregularitätsindex auf.

Das heißt, das Verhältnis der Gesamtverschiebung zur Gesamtstreckenlänge. Autofluoreszenzen von Haarfollikeln, Abschattungen und Autofluoreszenzen von überlagerndem Haar sowie eingeschlossene Luftblasen zwischen der Ohrfläche und der Deckglasunterlage können alle zu Bildartefakten führen, die die Visualisierung der T-Zellen beeinträchtigen und die automatisierte Bildanalyse-Software stören. Außerdem kann die Verwendung mehrerer Wärmequellen Probleme mit der Gewebestabilität verursachen, die zu starken Oszillationen während der Aufnahme führen und die Interpretation der Ergebnisse erschweren.

Wenn man einmal Erfahrung mit der Bildgebung der CD4-T-Zellen in der Dermis gesammelt hat, kann der Vorgang in zwei bis drei Stunden abgeschlossen werden, sofern das Verfahren korrekt durchgeführt wurde. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die entsprechenden Richtlinien für die Tierpflege und -nutzung bei der Arbeit mit Mäusen zu beachten. Dieses Verfahren kann angepasst werden, um andere T-Zell-Subpopulationen oder Typen von Immunzellen im Ohr sichtbar zu machen, und zwar unter Verwendung unterschiedlicher Infektionsmodelle oder verschiedener Methoden zur Induktion von Entzündungen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete die intravitale Bildgebung Forschern auf dem Gebiet der Immunologie den Weg, um die Dynamik laufender Immunantworten in lebenden Tieren zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Multi-Phosphor-Laser äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie eine geeignete Abschirmung getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Entzündung in der Dermis eines Mäuseohrs hervorruft, und wie man die intravitale Bildgebung verwendet, um Zeitrafferaufnahmen der Aktivität von CD4-T-Zellen vor und nach der Gabe von Antikörpern aufzuzeichnen.