Biolumineszenz-basierte Tumor Quantifizierung Verfahren zur Überwachung Tumorprogression und Therapieeffekte bei den Maus-Lymphom-Modelle

Das übergeordnete Ziel dieses bildgebenden Verfahrens besteht darin, die Verfahren zur Erfassung von Biolumineszenz und die Bildanalysen zu standardisieren, um quantitative Daten für den Vergleich innerhalb oder zwischen verschiedenen Experimenten zu erhalten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Biolumineszenzbildgebung zu beantworten, beispielsweise: Wie können Bilddaten auf reproduzierbare Weise quantifiziert werden? Die wichtigsten Vorteile dieser Technik sind, dass sie in jeder Tierversuchseinrichtung, die über ein Biolumineszenz-Imager verfügt, einfach einzurichten ist, und dass keine komplexen Berechnungen erforderlich sind.

Schalten Sie das Bildgebungsgerät ein und öffnen Sie die Aufnahmesoftware. Klicken Sie auf „Initialisieren“, um Kamera, Stages und Objektive zu initialisieren. Nachdem Sie die angemessene Sedierungstiefe durch fehlende Reaktion auf einen Zehenstich bestätigt haben, legen Sie eine Maus auf eine Wärmematte und tragen Augensalbe auf.

Verwenden Sie dann eine 25-Gauge-Nadel, um 100 Mikroliter frisch zubereitete D-Luciferin-Kaliumsalzlösung intraperitoneal zu injizieren. In diesem Fall exprimieren die Tumorzellen Feuerflieluciferase. Dieses Protein oxidiert D-Luciferin und erzeugt Licht, das mit dem Bildgebungssystem detektiert werden kann.

Nach 10 Minuten das Tier in Bauchlage in das Bildgebungsgerät legen, sodass der Rücken zur Kamera zeigt und die Position so flach wie möglich ist. Die automatische Belichtungsfunktion auswählen und auf „Acquire“ klicken, um ein hinteres Bild des Tieres aufzunehmen. Anschließend das Tier in Rückenlage bringen und die vorderen Gliedmaßen auseinanderlegen, damit sie die Brust nicht verdecken.

Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen für die automatische Belichtung weiterhin ausgewählt ist, und nehmen Sie ein vorderes Bild des Tieres auf. Danach bringen Sie die Maus zurück auf die Wärmematte, bis sie sich vollständig erholt hat; zu diesem Zeitpunkt kann das Tier in seinen Käfig zurückgebracht werden. Um die Biolumineszenz zu quantifizieren, klicken Sie in der Menüleiste auf Ansicht und wählen Sie die Werkzeugpalette aus, falls diese noch nicht angezeigt wird.

Klicken Sie anschließend auf den Reiter „Region of Interest“-Werkzeug, wählen Sie die Kontur-Schaltfläche und aktivieren Sie „Freihandzeichnen“. Verwenden Sie das Freihandzeichnen-Werkzeug, um entlang der Kanten der gesamten Maus oder eines bestimmten Bereichs in der Vorderansichtsbildaufnahme die Region von Interesse zu markieren, und schließen Sie die Kontur mit einem Rechtsklick. Wählen Sie Radiance im Einheiten-Auswahlfeld oben links im Bild, falls noch nicht geschehen.

Anschließend den Wert im Feld „Total Flux Photonen pro Sekunde“ ablesen, um den Photonenfluss zu bestimmen. Danach im Menü „Ansicht“ die Messungen des interessierenden Bereichs aufrufen. Nachdem die Analyse für das Bild der Rückansicht wiederholt wurde, die für beide Ansichten ermittelten Photonenflusswerte addieren, um den Luminoscore zu erhalten.

In diesem Experiment war der Tumor bereits 10 Minuten nach der Injektion nachweisbar. Die Bilder allein bestätigen, dass sich die Tumorzellen an der korrekten Stelle befinden. Die Quantifizierung der Biolumineszenz zeigte jedoch einen deutlichen Unterschied zwischen den Tieren, die Injektionen erhielten, und denen, die keine erhielten.

Interessanterweise war das Signal im subkutanen Modell 100-mal höher als im primären intraokularen Lymphom-Modell, was mit der Anzahl injizierter Zellen übereinstimmt. Hier zeigen repräsentative Bilder des Tumorwachstums bei Kontroll- und CpG-behandelten Mäusen mit primärem intraokularem Lymphom, dass nach einer ausreichenden Zeit Metastasen in der Kontrollgruppe auftreten. Obwohl der Primärtumor nicht empfindlich gegenüber der Behandlung war, wurden in der CpG-behandelten Gruppe weniger Metastasen beobachtet.

Tatsächlich zeigt die quantitative Analyse der Tumormasse in jeder Gruppe, dass CpG die Tumorentwicklung verlangsamt und nach 28 Tagen einen statistisch signifikanten Unterschied in der Tumolumineszenz zwischen behandelten und Kontrollgruppen bewirkt. In diesem subkutanen Modell wurden zwei Tumore auf jeder Seite der Maus transplantiert, wobei die Behandlung am Tag null in situ auf einer Seite verabreicht wurde und der kontralaterale Tumor als dessen Kontrolle diente. Anschließend wurden pro Maus zwei interessierende Bereiche definiert und das Verhältnis der Luminoskore zwischen der behandelten und der Kontrollseite gemessen.

13 Tage nach der Verabreichung der Behandlung wurde eine signifikante Abnahme des Luminoscore-Verhältnisses beobachtet, was darauf hinweist, dass der behandelte Tumor resorbiert wurde, wie auch durch die entsprechenden Biolumineszenzbilder belegt wird. Sobald die Analyse durchgeführt wird, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei Minuten pro Tier abgeschlossen werden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die qualitative Lokalisation der Tumorstelle angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu Tumorzell-Homing- oder Metastasierungsmechanismen zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher und den Bereich der Biolumineszenzbildgebung, um das Tumorwachstum in präklinischen Kleintiermodellen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Biolumineszenzbildgebung durchführt, um die Tumorlast auf reproduzierbare Weise zu quantifizieren. Vergessen Sie nicht, dass der Umgang mit Kleintieren und chirurgischen Instrumenten äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie die ordnungsgemäße Sterilisation der Instrumente getroffen werden sollten, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.