Primäre Endodermal Epithelial Cell Culture aus dem Dottersack-Membran der japanischen Wachtel Embry

Das übergeordnete Ziel dieses ex vivo-Explantenverfahrens besteht darin, die Gewinnung und Anwendung aviarer endodermaler Epithelzellen zu verbessern, um die Funktion von Enzymen und Proteinen bei der Vermittlung der Nährstoffnutzung durch aviare Embryonen zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Lipidnutzung während der aviares Embryogenese zu beantworten, beispielsweise wie Yolk-Lipide im späteren Entwicklungsstadium vom Dottersack zum Embryo verpackt und transportiert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir funktionstüchtige endodermale Epithelzellen aus der Dottersackmembran von japanischen Wachteln erfolgreich gewinnen können, die als Modell zur Untersuchung der aviares embryonalen Entwicklung verwendet werden können.

Beginnen Sie mit der Herstellung einer 10x PBS-Lösung, wie im Textprotokoll beschrieben. Verdünnen Sie diese Stammlösung im Verhältnis 1:10, um 1x PBS herzustellen, das zum Waschen der Dottersackmembran während der Entoderm-Dissektion verwendet wird. Um das Wachstumsmedium für entodermale epitheliale Zellen, oder EECs, vorzubereiten, ergänzen Sie zunächst DMEM/F-12 mit 10 % Neugeborenen-Kalbsserum und 1 % Penicillin-Streptomycin-Amphotericin-Lösung.

Anschließend führen Sie die Sonde eines pH-Meters in zuvor vorbereitetes DMEM ein. Geben Sie dreifach normales HCl tropfenweise zum Medium hinzu, bis der pH-Wert auf 7,2 eingestellt ist. Nachdem Sie etwa zwei Dutzend befruchtete Wachtel-Eier gesammelt haben, stellen Sie diese senkrecht in Eierbehälter, sodass ihre breiten, nicht zugespitzten Enden, an denen sich die Luftkammern befinden, nach oben zeigen.

Anschließend die Eier in einen gut belüfteten Inkubator überführen, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Nach fünf Tagen Inkubation die Eier mit einem Eierprüfer untersuchen. Wenn sich die Embryonen normal entwickelt haben, erwartet man eine kreisförmige Struktur aus Kapillargefäßen unterhalb der Luftkammer.

Wählen Sie ein Ei mit normaler Kapillarentwicklung aus und reinigen Sie die Schale mit frischem Wasser und 75 % Ethanol. Öffnen Sie anschließend die Eischale an der Luftkammerstellung mit einer Schere. Geben Sie mithilfe einer Pinzette vorsichtig den Inhalt des Eis in eine leere 10 cm-Kulturschale.

Verwenden Sie dann eine Schere, um das Embryo, das Eiweiß und das Eigelb von der Dottersackmembran, abgekürzt als YSM, zu trennen. Nach der Isolierung wird die YSM dreimal in 1x PBS gewaschen und anschließend in eine neue 10 cm-Schale mit PBS überführt. Danach stellen Sie die Schale unter ein Stereomikroskop.

Anschließend entfernen Sie mit einer Schere jegliches verbliebene Eiweiß, das an der äußeren Ektodermschicht der YSM angrenzt. Heben Sie dann mit einer Pinzette das durchscheinende Ektoderm und das rote kapillare strukturelle Mesoderm von der Kante des Mesoderms auf der Dottersackmembran an. Ziehen Sie anschließend das Ektoderm und Mesoderm vorsichtig gemeinsam ab, um die darunterliegende Endodermschicht zu isolieren.

Dann halten Sie mit einer Pinzette die gelbe endodermale Zellschicht der Membran fest. Greifen Sie mit einer weiteren Pinzette das kapilläre Mesoderm an und ziehen Sie das Mesoderm von der Übergangskante zwischen Mesoderm und Endoderm weg. Schneiden Sie mit einer Schere die verbleibende gelbe Endodermschicht ab und überführen Sie sie in die sechs Zentimeter große Kulturschale, die mit Wachstumsmedium gefüllt ist.

Mit einer Pipette das hellgelbe Endoderm von der sechs Zentimeter großen Kulturschale nach der YSM-Sammlung in ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen überführen und 15 mL zuvor vorbereitetes Wachstumsmedium hinzufügen. Das Konische in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius stellen, bis alle Gewebesammlungen abgeschlossen sind. Beginnen Sie damit, 6,5 Einheiten Typ-IV-Kollagenase in 10 mL DMEM aufzulösen.

Als Nächstes die Röhrchen mit Endoderm bei 130 × g für drei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Nach der Zentrifugation das Medium abpipettieren und mit einer Pipette alle Endoderm-Proben in eine sechs Zentimeter große Kulturschale überführen. Anschließend ein Milliliter Kollagenlösung zur Schale hinzufügen.

Mit einer gebogenen Schere schneiden Sie das aus vier Wachtel-Embryonen gewonnene Endoderm in Stücke von etwa zwei bis drei Millimetern Größe. Anschließend sammeln Sie die Stücke in einem 50-mL-Zentrifugenröhrchen und geben neun Milliliter frische Kollagenase-Lösung hinzu, die sich bereits im 50-mL-Zentrifugenröhrchen befindet. Um die Zellproliferation während des Explantat-Stadiums zu verbessern, stellen Sie das Röhrchen in ein schüttelndes Wasserbad, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist.

Anschließend das Konische 30 Minuten lang inkubieren, um das Gewebe partiell mit Kollagenase zu verdauen. Die partielle proteolytische Verdauung ist der wichtigste Schritt, um die Gewinnung von Zellen aus dem Dotterbeutelmembran-Endoderm zu verbessern. Unsere Daten zeigen eine signifikante Verbesserung der Erfolgsrate der Zellkultur und Zellproliferation durch das Kollagenase-Verdauungsverfahren.

Nach der Kollagenase-Digestion das Gewebe bei 130 × g für drei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und anschließend die Überstandfraktion mit einer Pipette entfernen. Den Pellet weiterhin waschen, indem er in 20 mL DMEM resuspendiert wird. Das Röhrchen wie zuvor beschrieben zentrifugieren, danach den Überstand entfernen und den Pellet in 12 mL Wachstumsmedium resuspendieren.

Dann vorsichtig 500 Mikroliter der Suspension in jede Vertiefung einer 24-Loch-Platte geben. Die Endoderm-Explantate zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2 inkubieren. Während dieser Zeit ist mit einer Proliferation der Zellen aus dem Gewebe heraus zu rechnen.

Anschließend inkubieren Sie die Zellen weitere zwei Tage. Danach führen Sie einen Zellviabilitätsassay durch und visualisieren die Ergebnisse mithilfe eines Plattenlesegeräts. Im Anschluss führen Sie eine RT-qPCR durch, um die Expressionslevel der gewünschten Marker in EECs zu bewerten, und überprüfen die Produktgröße der RT-qPCR mittels Gelelektrophorese, wie im Textprotokoll beschrieben.

Im Vergleich zu unbehandelten Explantaten zeigten die teilweise mit Kollagenase behandelten Explantaten eine signifikant erhöhte Zellproliferation, wie in diesen Grafiken dargestellt und durch einen gepaarten t-Test bestätigt, was den Erfolg des Kultursystems belegt. Um die Wirkungen anderer Enzyme zu bewerten, wurden Zellviabilitätsassays für Gewebe durchgeführt, die entweder mit Kollagenase und Dispase oder nur mit Kollagenase behandelt wurden. Während der ersten fünf Tage der Inkubation war das Zellwachstum unter beiden Bedingungen ähnlich.

Jedoch zeigten nur mit Kollagenase behandelte EECs von Tag sechs bis neun eine stetige Proliferation, was darauf hindeutet, dass eine partielle Verdauung mit diesem Enzym das Wachstum verbessert und bevorzugt eingesetzt werden sollte. Bei der Visualisierung kultivierter EECs zeigten diese adipocytenähnliche Merkmale großer, runder Lipidtröpfchen, wie hier dargestellt. Solche Zellen waren außerdem positiv für die Fettrot-O-Färbung, die typischerweise zur Identifizierung von Adipozyten verwendet wird.

Untermauerung dieser morphologischen Daten zeigte die Echtzeit-quantitative PCR, dass kultivierte EECs hohe Spiegel von SOAT1 aufweisen, einem Protein, das Cholesterinester aus Cholesterin synthetisiert. Dies deutet weiter darauf hin, dass kultivierte EECs die korrekten physiologischen Eigenschaften von Adipozyten aufweisen. Wichtig ist, dass bei Exposition der EECs gegenüber IBMX und Forskolin, Faktoren, die den Spiegel von zyklischem Adenosinmonophosphat, oder cAMP, erhöhen, und anschließender Kultivierung für 24 Stunden, beide Behandlungen die Expression von SOAT1 stimulierten, was auf mögliche Mechanismen der Regulation von SOAT1 und der Lipidnutzung im YSM hindeutet.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in etwa vier Stunden durchgeführt werden, innerhalb derer mindestens drei Proben gesammelt werden können. Nach diesem Verfahren können Methoden wie SOAT1- oder andere enzymatische Aktivitätsassays sowie ähnliche visuelle Bestätigungen durchgeführt werden. Solche Assays können helfen, weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise wie bestimmte Proteine und Makronährstoffe in die späteren Phasen der embryonalen Entwicklung involviert sind.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der embryonalen Nutzung von Nährstoffen den Weg, um die möglichen Mechanismen zu erforschen, durch die Nährstoffe in einem embryonalen Modell von Vögeln aufgenommen und transportiert werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie in der Lage sein, Endodermgewebe aus Vogelembryonen zu gewinnen, und außerdem wissen, wie man EECs kultiviert, um den Transport und die Nutzung embryonaler Nährstoffe mithilfe des Vogelmodells zu untersuchen.