Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Bildung und Organisation des spindelförmigen Apparats in Zellen nach einer durch irna vermittelten Ausschaltung zentraler mit dem MTOC assoziierter Proteine wie Perrin zu beurteilen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Reproduktionsbiologie zu klären, beispielsweise die Mechanismen, die die Chromosomen-Segregation regulieren, sowie mögliche Störungen, die zu Aneuploidie in allen Zellen führen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine effiziente Transkript-Reduktion und eine spezifische immunfluoreszenzanalytische Untersuchung einzelner Zellen ermöglicht.

Dieses Verfahren kann ebenfalls angepasst werden, um nahezu jedes Zielprotein zu untersuchen. Behandeln Sie die weiblichen Mäuse, die für die Oozytengewinnung verwendet werden, 48 Stunden vor dem Sammeltag mit fünf internationalen Einheiten PMSG, die intraperitoneal injiziert werden. Nach dem Sammeln der Eierstöcke gemäß Standardverfahren überführen Sie diese in eine Schale mit vorgewärmtem, äquilibriertem MEM-Medium, das mit BSA und Milreone ergänzt ist, und bereiten Sie die Isolierung der Zellen unter einem Stereomikroskop vor. Setzen Sie die Cumulus-Oozyten-Komplexe oder COCs frei, indem Sie einen Eierstock mit einer 27-Gauge-Nadel am Boden der Kulturschale fixieren, und durchstechen Sie mit einer zweiten Nadel die antralen Follikel, wobei Sie entweder die Oozytenaspiration oder die standardmäßige Mundpipettiermethode anwenden.

Sammeln Sie die Oozyten, die von zwei oder mehr Schichten dichter Cumuluszellen umgeben sind. Überführen Sie diese COCs in eine neue Schale mit M-E-M-B-S-A mildem Reagenz und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Danach fahren Sie mit der Entfernung der Zellen nach Standardmethoden fort.

Bereiten Sie die Injektionskulturschale mit drei Millilitern M2-Medium mit einem Mikrogramm pro Milliliter Milone vor. Bereiten Sie außerdem die Wasch- und Kulturschalen mit M-E-M-B-S-A-Milone vor. Danach pipettieren Sie fünf Mikroliter der einmillimolaren INA-Lösung in die Injektionsnadel und richten Sie diese für die Mikroinjektion ein.

Platzieren Sie nun einen 100 µL-Tropfen M2-Medium auf dem Deckel einer 3 cm-Dish. Geben Sie eine Oozyte in den Tropfen und verwenden Sie sie, um die Position der Haltepipette einzustellen. Sichern Sie die OAS-Position, indem Sie sie mit Unterdruck an der Haltepipette befestigen.

Danach die Position der Injektionsnadel auf den größten Durchmesser der Oozyte justieren. Sobald die Nadel positioniert ist, etwa 10 Pikoliter der Lösung in das Cytoplasma der Oozyte injizieren und dabei den Zellkern vermeiden. Die Deckplatte auf den Objekttisch des Stereomikroskops zurücklegen und 100 Mikroliter frisches M2-Medium hinzufügen.

Geben Sie etwa 10 Zellen in das Medium. Fahren Sie dann am Mikroinjektions-Präparat mit der Mikroinjektion fort. Sichern Sie jede Oozyte mit der Haltepipette und führen Sie die Injektionsnadel langsam in das Zytoplasma ein.

Injizieren Sie die S irna-Lösung und ziehen Sie die Injektionspipette vorsichtig zurück. Bewegen Sie erfolgreich injizierte Zellen an ein Ende des Tropfens und nicht erfolgreich injizierte Zellen an das gegenüberliegende Ende des Tropfens. Die Injektion von 10 Zellen sollte nur wenige Minuten dauern, was entscheidend für die Aufrechterhaltung ihrer Vitalität ist.

Verschieben Sie den Deckel auf den Stereomikroskop-Tisch und überführen Sie alle erfolgreich injizierten Zellen in eine Schale mit M-E-M-B-S-A Mel, die bei 37 Grad Celsius bekannt ist. Überführen Sie die Zellen in einen Inkubator mit einer medizinischen Gasatmosphäre bei 37 Grad Celsius und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang. Beginnen Sie damit, die Zellen aus dem Mil-Reone-Block freizusetzen, indem Sie die Zellen dreimal in M-E-M-B-S-A waschen.

Überführen Sie die Zellen anschließend in ein Reifungsmedium, das ein 10 % FBS-haltiges Kulturmedium enthält. Inkubieren Sie die Zellen 17 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Dadurch setzt am nächsten Tag die Meiose wieder ein.

Fixieren Sie die Zellen. Verwenden Sie eine Zellenaspiration oder Mundpipettierung, um die verschiedenen Versuchsgruppen schnell in Vertiefungen von Vier-Loch-Platten zu überführen, die 750 µL vorgewärmtes 4 % PFA enthalten. Lassen Sie die Zellen danach eine Stunde lang inkubieren.

Waschen Sie jede Gruppe dreimal mit 750 µL vorgewärmtem PBS mit 5 % FBS. Jeder Waschschritt sollte 15 Minuten im Inkubator dauern. Danach blockieren Sie jede O-Zellen-Gruppe in 5 % FBS in BS. Lassen Sie die Blockierung über Nacht bei vier Grad Celsius erfolgen, um eine Immunfärbung durchzuführen. Verwenden Sie eine Reihe von acht Vertiefungen auf der Mehrfach-Platte für jede experimentelle Gruppe von Zellen.

4 96-Well-Platten nehmen 200 µL Lösung pro Well auf. Beginnen Sie den Färbeprozess mit frisch zubereiteter primärer Antikörperlösung. Danach die Wells mit Parafilm abdecken und die Zellen gemäß den Angaben des Herstellers für den primären Antikörper inkubieren.

Waschen Sie die Zellen dreimal mit 5 % FBS in PBS, wobei jeder Waschschritt 10 bis 15 Minuten dauert. Nach den drei Waschungen überführen Sie die Zellen in eine Vertiefung mit Sekundärantikörper-Lösung. Bedecken Sie diese Vertiefungen mit Paraform.

Die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren und anschließend dreimal wie zuvor waschen. Nach dem Waschen die Oozyten auf saubere Objektträger übertragen. Alle Oozyten einer Versuchsgruppe werden auf einen einzigen Objektträger übertragen.

Aspirieren Sie jegliche überschüssige Lösung, um die Zellen zu fixieren, und geben Sie sofort acht Mikroliter Dappy mit Einbettmedium hinzu. Danach decken Sie sie vorsichtig ab, um Luftblasen oder Schäden an den Zellen zu vermeiden. Nach einer Mikroinjektion mit einer unspezifischen Kontrolle oder Perrin-iRNA und 17 Stunden Kultur erreichten die meisten Kontrollen die Metaphase-II-Stufe und enthielten geordnete mitotische Spindeln mit ausgerichteten Chromosomen. Die Perrin-Markierung, dargestellt in Rot, war hell und scharf an den Spindelpolen lokalisiert.

Die Transkripte wurden erfolgreich herunterreguliert, da bei den irna-injizierten Zellen keine Perrin-Färbung nachgewiesen wurde. Die meisten dieser Oozyten verblieben in der Metaphase I und wiesen desorganisierte Spindelstrukturen mit fehlalignierten Chromosomen auf. Einige wenige erreichten die Metaphase II, zeigten aber ebenfalls gestörte Spindeln.

Nun sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mauszellen sammelt und mittels Mikroinjektion mit spezifischem as irna versorgt, um diese anschließend immunzufärben und mittels Fluoreszenzanalyse die Bildung und Organisation von Spins zu untersuchen. Es ist wichtig, stets zügig und äußerst sorgfältig vorzugehen, um die Oside-Vitalität und -Qualität zu bewahren.