Name: Erzeugen eines humanisierte Drosophila S2-Zelllinie Sensitive pharmakologische Hemmung der Kinesin-5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie eine Drosophila S2-Zelllinie erzeugen, die für kleine Molekülinhibitoren von Kinesin-5 empfindlich ist. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Fehlerkorrekturmechanismen während der Zellteilung mittels Live-Zellbildgebung.

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Wir möchten Patricia Wadsworth für das Geschenk des Kinesin-5-Konstrukt danken. Diese Arbeit wurde von einer NIH Zuschusses (5 R01 GM107026) nach TJM und Research Grant No. 5-FY13-205 vom March of Dimes Foundation nach TJM, sowie die Unterstützung von der Charles H. Hood Foundation, Inc. unterstützt, Boston, MA. nach TJM

1. Transfektion von S2-Zellen <ol><li> Aus einer zuvor gezüchteten 25 cm 2 -Kolben, fügen GFP-α-Tubulin-exprimierenden S2-Zellen 10 bis zu einem Endvolumen von 2 ml zu 100% Konfluenz und ihnen erlauben, halb haften an den Boden eines 35 mm-Gewebekulturschale für ca. 1 Std. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus dem Gericht. Transfizieren 2 ug der Eg5-mCherry konstruieren 11 mit 1 ml Schneiders Medium mit 10% FBS (bezeichnet als Schneiders Medien bezeichnet) und Transfektionsreagenz nach dem Protokoll des Herstellers. Dichten Sie das Gericht mit Parafilm und inkubieren Zellen bei 25 ° C für 16-18 Stunden. </li><li> 1 ml der Schneider Medien. Zurückzukehren Zellen auf 25 ° C Inkubator. </li><li> Am Tag 3 nach der Transfektion übertragen 500 ul transfizierter Zellen in eine neue 35-mm-Gewebekulturschale, enthaltend 1,5 ml des Schneiders Medien für eine Test Induktion. Induzieren die Expression von Eg5-mCherry durch Zugabe von CuSO 4 </sub&gt;, um eine Endkonzentration von 500 uM. Dichten Sie das Gericht in Parafilm und Inkubation bei 25 ° CO / N. </li><li> Um Concanavalin A-beschichtete Deckgläser, Pipetten genug Volumen von Concanavalin A (0,5 mg / ml in H 2 O gelöst) zu beschichten, machen eine Säure gewaschen Deckglas, entfernen Sie das überschüssige, und lassen Sie das Deckglas an der Luft trocknen. </li><li> Platzieren eines 22 mm x 22 mm Concanavalin-A-beschichtete Deckgläschen in einer sauberen 35-mm-Gewebekulturschale, dann Samen 500 ul zu 100% Konfluenz der induzierten Zellen auf dem Deckglas und damit die Zellen für 1 h bei RT halten. </li><li> Um Eg5-mCherry Ausdruck zu überprüfen, montieren Sie die Deckgläschen in eine Rose Kammer (oder entsprechende Abbildungsgefäß) mit Medien für die Bildgebung bei RT auf einem Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie geeignete Lichtquellen und Filter-Sets, um die Zellen zu visualisieren. Beispielsweise das Mikroskop in dieser Studie verwendet wird, besitzt einen LED-Weißlichtquelle und EGFP (FITC / Cy2) und DsRed (TRITC / Cy3) Filterwürfel. Eg5-mCherry lokalisiert an Mikrotubuli und angereichert near Spindelpole. </li><li> Nachdem sichergestellt ist, dass die Zellen, die sowohl Eg5-mCherry und GFP-α-Tubulin, übertragen den Rest der transfizierten, nicht-induzierten Zellen auf eine 25 cm2 Zellkulturflasche mit 4 ml Schneiders Medien. </li><li> In Blasticidin S HCL in einer Endkonzentration von 25 ug / ml in den Kolben von transfizierten Zellen und weiter Aufteilen in Gegenwart von 25 ug / ml Blasticidin S HCl bis zum Zelltod nicht mehr sicher zu sein, um für die Expression von Eg5-mCherry in regelmäßigen Abständen überprüfen. Inkubieren Zelllinien in 25 ° C-Inkubator. HINWEIS: Der Prozentsatz von Zellen, die Eg5-mCherry Zeit zunimmt. </li><li> Sobald Zellen stabil transfizierten, weiterhin in der Abwesenheit von Arzneimittel aufgeteilt und gefrier 12 Zellen für zukünftige Verwendung. </li></ol> 2. RNA-Interferenz <ol><li> PCR zu amplifizieren ein ~ 500 bp Region Klp61F von cDNA (LD15641) unter Verwendung des Primers mit Mehr T7-Promotorsequenz (Sequenz in der Materialliste zur Verfügung gestellt) zu sein,als Matrize für dsRNA-Synthese eingesetzt. <ol><li> Vier PCR-Reaktionen, die jeweils 50 ul, enthaltend 100 ng Template-DNA, 25 &amp; mgr; M von jedem Primer, geeignete Puffer und Polymerase eingestellt. Stellen Sie den PCR-Protokoll auf dem Thermocycler nach der Polymerase Herstellerprotokoll. </li><li> Pool und sauber vier PCR-Reaktionen unter Verwendung eines PCR bereinigen Kit gemäß Herstellerprotokoll. Bewahren Sie die saubere Vorlage bei -20 ° C. </li></ol></li><li> Bereiten doppelsträngige RNA (dsRNA) aus Vorlage unter Verwendung eines T7-RNA-Transkription-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Erwarten Sie ~ 5-15 mg / ml Konzentration der dsRNA. Speichern dsRNA bei -20 ° C. </li><li> Um Klp61F mit dsRNA Knockdown, ermöglichen S2-Zellen, die Eg5-mCherry bei 25% Konfluenz auf halb haften an den Boden eines 35 mm-Gewebekulturschale für 1 h. </li><li> Entfernen Sie die Medien aus den Schalen und fügen Sie 5 ug dsRNA gegen Klp61F (Drosophila Kinesin-5) in 1 ml Serum-freien Schneider verdünnt &quot;s Medien. </li><li> Inkubation bei RT für 1 h, dann fügen Sie 1 ml Schneider-Medien mit 10% FBS. Inkubiere Zellen bei 25 ° C. </li><li> 24 h nach der dsRNA Behandlung induziert die Expression von Eg5-mCherry durch Zugabe von CuSO 4 bis zu einer Endkonzentration von 500 uM. Zellen inkubieren bei 25 ° C für weitere 24 Stunden. </li></ol> 3. Live Cell Imaging <ol><li> Legen Sie eine 22 mm x 22 mm Concanavalin A beschichtete Deckglas in eine saubere 35-mm-Gewebekulturschale. </li><li> Samen 500 ul der Zellen, die mit dsRNA behandelt worden und induzierte O / N auf die Concanavalin A beschichteten Deckglas und ihnen erlauben, für etwa 1 Stunde zu halten. </li><li> Montieren Sie die Deckgläschen in eine Rose Kammer (oder andere geeignete Behälter) für die Bildgebung. </li><li> Finden mitotischen Zellen, die sowohl Eg5-mCherry und GFP-α-Tubulin. HINWEIS: Mitotische Zellen nur GFP-α-Tubulin-ausdrücken sollte monopolare Spindeln seit Klp61F, die für Spindel Bipolarität erforderlich sind, wird zu Boden geworfen 10,13. </li><li> Sammeln Sie Zeitrafferbilder von bipolarer Spindeln (zB 1 Frame pro Minute) in Zellen, die sowohl Eg5-mCherry und GFP-α-Tubulin. </li><li> Während Bildgebung, entfernen Sie die Medien aus dem Rosenkammer, und ersetzen Sie es mit Schneider-Medium, das 1 &amp; mgr; M STLC über 3 aufeinanderfolgende Medienaustausch (~ 5 ml insgesamt) in die Kammer, um Spindel Zusammenbruch zu visualisieren. </li><li> Um das Medikament Auswaschen und umgekehrt die Spindel Kollaps, entfernen Sie vorsichtig die STLC haltigen Medien aus dem Rosenkammer, und waschen in Schneiders Medien 4x (6-8 ml gesamt) vor dem Nachfüllen der Rose Kammer ein letztes Mal durch frische Medien. Weiter Bildgebung. </li></ol> 4. Error Correction Assay <ol><li> Legen Sie eine 22 mm x 22 mm Concanavalin A beschichtete Deckgläser in saubere 35-mm-Gewebekulturschalen. </li><li> Samen 500 ul Zellen, die mit Klp61F dsRNA auf die Concanavalin A beschichteten Deckglas behandelt wurden und es ihnen zu haften. </li><li> Nachdem die Zellen ADHERed, fügen Sie 1,5 ml Schneider Medien zu jeder Schale, um das endgültige Volumen auf 2 ml zu bringen. </li><li> Um Zellen zu verhaften in der Mitose, fügen MG132 bis zu einer Endkonzentration von 10 uM zu jedem der Gerichte, und Inkubation für 1 Std. </li><li> 1 &amp; mgr; M STLC und Inkubation für 1 Stunde, damit Monopole zu bilden. </li><li> Auswaschen des STLC durch Spülen Deck 3x mit 2 ml frischem Schneiders Medien jedes Mal. </li><li> Deckgläser mit Schneiders Medien inkubieren zusätzlich zu pharmakologischen Medikamente (zB Aurora-Kinase-Inhibitoren) oder DMSO als Kontrolle. Hinweis: Inhibitorkonzentrationen variieren und ordnungsgemäße Endkonzentrationen muss vom Versuchsleiter bestimmt werden. Stammlösungen werden in der Regel so getroffen, daß der Inhibitor, verdünnt 1: 1.000 in Medien. In diesem Fall wird eine 1: 1000 Verdünnung dient DMSO (oder geeigneten Lösemittel), wie der Fahrzeugsteuerung. Wir verwenden den Aurora-B-Hemmstoff Binucleine 2 bei einer Endkonzentration von 40 uM. </li><li> Fixieren Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten to beobachten, das Fortschreiten der bipolaren Spindelbildung und Kinetochor Befestigungsstaaten zu beurteilen. Reparieren: <ol><li> Schnell spülen Sie die Deckgläser mit 2 ml 1x BRB-80. </li><li> Fixieren Zellen durch Zugabe von 2 ml von 10% igem Paraformaldehyd in 1x BRB-80 für 10 min verdünnt. Pipet Para sorgfältig in einer chemischen Abzugshaube. </li><li> Permeabilisieren Zellen mit 2 ml 1X PBS + 1% Triton-X für 8 min. </li><li> Wasch gleitet 3mal mit 2 ml 1X PBS + 0,1% Triton-X. </li><li> Überdeckgläser Zell-Seite nach oben auf ein Blatt Parafilm (verwenden Sie eine Markierung, um Parafilm beschriften angemessen, den Überblick über die Objektträger zu halten) in einer 150 mm Petrischale. </li><li> Decken Sie die Deckgläser mit 150 ul gekocht Eselserum (BDS) und Inkubation bei RT für 1 h auf nicht-spezifischen Antikörper zu blockieren verbindlich. Hinweis: Hier kann die Fixierung Protokoll angehalten, um zu einem späteren Zeitpunkt fortgesetzt werden kann. Deckgläser in einer feuchten Kammer bei 4 ° C für bis zu 24 Stunden gelagert werden. Um den Feuchtigkeitskammer stellen, säumen den Rand eines 150 mm-Schalemit einem feuchten Labortuch geben und mit der Petrischale Deckel. </li><li> Entfernen Block und inkubiere die Deckgläser für 1 h bei RT mit 150 &amp; mgr; l primärer Antikörper in geeigneter Weise in BDS verdünnt, um Haftstellen und Mikrotubuli zu Endkonzentrationen von 2 ug / ml-Abstrichen (oder entsprechend den Empfehlungen des Herstellers) und 1 &amp; mgr; g / ml . Hinweis: Hier kann die Fixierung Protokoll angehalten, um zu einem späteren Zeitpunkt fortgesetzt werden kann. Deckgläser in einer feuchten Kammer bei 4 ° C für bis zu 24 Stunden gelagert werden. </li><li> Waschdeckgläser 3x mit 500 ul 1x PBS + 0,1% Triton-X. </li><li> Deck Inkubieren für 30-60 min bei RT mit den entsprechenden fluorophorkonjugierten Sekundärantikörper in BDS verdünnt. </li><li> Waschdeckgläser 3x mit 500 ul 1x PBS + 0,1% Triton-X. </li><li> Inkubieren Deckgläser mit 150 ul BDS, enthaltend 1 ug / ml DAPI Endkonzentration 5 min. </li><li> Waschen Sie Deckgläschen 2x mit 1x PBS + 0,1% Triton-X, und montieren coverslips Zellenseite nach unten auf eine 3x1 &quot;Objektträger mit 8 ul Montage Medien. Malen Sie die Ecken mit Nagellack, um die Deckgläser auf Objektträger zu immobilisieren. </li></ol></li><li> Bildzellen mit bipolarer Spindeln, die zum Ausdruck bringen Eg5-mCherry werden. Werfen Sie einen Z-Serie, bestehend aus 30 Flugzeugen bei 0,2 &amp; mgr; m Abständen in allen Kanälen mit einem 100x Objektiv. Sorgfältig zu analysieren, die Kinetochoren und Mikrotubuli, die Befestigungszustände (biorientierte oder syntelic Anhänge) zu bestimmen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Visualisierung von Fehlerkorrektur ist eine wertvolle Technik, um die Schritte in diesem wichtigen und komplexen zellulären Prozess beteiligt zu studieren. Um dies zu tun, werden fehlerhafte Anhänge mit reversible Inhibitoren erzeugt und die Fehlerkorrektur nach Auswaschen des Arzneimittels beobachtet. Dieser Test wurde ursprünglich unter Verwendung von Säugetier-Gewebekulturzellen 5 entwickelt. Jedoch ist die Anwesenheit einer großen Anzahl von Haftstellen in vielen Modellsäugetierzelltypen stellt eine Herausforderung bei der Beobachtung einzelner Fehlerkorrekturereignisse. Drosophila S2 Zellen besitzen so wenige wie 4 Paare von Haftstellen, so dass sie eine mehr bevorzugte Zelllinie zur Beobachtung der Fehlerkorrektur. Jedoch ist ein großer Nachteil, dass viele Inhibitoren unwirksam Drosophila S2 Zellen. Somit stellt die Fähigkeit, eine humanisierte Drosophila S2 Zelllinie zu generieren, die menschliche Kinesin-5 ein wertvolles Werkzeug, um eine Fehlerkorrektur zu studieren. Obwohl Drosophila S2 Zellen sein kannbessere Zelllinie, um eine Fehlerkorrektur zu studieren, die mehrere Schritte bei der Erlangung der Zelllinie und umzuwerfen essentielle Gene beteiligt wirft einige Herausforderungen dieser Technik. Zum Beispiel, kann die Transfektionseffizienz ziemlich niedrig sein. Bei weniger als 20% der Zellen exprimieren die Eg5-mCherry sollte die Transfektion wiederholt werden, wie der Auswahlvorgang dauert länger. Auch kann der Anteil der Zellen, die sowohl fluoreszierende Proteine ​​mit der Zeit ab. Dies kann durch die Spaltung von Zellen in Gegenwart von Blasticidin S HCl und Hygromycin B, um Zellen, die Eg5-mCherry und GFP-α-Tubulin jeweils auszuwählen, überwunden werden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass Drosophila S2 Zellen Orthologe viele humane Proteine ​​und; daher ist es wichtig, die Zuschlagsbedingungen für die endogenen Proteine ​​zu optimieren. Zuschlags optimalen Bedingungen können in der Menge von dsRNA und die Behandlungsdauer variieren. Angesichts der Entstehung und rasche Verbesserung CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, Erzeugung eines Drosophila-Zelllinie mit der Klp61F Gens durch menschliche Eg5 ersetzt präsentiert eine leistungsfähige Alternative, die die Grenzen der Transfektion und Zuschlags Ansatz zu überwinden wäre. Unsere Arbeit zeigt, dass Fly-zu-Mensch-Gen-Ersatz sollte ein gangbarer Weg ist in diesem Fall, obwohl die notwendigen Reagenzien, um so in Drosophila S2-Zellen tun, werden derzeit entwickelt. Dieses Verfahren ist nicht auf Eg5 beschränkt, sondern kann angewendet, um die Funktion anderer Proteine ​​von Interesse zu untersuchen. Bei der Verwendung von Inhibitoren, die zuvor festgelegt wurden unwirksam in Drosophila S2-Zellen zu sein, kann dieses Protokoll geändert werden, um die unmittelbare Wirkung von Inhibitoren in lebenden Zellen, ohne Bedenken bezüglich vorbei Effekte zu studieren. Die Verwendung dieses Protokolls produziert Zelllinie könnte auch im Hochdurchsatz-Screening verwendet werden analysiert, um potenzielle Medikamente gegen Proteine, die in Fehlerkorrektur beteiligt sind.

Equal Segregation des Genoms während der Zellteilung erfordert korrekte Wechselwirkungen zwischen den DNA repliziert und Spindel Mikrotubuli. Mikrotubuli physisch Chromosomen zu interagieren durch ein Ensemble von Proteinen, die an Zentromeren als Kinetochor 1 bekannt versammelt. Korrekte Verteilung der Chromosomen erfordert Schwester Kinetochore sind biorientierte, wobei jede Schwester mit Mikrotubuli von gegenüberliegenden Spindelpole Ursprung verbunden. Kinetochor Mikrotubuli (kt-MT) Anlagen, die in der biorientierten Konformation nicht schnell und effizient destabilisiert, die Gelegenheit zu Biorientierung in einem Prozess als Fehlerkorrektur bekannt zu etablieren ist. Eine Fehlerkorrektur-Assay, die zuvor in Säugetierzellen hergestellt wurde 5 erfordert die Montage monopolare Spindeln mit umkehrbarer niedermolekularen Inhibitoren gegen Eg5 (Kinesin-5). Die medikamentöse Behandlung erzeugt eine Vielzahl von fehlerhaften syntelic Anhänge, in denen Both Schwester Kinetochoren zu befestigen, um die gleiche Spindel-Pol. Eine nachfolgende Auswaschung des Wirkstoffs ermöglicht die Visualisierung der dem Fehlerkorrekturverfahren. Die Fehlerkorrektur-Assay kann in Anwesenheit von Kleinmolekül-Inhibitoren oder Niederschlägen durchgeführt, um den Beitrag von Kandidatenproteinen auf die Korrektur fehlerhafter kt-MT-Anhänge zu untersuchen. Die Fähigkeit zur Fehlerkorrektur in lebenden Zellen sichtbar zu machen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die molekularen Mechanismen in diesem komplexen Prozess beteiligten weiter zu verstehen. Die große Anzahl von in den meisten Zelllinien vorhanden Chromosomen stellt jedoch eine Herausforderung bei der Beobachtung einzelner kt-MT-Anhänge. Drosophila S2 Zellen wäre ideal für die Anwendung des Fehlerkorrektur Assay, da sie so wenig wie 4 Chromosomen 6, aber kleine Molekülinhibitoren enthalten von Kinesin-5, wie etwa S-Trityl-L-cystein (STLC) und Monastrol 7-9 nicht beeinträchtigen Spindelanordnung oder Kinesin-5 Motorik in Drosophila-Zellen. Deshalb Gattungented ein Drosophila S2-Zelllinie menschlichen Kinesin-5 unter einem induzierbaren Promotor, die empfindlich auf Kinesin-5-Hemmer ist, zum Ausdruck bringen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die endogenen Drosophila Kinesin-5-Homologen, Klp61F Knockdown, und verwenden Sie diese Zelllinie in der zellbasierten Assay-Fehlerkorrektur.

<table><tbody><tr><td>Effectine Transfection Reagenz</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Klp61F cDNA</td><td>Drosophila Genomic Resource Center</td><td>13690</td><td>Genname LD15641</td></tr><tr><td>Schneider' s Medien</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, zertifiziert</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>Hitzeinaktiviert, US-Herkunft</td></tr><tr><td>Kupfer(II)-sulfat (CuSO4)</td><td>Sigma</td><td>C8027-500G</td><td>500&nbsp; mM Bestand</td></tr><tr><td>S-Trityl-L-Cystein</td><td>Sigma</td><td>164739-5G</td><td>1&nbsp; mM Lagerbestand in DMSO</td></tr><tr><td>Blasticidin HCl</td><td>Invitrogen</td><td>R21001</td><td>5&nbsp; mg/ml Vorrat in 1x PBS</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>T7 Large scale RNA Production System</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>Die ungefähre dsRNA-Konzentration aus jeder Reaktion beträgt etwa 5-15&nbsp; &Mikro; g/&micro; l</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi F Primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi R Primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC</td></tr><tr><td>PCR Clean-up</td><td>Kit Mo Bio Laboratories, Inc</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td>0,5&nbsp; mg/ml Lösung, die durch Auflösen in 1x PBS hergestellt wird.</td></tr><tr><td>Gekochtes Eselserum</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs</td><td>017-000-121</td><td>5%ige Stammlösung in 1x PHEM-Puffer, Lösung zum Kochen bringen. Gelagert in 4&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Einhängemittel</td><td></td><td></td><td>20&nbsp; mM Tris pH 8,0,&nbsp; 0,5 % N-propylgallat, 90 % Glycerin. Gelagert in 4&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>1x BRB-80</td><td></td><td></td><td>80 mM ROHRE pH 6,9; 1&nbsp; mM EGTA; 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Weißlichtquelle</td><td>Lumencor Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET EGFP Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td></td></tr><tr><td>DSRed Filter Cube</td><td></td><td>Chroma 49005</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NDC80 Antikörper&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Sonderanfertigung durch das Maresca Lab</td></tr><tr><td>DM1&alpha; (Anti-&Alpha;-Tubulin)</td><td>Sigma</td><td>T6199</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CID-Antikörper</td><td>AbCam</td><td>ab10887</td><td></td></tr></tbody></table>

erzeugen eines &quot;humanisierte&quot;<em&gt; drosophila</em&gt; s2-zelllinie sensitive pharmakologische hemmung der kinesin-5

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Kinetochore sind große proteinbasierte Strukturen, die sich während der Zellteilung auf Zentroeren anlagern und Chromosomen mit Spindelmikrotubuli verbinden. Die richtige Verteilung des genetischen Materials erfordert, dass die Schwester-Kinetochore auf jedem Chromosom biorientiert werden, indem sie sich von gegenüberliegenden Spindelpolen an Mikrotubuli anheften, bevor sie in die Anaphase übergehen. Fehlerhafte, nicht-biorientierte Bindungszustände sind jedoch häufig und es existieren zelluläre Wege, um solche Bindungen während der Zellteilung sowohl zu erkennen als auch zu korrigieren. Der Prozess, durch den unsachgemäße Kinetochor-Mikrotubuli-Wechselwirkungen destabilisiert werden, wird als Fehlerkorrektur bezeichnet. Um die Fehlerkorrektur in lebenden Zellen zu untersuchen, werden absichtlich falsche Attachments durch chemische Hemmung des Kinesin-5-Motors erzeugt, was zu einer monopolaren Spindelanordnung führt, und der Übergang von Fehlorientierung zu Biorientierung wird nach dem Auswaschen des Medikaments beobachtet. Die große Anzahl von Chromosomen in vielen Modell-Gewebekultur-Zelltypen stellt eine Herausforderung bei der Beobachtung einzelner Fehlerkorrekturereignisse dar. Drosophila S2-Zellen sind bessere Probanden für solche Studien, da sie nur 4 Chromosomenpaare besitzen. Kleinmolekulare Kinesin-5-Inhibitoren sind jedoch gegen Drosophila Kinesin-5 (Klp61F) unwirksam. Hier beschreiben wir, wie man eine Drosophila-Zelllinie aufbaut, die Klp61F effektiv durch humanes Kinesin-5 ersetzt, was die Zellen empfindlich gegenüber pharmakologischer Hemmung des Motors macht und für den Einsatz im zellbasierten Fehlerkorrektur-Assay geeignet ist.

Klp61F erforderlich ist, um bipolare Spindeln zu bilden. Der menschliche Kinesin-5, Eg5, kann die Funktion des Klp61F in Drosophila S2-Zellen (1A und D) zu retten. Nach Zugabe des Kinesin-5-Inhibitor (STLC), Mikrotubuli-assoziierten Niveaus des Kraftabfall (1B und E) und die Spindel zusammenbricht, was in einer Monopol (1C und F) in Zellen, denen endogene Klp61F bei erfolgreicher RNAi (Supplemental Film 1). Es ist bemerkenswert, dass die bipolare Spindeln bei Zugabe von STLC in den humanisierten S2-Zellen zusammenbrechen, weil Kinesin-5-Aktivität ist nicht verpflichtet, Spindel Bipolarität in menschlichen Zellen zu erhalten. Diese interessante Diskrepanz kann eine Folge der Unterschiede in inter Mikrotubuli Überschneidungen und / oder Stabilität in den beiden Modellsystemen 14 zu sein. Kinesin-5-Hemmung (2A und E) können reve werden<html> durch Auswaschen des Arzneimittels und die Wiederherstellung einer bipolaren Spindel RSED kann im Laufe der Zeit folgen. Bei Entfernung des Inhibitors (2B und F) wieder assoziierten Eg5-mCherry mit den Mikrotubuli als bipolarer Spindel montiert (2C und G), und die Zellen können in einer bipolaren Anaphase (2D und H, Supplemental Film 2 Fortschritt ). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Zugabe von 1 uM STLC führt zu monopolaren Spindeln in Drosophila S2 Zellen. Repräsentative Bilder von Zeitraffer Bildgebung eines Drosophila S2 exprimierenden Zelle Eg5-mCherry (AC) und GFP-α-Tubulin (DF) während der Zugabe von 1 &amp; mgr; M STLC. Die Eg5-Inhibitor wurde nach 3 min zugegeben. Maßstabsbalken = 5 um. Timestamp = min: sec.<html> w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> Abbildung 2. Eine bipolare Spindel Reformen beim Entfernen STLC. Repräsentative Bilder von Zeitraffer-Bildgebung eines Drosophila 2 Zelle, die Eg5-mCherry (AD) und GFP-α-Tubulin (EH) während eines STLC Auswaschen Experiment. STLC wurde bei 5 min gewaschen. Eine bipolare Spindel Reformen innerhalb 1 Stunde zur Entfernung des STLC. Maßstabsbalken = 5 um. Zeitstempel: min: sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; STADT Film 1. (Rechtsklick zum Download). Widefield-Fluoreszenz-Bildgebung eines repräsentativen Beispiels eines Drosophila S2 Zelle, die Eg5-mCherry ( links) und GFP-α-Tubulin (rechts). 1 uM STLC wurde auf 2 min zugegeben und die Spindel bildet einen Monopol innerhalb 10 min nach Zugabe des Inhibitors. Bilder wurden alle 1 min gewonnen und spielte bei einer Rate von 10 Rahmen pro Sekunde. Maßstabsbalken = 5 um. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">STADT Film 2 (Rechtsklick zum Download).</a> Widefield-Fluoreszenz-Bildgebung eines repräsentativen Beispiels eines Drosophila S2 Zelle, die Eg5-mCherry (links) und GFP-α-Tubulin (rechts). Medien, die 1 &amp; mgr; M STLC wurde entfernt undin 5 min gespült. Eine bipolare Spindel Reformen innerhalb 1 Stunde zur Entfernung des Inhibitors. Bilder wurden alle 1 min erworben und spielte mit einer Rate von 10 Bildern pro Sekunde. Maßstabsbalken = 5 um.

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Drosophila S2-Zelllinie erzeugt wird, die empfindlich auf niedermolekulare Inhibitoren von Kinesin-5 reagiert. Die Verwendung dieser Zellen in einem zellbasierten Fehlerkorrektur-Assay wird ebenfalls skizziert.

Erzeugen eines &quot;humanisierte&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2-Zelllinie Sensitive pharmakologische Hemmung der Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, eine Drosophila-S2-Zelllinie zu erzeugen, die empfindlich gegenüber kleinen molekularen Hemmstoffen des Kinesin-5-Motors ist, sodass sie zur Untersuchung der Fehlerkorrektur verwendet werden kann. Die Fehlerkorrektur während der Zellteilung ist ein Prozess, bei dem fehlerhafte Wechselwirkungen zwischen Kinetochor und Mikrotubuli aufgelöst werden, um der Zelle eine zweite Chance beziehungsweise eine weitere Gelegenheit zu geben, korrekte Anbindungen einzugehen, damit das Genom korrekt segregiert werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zellbiologie im Zusammenhang mit dem Fehlerkorrekturprozess zu beantworten.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir eine Drosophila-S2-Zelllinie verwenden können, die über weniger Chromosomen verfügt und empfindlich gegenüber einem Kinesin-5-Inhibitor ist, was jeweils die Visualisierung einzelner Fehlerkorrekturereignisse erleichtert. Beginnen Sie mit einer zuvor kultivierten 25 cm² großen Zellkulturschale mit 100 % konfluenten S2-Zellen, die GFP-Alpha-Tubulin exprimieren, und überführen Sie zwei Milliliter der Kultur in eine 35 mm-Dish. Inkubieren Sie die Zellen anschließend etwa eine Stunde bei Raumtemperatur, um eine teilweise Anheftung zu ermöglichen.Entfernen Sie das Medium von der Schale und geben Sie ein Milliliter Schneider-Medium, ergänzt mit FBS, zu zwei Mikrogramm der Eg5-mCherry-Konstrukt und Transfektionsreagenz hinzu, um die Zellen gemäß der Herstelleranleitung zu transfizieren. Verschließen Sie die Schale mit Parafilm und inkubieren Sie die Zellen bei 25 Grad Celsius für 16 bis 18 Stunden. Geben Sie dann ein Milliliter Schneider-Medium hinzu und stellen Sie die Zellen erneut in den Inkubator.Am dritten Tag nach der Transfektion überführen Sie 500 Mikroliter transfizierter Zellen in eine neue 35-Millimeter-Zellkultur-Schale, die 1,5 Milliliter Schneider-Medium enthält, um eine Testinduktion durchzuführen. Um die Expression von Eg5-mCherry zu induzieren, geben Sie Kupfersulfat bis zu einer Endkonzentration von 500 Mikromolar hinzu. Versiegeln Sie die Schale mit Parafilm und inkubieren Sie sie über Nacht bei 25 Grad Celsius.Legen Sie eine zuvor vorbereitete 22 mm × 22 mm große Deckglas mit Concanavalin-A-Beschichtung in eine saubere 35-mm-Zellkulturschale. Säen Sie anschließend 500 µL der 100 % konfluenten induzierten Zellen auf das Deckglas aus und lassen Sie die Zellen bei Raumtemperatur andocken. Um die Expression von Eg5-mCherry zu überprüfen, montieren Sie das Deckglas in eine Rose-Kammer mit Medium und nehmen Sie die Bilder bei Raumtemperatur gemäß den Anleitungen im Textprotokoll mit einem Fluoreszenzmikroskop auf.Nachdem sichergestellt wurde, dass die Zellen sowohl Eg5-mCherry als auch GFP-alpha-Tubulin exprimieren, überführen Sie den Rest der transfizierten, nicht induzierten Zellen in einen 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturflasche mit vier Milliliter Schneider-Medium. Geben Sie Blasticidin S HCL in einer Endkonzentration von 25 Mikrogramm pro Milliliter hinzu und pflücken Sie die Zellen weiterhin in Gegenwart von Blasticidin S HCL, bis der Zelltod aufhört. Nach der Herstellung von doppelsträngiger RNA gegen KLP61F gemäß dem Textprotokoll säen Sie S2-Zellen, die Eg5-mCherry exprimieren, in eine 35-Millimeter-Kulturschale mit 25 % Konfluenz aus und lassen Sie sie eine Stunde lang anhaften.Entfernen Sie das Medium von den Schalen und geben Sie ein Milliliter serumfreies Schneider'sches Medium zu fünf Mikrogramm doppelsträngiger KLP61F-RNA hinzu. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur für eine Stunde, fügen Sie ein Milliliter Schneider'sches Medium mit 10 % FBS hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 25 Grad Celsius.24 Stunden nach der dsRNA-Behandlung die Expression von Eg5-mCherry induzieren, indem Kupfersulfat auf eine Endkonzentration von 500 µM zugegeben wird. Die Zellen weitere 24 Stunden bei 25 °C inkubieren. Für die Live-Cell-Bildgebung einen 22 mm × 22 mm großen, mit Concanavalin A beschichteten Deckglaser in eine saubere 35-mm-Zellkulturschale geben.Säen Sie 500 µL der mit dsRNA behandelten Zellen, die über Nacht induziert wurden, auf die Deckglasobjektträger aus und lassen Sie sie etwa eine Stunde lang anhaften. Nach der Aufnahme von Zeitrafferaufnahmen bipolarer Spindeln gemäß dem Textprotokoll entfernen Sie das Medium aus der Rose-Kammer und fügen Schneider-Medium mit einem Mikromolar STLC hinzu; ersetzen Sie das STLC-haltige Medium anschließend noch zweimal, wobei das Medium nach jedem Waschschritt verworfen wird, um den Spindelzerfall zu beobachten. Um die Substanz auszuwaschen und den Spindelzerfall rückgängig zu machen, entfernen Sie vorsichtig das STLC-haltige Medium aus der Rose-Kammer und entsorgen es in einem Abfallbehälter; waschen Sie die Zellen viermal mit insgesamt 6 bis 8 mm Schneider-Medium, wobei das Medium nach jedem Waschgang verworfen wird.Danach frisches Medium hinzufügen, um die Kammer erneut zu füllen, und die Bildaufnahme fortsetzen. Um Zugang zum Medium für das Waschen und Ausspülen von Wirkstoffen zu erhalten, vorsichtig die obere Deckglasplatte aus der Rosettenkammer entfernen, während diese auf dem Mikroskop befestigt ist. Alternativ kann eine mit Concanavalin A behandelte Glasboden-Petrischale, ähnlich den Deckgläsern, für die Live-Cell-Bildgebung verwendet werden.Nachdem 500 Mikroliter S2-Zellen, die mit KLP61F-dsRNA behandelt wurden, auf einen Concanavalin-A-Tupfer gegeben und die Zellen anhaften durften, 1,5 Milliliter Schneider-Medium hinzufügen, um das Endvolumen auf zwei Milliliter zu bringen. Sobald die Zellen gemäß dem schriftlichen Protokoll in der Mitose arrestiert wurden, ein Mikromolar STLC hinzufügen und eine Stunde lang inkubieren, um die Bildung von Monopolen zu ermöglichen. STLC durch zweimaliges Spülen der Tupfer mit jeweils zwei Milliliter frischem Schneider-Medium dreimal entfernen.Um die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten der Ausbildung des bipolaren Spindels zu fixieren und die Anheftungsstellen der Kinetochoren zu bewerten, beginnen Sie damit, die Deckgläser mit zwei Milliliter 1X BRB80 schnell abzuspülen. Geben Sie im Abzug zwei Milliliter 10 % PFA in 1X BRB80 hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang. Als Nächstes permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie 1 % Triton X in 1X PBS hinzufügen und 10 Minuten lang inkubieren.Danach die Zellen dreimal mit zwei Milliliter 0,1 % Triton X in 1× PBS waschen. Anschließend den Deckel, mit der Zellseite nach oben, auf ein Stück Parafilm in einer 150-Millimeter-Petrischale überführen. 150 Mikroliter gekochtes Eselserum (BDS) zu den Deckeln hinzufügen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, um eine unspezifische Antikörperbindung zu blockieren.Nach der Inkubation den Block entfernen und 150 Mikroliter der gemäß dem Textprotokoll zubereiteten primären Antikörper hinzufügen, anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dreimaligem Waschen der Deckgläser Fluoro-4-konjugierte sekundäre Antikörper, verdünnt in BDS, hinzufügen und 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach erneutem dreimaligem Waschen der Deckgläser diese mit 150 Mikrolitern BDS, das ein Mikrogramm pro Milliliter DAPI enthält, fünf Minuten inkubieren.Danach, nachdem die Deckgläser zweimal gewaschen wurden, verwenden Sie acht Mikroliter Einbettmedium, um die Probe mit der Zellseite nach unten auf einem Objektträger mit den Maßen drei mal eine Zoll zu montieren. Streichen Sie die Ecken mit Nagellack ab. Schließlich bilden Sie die Zellen mit bipolarer Spindel, die Eg5-mCherry exprimieren, mit einem 100X-Objektiv ab.Nehmen Sie eine Z-Serie auf, die aus 30 Ebenen in 0,2-Mikrometer-Abständen in allen Kanälen besteht. Analysieren Sie sorgfältig die Kinetochoren und Mikrotubuli, um den Bindungszustand zu bestimmen. KLP61F ist erforderlich, um bipolare Spindeln in Drosophila-S2-Zellen zu bilden; jedoch sind kleine Molekül-Inhibitoren der Kinesin-5 dagegen unwirksam.Diese Bilder zeigen, dass der humane Kinesin-5 Eg5 die Funktion von KLP61F in Drosophila S2-Zellen wiederherstellen kann. Wenn der Kinesin-5-Inhibitor STLC hinzugefügt wird, sinken die mikrotubulusassoziierten Konzentrationen des Motors, und das Spindelapparat bricht zusammen, was in einer Monopolarstruktur in Zellen ohne endogenes KLP61F resultiert, nach erfolgreicher RNAi. Diese Abbildung zeigt, dass die Hemmung von Kinesin-5 durch Ausspülen des Wirkstoffs rückgängig gemacht werden kann und die Wiederherstellung einer bipolaren Spindel im Zeitverlauf verfolgt werden kann. Nach Entfernung des Inhibitors assoziiert sich Eg5-mCherry erneut mit den Mikrotubuli, und die Zellen können in eine bipolare Anaphase übergehen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Drosophila-S2-Zelllinie erzeugt, die empfindlich gegenüber einem kleinen molekularen Inhibitor von Kinesin-5 ist. Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann sie in etwa sechs Stunden durchgeführt werden, vorausgesetzt, sie wird korrekt ausgeführt. Bei dem Versuch, dieses Verfahren durchzuführen, ist es wichtig, im Voraus zu planen, da diese Methode eine Vorbereitung einige Tage im Voraus erfordert.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit kleinen Molekülinhibitoren gefährlich sein kann, tragen Sie daher immer Handschuhe. Die Herstellung humanisierter Fruchtfliegenzellen kann durch die Anwendung von CRISPR-Cas9-Technologien und den Ersatz des Drosophila-Kinesin-5 durch sein menschliches Gegenstück nachgewiesen werden. Die Entwicklung humanisierter Drosophila-Zellen sollte in Zukunft unser Verständnis der Fehlerkorrektur und anderer essentieller zellulärer Prozesse voranbringen.

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