DAMiD-seq: Genomweite Mapping von Protein-DNA-Wechselwirkungen von Hochdurchsatz-Sequenzierung von Adenin-methylierten DNA-Fragmenten

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, genomische DNA-Sequenzen, die mit Proteinen von Interesse in tierischen Zellen assoziiert sind, durch Hochdurchsatzsequenzierung zu detektieren. Diese Technik kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Untersuchung der nuklearen Organisation und Transkription oder Regulation in Säugetierzellen zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung genomischer Regionen, die mit dem nukleären Amyloid oder mit spezifischen Transkriptionsfaktoren assoziiert sind. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass die Hochdurchsatz-Sequenzierung eine höhere Auflösung bietet als das ursprüngliche DamID-Asset mit DNA-Microarrays und dass diese Technik eine Kreuzanalyse mit unseren Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten ermöglicht.

Das Verfahren wird von Brennan Olson, einem Techniker aus unserem Labor, vorgeführt. Befolgen Sie zunächst das Textprotokoll, um das interessierende Gen in den DamID-Vektor zu klonen. Als nächstes generieren Sie lentivirale Stämme, die DamV5 POY und V5-Dam exprimieren, unter Verwendung eines lentiviralen Expressionssystems.

Der DamID-Vektor wird mit den lentiviralen Verpackungsplasmiden nach dem Vorwärtstransfektionsverfahren gemäß dem Protokoll des Herstellers kotransfiziert. Stellen Sie sicher, dass Sie einen Filtrationsschritt mit einem Nullkomma-Vier-Fünf-Mikron-PVDF-Filter einbauen. Bereiten Sie sich nun darauf vor, die Zellen mit dem Lentivirus zu infizieren.

Geben Sie die adhärenten Zellen einen Tag im Voraus auf Sechs-Well-Platten. Nehmen Sie weiterhin Antibiotika ein. Das Ziel ist es, am nächsten Tag eine 50%ige Konfluenz für die Infektion zu haben.

Nehmen Sie am nächsten Tag die gefrorenen Überstände von DamV5 POY und V5-Dam aus dem Gefrierschrank und legen Sie sie zum Auftauen in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad. Entfernen Sie auf den Kulturplatten den Nährboden und ersetzen Sie ihn durch einen halben Milliliter frischen Nährboden ohne Antibiotika. Befüllen Sie dann die Vertiefungen mit einem Milliliter aufgetautem Lentivirus.

Beladen Sie zwei Vertiefungen mit V5-Dam, zwei Vertiefungen mit DamV5 POY und zwei Vertiefungen ohne Lentivirus als Negativkontrolle. Schwenken Sie die Lösung auf den Zellen und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Ersetzen Sie 24 Stunden später die viralen Suspensionen auf den Zellen durch zwei Milliliter Wachstumsmedien ohne Antibiotika.

Setzen Sie dann die Inkubation für weitere 48 Stunden fort. Schließen Sie diesen Vorgang zwei Tage später ab, indem Sie dem Textprotokoll folgen, um die genomische DNA zu isolieren, was etwa eine Stunde dauern sollte. Amplifizieren Sie dann die Adenin-methylierten DNA-Fragmente aus der genomischen DNA.

Dieser Vorgang dauert etwa zwei bis drei Tage, und die Details sind im Textprotokoll enthalten. Für dieses Verfahren fragmentieren Sie zunächst die amplifizierte Adenin-methylierte DNA. Vor der Verwendung der DNA-Fragmentase ist es wichtig, zuerst ihre Stärke zu messen, um die geeignete Verdauungszeit zu bestimmen.

Verwenden Sie für diesen diagnostischen Test alle verfügbaren aufgereinigten Methyl-PCR-Produkte. Beginnen Sie mit der Einrichtung eines Mastermixes, der aus sechs Mikrogramm DNA und 12 Mikrolitern 10-fachem Fragmentase-Puffer besteht, und füllen Sie ihn mit Wasser auf 114 Mikroliter. Dann den Fragmentase-Fond drei Sekunden lang vortexen und sechs Mikroliter in den Mastermix geben, so dass insgesamt 120 Mikroliter entstehen.

Den Mastermix dann drei Sekunden lang vortexen. Füllen Sie nun fünf Reaktionsgefäße mit 20 Mikroliter Aliquots Mastermix und inkubieren Sie alle sechs Röhrchen bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach fünf Minuten ein Röhrchen und fügen Sie fünf Mikroliter EDTA hinzu, um die Reaktion zu stoppen.

Tun Sie dies alle 10 Minuten, bis alle Reaktionsgefäße eingesammelt sind. Analysieren Sie nun 12 Komma fünf Mikroliter aus jedem Röhrchen, was etwa einem halben Mikrogramm DNA entspricht, und die gleiche Menge an unverdauter DNA auf einem Agorose-Gel. Bestimmen Sie aus dem Gel die minimale Zeit, die benötigt wird, um den Großteil des Abstrichs auf etwa null Komma zwei Kilobasen zu verdauen.

Verwenden Sie dies als maximale Verdauungszeit. Richten Sie nun die eigentliche Fragmentierung ein, wie beim Pretest, und stoppen Sie die Verdauung bei sechs gleichmäßig verteilten Zeitpunkten, einschließlich fünf Minuten, und berechnen Sie die maximale Zeit. Ziehen Sie nach dem Aufschluss die sechs Aufschlüsse und reinigen Sie sie mit einem PCR-Aufreinigungskit oder reversiblen Festphasen-Immobilisierungskügelchen.

Verdünnen Sie die gereinigte DNA in etwa 15 Mikrolitern EB-Puffer. Die nächsten Schritte bestehen darin, die Enden der fragmentierten DNA zu reparieren, Adenin-Überhänge hinzuzufügen, die Sequenzierungsadapter zu ligadieren und die Y-förmigen Adapter in doppelsträngige DNA umzuwandeln. Diese Schritte sind alle im Textprotokoll detailliert beschrieben und sollten nicht länger als zwei Tage dauern.

Nach dem Litieren der Sequenzierungsadapter auf fragmentierte DNA und der Umwandlung von Y-förmigen Adaptern in doppelsträngige DNA werden Fragmente der gewünschten Größe ausgewählt. Beginnen Sie mit der Herstellung eines zweiprozentigen Agorose-Gels in TAE und fügen Sie unter Vorsichtsmaßnahmen Ethidiumbromid bis zu einer Endkonzentration von 500 Nanogramm pro Milliliter hinzu. Machen Sie genügend Bahnen, damit alle Proben und zwei Leitern von leeren Bahnen begrenzt werden.

Fügen Sie nun acht Mikroliter Ladefarbstoff zu 10 Mikrolitern jedes DNA-Eluats hinzu und bereiten Sie die 1 Kb Plus-Leiter mit 6X Ladefarbstoff und Wasser im Verhältnis eins zu eins bis vier vor. Laden Sie dann die Gelbahnen in der folgenden Reihenfolge: DNA-Leiter, DNA-Eluate und eine weitere DNA-Leiter. Lassen Sie das Gel nach dem Laden mit 120 Volt pro 60 Minuten laufen.

Setzen Sie später eine Schutzbrille und einen Gesichtsschutz auf, um das Gel mit UV-Licht kurz zu betrachten. Überprüfen Sie die DNA-Leitern, um zu sehen, ob das Gel weit genug abgelaufen ist, so dass drei Gelscheiben zwischen 300 und 400 Basenpaaren herausgeschnitten werden können. Schneiden Sie dann die Bänder zwischen 300 und 400 Basenpaaren aus jeder Bahn aus, wobei Sie immer eine neue Klinge für jede Bahn verwenden.

Entfernen Sie so wenig wie möglich von dem Gel, um jede Gelscheibe idealerweise unter 100 Mikroliter zu bringen, und geben Sie jedes in ein eigenes Mikrofugenröhrchen. Als nächstes extrahieren Sie die DNA aus den Gelscheiben gemäß dem Textprotokoll. Befolgen Sie weiterhin das Textprotokoll zur Anreicherung modifizierter Fragmente aus der extrahierten DNA mit dem Sequenzierungsadapter.

Lassen Sie dann eine qualitativ hochwertige Analyse der gereinigten DNA mit einem Bioanalysator durchführen und reichen Sie sie, wenn sie den Erwartungen entspricht, zur Sequenzierung ein. Lentiviren wurden so verändert, dass sie ein Dam-V5-lamin B1-Fusionsprotein exprimieren, das durch Aminofluoreszenzfärbung nachweislich mit dem endogenen Lamin B1-Protein kolokalisiert ist. Dieses Lentivirus und ein Kontroll-Lentivirus, das das Dam-V5-Fusionsprotein exprimiert, wurden beide zur Infektion von C2C12-Myoblasten der Maus verwendet.

Die DNA wurde, wie beschrieben, gesammelt und auf Adenin-methylierte Fragmente amplifiziert und dann sequenziert. Für Chromosom eins wurden dann Genom-NL-Interaktionskarten erstellt. Eine Spur zeigt die log2-RPKM-Verhältnisse.

Die andere Spur zeigt die mit der Lamina verbundenen Domänen in Schwarz. Dies sind Bereiche, die deutlich stärker mit Dam Lamin B1 als mit Kontrolldam assoziiert sind. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von zwei Wochen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie DNA-Sequenzen, die mit Proteinen von Interesse verbunden sind, durch Hochdurchsatzsequenzierung, gekoppelt an DamID, nachgewiesen werden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Ethidiumbromid und UV-Licht äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Abkühlen des Gels vor der Zugabe von Ethidiumbromid und das Tragen eines Augenschutzes und eines Gesichtsschutzes sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.