Erzeugen eines "humanisierte" Drosophila S2-Zelllinie Sensitive pharmakologische Hemmung der Kinesin-5

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, eine Drosophila S2-Zelllinie zu erzeugen, die empfindlich auf niedermolekulare Inhibitoren des Kinesin-5-Motors reagiert, damit sie zur Untersuchung der Fehlerkorrektur verwendet werden können. Die Fehlerkorrektur während der Zellteilung ist ein Prozess, bei dem fehlerhafte Wechselwirkungen zwischen Kinetochor und Mikrotubuli destabilisiert werden, um der Zelle eine zweite Chance oder eine andere Gelegenheit zu geben, geeignete Bindungen zu bilden, damit das Genom richtig getrennt werden kann. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Zellbiologie im Zusammenhang mit dem Fehlerkorrekturprozess zu beantworten.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir eine Drosophila S2-Zelllinie verwenden können, die weniger Chromosomen hat und empfindlich auf einen Kinesin-5-Inhibitor reagiert, was beide die Visualisierung einzelner Fehlerkorrekturereignisse erleichtert. Beginnend mit einem zuvor kultivierten 25-Zentimeter-Quadratkolben mit 100 % konfluentem GFP-Alpha-Tubulin, das S2-Zellen exprimiert, werden zwei Milliliter der Kultur in eine 35-Millimeter-Schale überführt. Inkubieren Sie die Zellen dann etwa eine Stunde lang bei Raumtemperatur, damit sie teilweise haften.

Nehmen Sie das Medium aus der Schale und fügen Sie einen Milliliter des Schneider-Mediums, ergänzt mit FBS, in zwei Mikrogramm des Eg5-mCherry-Konstrukts und des Transfektionsreagenzes hinzu, um die Zellen gemäß dem Protokoll des Herstellers zu transfizieren. Verwenden Sie Parafilm, um die Schale zu versiegeln, und inkubieren Sie die Zellen 16 bis 18 Stunden lang bei 25 Grad Celsius. Geben Sie dann einen Milliliter Schneider-Medium hinzu und geben Sie die Zellen wieder in den Inkubator.

Am dritten Tag nach der Transfektion werden 500 Mikroliter transfizierter Zellen in eine neue 35-Millimeter-Gewebekulturschale mit 1,5 Millilitern Schneider-Medium für eine Testinduktion überführt. Um die Expression von Eg5-mCherry zu induzieren, fügen Sie Kupfersulfat bis zu einer Endkonzentration von 500 Mikromolar hinzu. Verschließen Sie die Schale in Parafilm und inkubieren Sie sie über Nacht bei 25 Grad Celsius.

Legen Sie einen zuvor vorbereiteten 22 Millimeter x 22 Millimeter großen Concanavalin A-beschichteten Deckglas in eine saubere 35-Millimeter-Gewebekulturschale. Säen Sie dann 500 Mikroliter der 100%igen konfluenten induzierten Zellen auf das Deckglas und lassen Sie die Zellen bei Raumtemperatur anhaften. Zur Überprüfung der Eg5-mCherry-Expression wird das Deckglas in eine Rosenkammer mit Medium eingebaut und mit einem Fluoreszenzmikroskop bei Raumtemperatur gemäß den Richtlinien im Textprotokoll abgebildet.

Nachdem sichergestellt wurde, dass die Zellen sowohl Eg5-mCherry als auch GFP-alpha-Tubulin exprimieren, überführen Sie den Rest der transfizierten, nicht induzierten Zellen in einen 25 Zentimeter großen quadratischen Gewebekulturkolben, der vier Milliliter des Schneiderschen Mediums enthält. Blasticidin S HCL wird in einer Endkonzentration von 25 μg pro Milliliter in den Kolben gegeben und die Zellteilung in Gegenwart von Blasticidin S HCL fortgesetzt, bis der Zelltod aufhört. Nach der Aufbereitung der doppelsträngigen KLP61F-RNA gemäß dem Textprotokoll säen Sie S2-Zellen, die Eg5-mCherry exprimieren, in eine 35-Millimeter-Kulturschale bei 25 % Konfluenz aus und lassen sie eine Stunde lang haften.

Nehmen Sie das Medium aus den Schalen und fügen Sie einen Milliliter serumfreies Schneider-Medium zu fünf Mikrogramm doppelsträngiger KLP61F-RNA hinzu. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur fügen Sie einen Milliliter Schneider's Medium mit 10%FBS hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 25 Grad Celsius.

24 Stunden nach der dsRNA-Behandlung die Expression von Eg5-mCherry durch Zugabe von Kupfersulfat bis zu einer Endkonzentration von 500 Mikromolar induzieren. Inkubieren Sie die Zellen weitere 24 Stunden bei 25 Grad Celsius. Um die Bildgebung lebender Zellen durchzuführen, legen Sie einen 22 Millimeter x 22 Millimeter großen Concanavalin A-beschichteten Deckglas in eine saubere 35-Millimeter-Gewebekulturschale.

500 Mikroliter der dsRNA-behandelten Zellen, die über Nacht induziert wurden, auf das Deckglas säen und etwa eine Stunde lang anhaften lassen. Nach dem Sammeln von Zeitrafferbildern von bipolaren Spindeln gemäß dem Textprotokoll nehmen Sie das Medium aus der Rosenkammer und fügen Sie das Schneider-Medium hinzu, das einen mikromolaren STLC enthält, und ersetzen Sie das STLC-Medium zwei weitere Male, wobei Sie das Medium nach jedem Waschen verwerfen, um den Spindelkollaps sichtbar zu machen. Um das Medikament auszuwaschen und den Spindelkollaps umzukehren, entfernen Sie vorsichtig das STLC-haltige Medium aus der Rosenkammer und entsorgen Sie es in einem Abfallbehälter, und verwenden Sie insgesamt 6 bis 8 Millimeter des Schneider-Mediums, um die Zellen viermal zu waschen, wobei das Medium nach jedem Waschen entsorgt wird.

Nachdem Sie frisches Medium hinzugefügt haben, um die Kammer wieder aufzufüllen, fahren Sie mit der Bildgebung fort. Um Zugang zu dem Medium zum Waschen und Auswaschen von Medikamenten zu erhalten, entfernen Sie vorsichtig den oberen Deckglas von der Rosettenkammer, während Sie am Mikroskop befestigt sind. Alternativ kann eine Petrischale mit Glasboden, die ähnlich wie die Deckgläser mit Concanavalin A behandelt wurde, für die Bildgebung lebender Zellen verwendet werden.

Nachdem Sie 500 Mikroliter S2-Zellen, die mit KLP61F dsRNA behandelt wurden, auf einen Concanavals A-Deckglas gesät und die Zellen anhaften gelassen haben, fügen Sie 1,5 Milliliter des Schneider-Mediums hinzu, um das endgültige Volumen auf zwei Milliliter zu bringen. Sobald die Zellen gemäß dem Textprotokoll in der Mitose arretiert wurden, fügen Sie einen mikromolaren STLC hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang, damit sich Monopole bilden können. Waschen Sie den STLC aus, indem Sie die Deckgläser mit zwei Millilitern frischem Schneider's Medium dreimal ausspülen.

Um die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten der bipolaren Spindelbildung zu fixieren und die Kinetochor-Bindungsstellen zu beurteilen, beginnen Sie mit der Verwendung von zwei Millilitern 1X BRB80, um die Deckgläser schnell zu spülen. In einer chemischen Haube zwei Milliliter 10 % PFA in 1X BRB80 geben und 10 Minuten inkubieren. Um die Zellen zu permeabilisieren, fügen Sie 1% Triton X in 1X PBS hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang.

Verwenden Sie dann zwei Milliliter 0,1%Triton X in 1X PBS, um die Zellen dreimal zu waschen. Übertragen Sie dann den Deckglas mit der Zellseite nach oben auf eine Folie Parafilm in einer 150-Millimeter-Petrischale. Geben Sie 150 Mikroliter Boiled Donkey Serum (BDS) auf die Deckgläser und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur, um die unspezifische Antikörperbindung zu blockieren.

Nach der Inkubation wird der Block entfernt und 150 Mikroliter Primärantikörper hinzugefügt, die gemäß dem Textprotokoll hergestellt wurden, bevor eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert wird. Nach dreimaligem Waschen der Deckgläser werden in BDS verdünnte Fluor-4-Sekundärantikörper hinzugefügt und 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nachdem die Deckgläser dreimal gewaschen wurden, inkubieren Sie sie fünf Minuten lang mit 150 Mikrolitern BDS, die ein Mikrogramm pro Milliliter DAPI enthalten.

Nachdem die Deckgläser zweimal gewaschen wurden, verwenden Sie acht Mikroliter Eindeckmedium, um die Probe mit der Zellseite nach unten auf einen drei mal einen Zoll großen Objektträger zu montieren. Verwende Nagellack, um die Ecken zu lackieren. Verwenden Sie schließlich ein 100X-Objektiv, um Zellen mit bipolaren Spindeln abzubilden, die Eg5-mCherry exprimieren.

Nehmen wir eine Z-Serie, die aus 30 Ebenen im Abstand von 0,2 Mikrometern in allen Kanälen besteht. Analysieren Sie das Kinetochor und die Mikrotubuli sorgfältig, um den Anhaftungszustand zu bestimmen. KLP61F wird benötigt, um bipolare Spindeln in Drosophila S2-Zellen zu bilden; niedermolekulare Kinesin-5-Hemmer sind dagegen jedoch unwirksam.

Diese Bilder zeigen, dass das humane Kinesin-5 Eg5 die Funktion von KLP61F in Drosophila S2-Zellen retten kann. Wenn der Kinesin-5-Inhibitor STLC hinzugefügt wird, sinken die Mikrotubuli-assoziierten Spiegel des Motors und die Spindel kollabiert, was zu einem Monopol in Zellen führt, denen endogenes KLP61F als Ergebnis der erfolgreichen RNA I fehlt.Diese Abbildung zeigt, dass die Kinesin-5-Hemmung durch Auswaschen des Medikaments rückgängig gemacht werden kann, und die Wiederherstellung einer bipolaren Spindel kann im Laufe der Zeit verfolgt werden. Nach Entfernung des Inhibitors assoziiert Eg5-mCherry wieder mit den Mikrotubuli, und die Zellen können in eine bipolare Anaphase übergehen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Drosophila S2-Zelllinie erzeugt, die empfindlich auf einen niedermolekularen Inhibitor von Kinesin-5 reagiert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa sechs Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, im Voraus zu planen, da diese Methode einige Tage im Voraus vorbereitet werden muss.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit niedermolekularen Inhibitoren gefährlich sein kann, also tragen Sie immer Handschuhe. Der Aufbau humanisierter Fruchtfliegenzellen kann durch die Anwendung von Crispr-Cas 9-Technologien und den Ersatz von Drosophila Kinesin-5 durch sein menschliches Gegenstück nachgewiesen werden. Die Entwicklung humanisierter Drosophila-Zellen soll in Zukunft unser Verständnis der Fehlerkorrektur und anderer essentieller zellulärer Prozesse verbessern.