Identifikation von Kinesin-1 Cargos Mit Fluoreszenzmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, die Kinesin-1-Ladungen mittels Fluoreszenzmikroskopie zu identifizieren. Diese Methode hilft uns, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der molekularen Motoren zu beantworten, z. B. welche Frachten von Kinesinen und Myosinen transportiert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die dominanten negativen KIF5B-Mutanten uns helfen können, diese Fracht mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie visuell zu identifizieren.

Bildgebung von lebenden Zellen oder indirekter Fluoreszenz bei 40X oder darunter werden zunächst 0,2 bis 0,3 Millionen HeLa-Zellen in einem Milliliter des vollständigen Mediums in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte gegeben. Züchten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid. Für indirekte Immunfluoreszenzstudien mit Vergrößerungen über dem 40-fachen in einer Biosicherheitswerkbank sollten Sie zur Vermeidung einer Kontamination absoluten Alkohol verwenden, um die Deckgläser zu waschen, und sie zum Trocknen in die Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte stellen.

Wenn die Deckgläser getrocknet sind, legen Sie sie in die Vertiefungen und säen Sie 0,2 bis 0,3 Millionen Zellen in einem Milliliter vollständigem DMEM in jeder Vertiefung der Platte. Kultivieren Sie die Zellen über Nacht. Am folgenden Tag verwenden Sie in einer Biosicherheitswerkbank 0,1 Milliliter Transfektionsmedium, um 0,6 Mikrogramm eines tdTomato-markierten Wildtyp- oder motorlosen KIF5B-Expressionsplasmids mit oder ohne Plasmid, das ein Kandidatenfrachtprotein exprimiert, zu verdünnen.

In ein weiteres 1,6-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben Sie 1,8 Mikroliter des Transfektionsreagenzes zu 0,1 Millilitern Transfektionsmedium. Dann fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie anschließend 0,1 Milliliter des verdünnten Transfektionsreagenzes zu den verdünnten DNA-Proben.

Drehen Sie die Röhrchen um, um den Inhalt zu mischen, und drehen Sie sie fünf Sekunden lang herunter. Anschließend werden die Proben 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Während der Inkubationszeit für die Bildung des Transfektionskomplexes verwenden Sie PBS, um die Zellen dreimal zu waschen.

Geben Sie dann 0,8 Milliliter vorgewärmtes Transfektionsmedium in jede Vertiefung und stellen Sie die Platten wieder in den Inkubator. Nachdem das verdünnte Transfektionsreagenz 45 Minuten lang inkubiert wurde, geben Sie 0,2 Milliliter der Lösung tropfenweise in jede Vertiefung der Platte. Schütteln Sie die Sechs-Well-Platte fünf Sekunden lang vorsichtig und stellen Sie sie für sechs bis acht Stunden in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator zurück.

Verwenden Sie dann vollständiges DMEM, um das Medium auszutauschen. Um nach weiteren 16 Stunden Inkubation eine Bildgebung von lebenden Zellen durchzuführen, geben Sie den DNA-Interkalationsfleck Hoechst 33342 in das Medium bis zu einer Endkonzentration von 1 Mikromolar und inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Untersuchen Sie dann mit einem 40-fachen Objektiv die Zellen auf die Expression fluoreszierender Proteine.

So führen Sie eine indirekte Immunfluoreszenz an Zellen durch, die mit einem Transfektionsreagenz inkubiert wurden: Nach der Herstellung von Paraformaldehyd gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie PBS bei Raumtemperatur, um die Zellen zu waschen, indem Sie die Sechs-Well-Platte fünf Sekunden lang schwenken. Pro Vertiefung einen Milliliter frisch zubereitetes 4%iges Paraformaldehyd und PBS zugeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Verwenden Sie dann PBS, um die Zellen einmal zu waschen, indem Sie die Platte schwenken und die Lösung verwerfen.

Geben Sie anschließend einen Milliliter 0,1 % Triton-X 100 in PBS in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Zellen zu permeabilisieren. Waschen Sie die Zellen dann viermal mit PBS und entsorgen Sie die Lösung nach jedem Waschen. Fügen Sie Primärantikörper hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur unter Schaukeln für vier Stunden.

Nach der Inkubation verwenden Sie PBS, um die Zellen viermal zu waschen, indem Sie die Platte schwenken. Dann fügen Sie einen Milliliter Fluoreszenzfarbstoff-konjugierte Sekundärantikörper hinzu und inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur unter Schaukeln für zwei Stunden. Nachdem Sie die Zellen viermal mit PBS gewaschen haben, fügen Sie einen Milliliter DAPI hinzu und inkubieren Sie zehn Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.

Wenn Sie Deckgläser mit den Proben verwenden, tragen Sie 10 Mikroliter Eindecklösung auf die Mitte des Objektträgers auf und montieren Sie ein Deckglas über die Eindecklösung. Anschließend im Dunkeln bei Zimmertemperatur über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag die Ränder mit Nagellack versiegeln und im Dunkeln in einem Abzug über Nacht inkubieren.

Verwenden Sie für die Fluoreszenzmikroskopie ein 40X-Objektiv mit den Filtersets für DAPI, CFP, FITC und Cy3, falls zutreffend. Wie hier gezeigt, trat exogen exprimiertes Wildtyp-KIFB homogen im Zytoplasma auf, während c-MYC hauptsächlich im Zellkern auftrat. Die motorlose KIF5B-Mutante bildete jedoch Aggregate im Zytoplasma und dies führte zur Aggregation von c-MYC.

Darüber hinaus induzierte das motorlose KIF5B auch die Aggregation des endogenen c-MYC und des Transkriptionsfaktors p53, was darauf hindeutet, dass c-MYC und p53 beide die Fracht von Kinesin-1 sind und KIF5B die subzelluläre Lokalisation beider endogener Proteine reguliert. Diese Abbildung zeigt, dass die Bewegung von Transkriptionsfaktoren durch KIF5B spezifisch zu sein scheint, da die Expression der motorlosen KIF5B-Mutante die subzelluläre Lokalisation von c-Fos nicht beeinflusste oder zu einer Aggregation führte. Diese Daten zeigen, dass die in diesem Video gezeigte Methode die Identifizierung von Kinesin-1-Ladungen mit hoher Spezifität ermöglicht.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Kinesine am besten für Zellen geeignet sind, die ein großes Volumen an Zytoplasma haben, so dass eine Aggregation im Zytoplasma leicht beobachtet werden kann. Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der molekularen Motoren, ähnliche dominante negative Mutanten anderer Kinesine und Myosine zu konstruieren, um ihre speziellen Frachten zu identifizieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die dominante negative Mutante eines molekularen Motors nutzen können, um diese Fracht mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie zu identifizieren.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Phäno, Ethidiumbromid und Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann und dass immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, um einen direkten Hautkontakt mit ihnen zu vermeiden, während Sie dieses Verfahren durchführen. Danke fürs Zuschauen. Viel Glück bei Ihrem Experiment.