Name: Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-25T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung infiltrierender Leukozyten aus Mäusehaut mittels enzymatischer Digestion und Gradiententrennung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Mechanismen bei Hauterkrankungen wie atopischer Dermatitis.

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Die National Institutes of Health (NIH R15 NS067536-01A1 zu DC), der National Vulvodynia Association (Auszeichnung an DC) und Macalester College unterstützt diese Arbeit. CB Im Rahmen eines Stipendiums der Macalester College Beckman Scholars Program, durch das Arnold und Mabel Beckman-Stiftung. BTF und TM werden von JDRF 2-2011-662 unterstützt. Wir danken Dr. Jason Schenkel und Dr. Juliana Lewis für die technische Beratung, und alle aktuellen und ehemaligen Mitglieder des Chatterjea Labor für ihre Hilfe und Unterstützung.

Hinweis: 8-12 Wochen alte weibliche ND4 Swiss Webster-Mäusen, konventionell mit freiem Zugang zu Futter und Wasser untergebracht sind, wurden für diese Studien verwendet Das verwendete Experimentalprotokoll (B13S1) wurde vom Macalester College IACUC genehmigt.. 1. Sensibilisierung und Herausforderung mit Oxazolon <ol><li> Tag 0 <ol><li> Bereiten Anästhesieraum durch Zugabe von 3 ml Isofluran auf saugfähige Handtücher unterhalb Masche am unteren Rand eines 4 L mit Deckel Glas platziert. Zur ND4 weiblichen Mäusen hier verwendete Zeit in der Kammer 30-60 sec, bis das Objekt ausreichend betäubt; Optimierung der Verabreichung des Anästhetikums für die Mausstamm verwendet wird. </li><li> Rasur narkotisierten Maus hin und flankieren mit einem Tierhaarschneider. </li></ol></li><li> Tag 1 <ol><li> Einen 2% igen Lösung von 4-Ethoxymethylen-2-phenyl-2-oxazolin-5-on (Ox) in absolutem Ethanol und Inkubation bei 50 ° C für 15 min auf einer rotierenden Platte in einem Inkubator. </li><li> Kurz betäubenMäuse mit Isofluran-Narkose, wie in 1.1.1 beschrieben und anwenden 100 ul 2% Ox in mehreren Serienanwendungen von etwa 20 &amp; mgr; l jeder der rasierten Rücken. Warten Sie 5-10 Sekunden zwischen seriellen Anwendungen für die Lösung zu trocknen. </li><li> Achten Sie darauf, zu verschütten die 2% Ox-Lösung auf anderen als den Rücken Regionen, und warten auf die Lösung, um zwischen Anwendungen zu trocknen. </li></ol></li><li> Tage 5-7 <ol><li> Einen 1% igen Lösung (Ox) in absolutem Ethanol und Inkubation bei 50 ° C für 15 min auf einer rotierenden Platte in einem Inkubator. </li><li> Sanft, aber bestimmt die Maus zu immobilisieren am Genick und Schwanzbasis mit Leib nach oben und Hals leicht nach unten geneigt ist (ähnlich wie bei einem Halt für eine intraperitoneale Injektion) und anwenden 100 ul 1% Ox auf die rasierte Flanke in mehreren Serienanwendungen und sich die Zeit nehmen, um die Haut danach trocknen, wie oben beschrieben. </li><li> Für Kontrollmäusen, gelten 100 ul absolutem Ethanol Fahrzeug auf die rasierte Flank. </li></ol></li></ol> 2. Flank Haut Ernte <ol><li> Euthanize Mäusen unter Verwendung von Kohlendioxid Einatmen, Verschlucken und vorsichtig herauszuschneiden den gewünschten Bereich der Flankenhaut (~ 25 mm x 25 mm der Haut) mit 10 cm chirurgische Scheren. </li><li> Mit einem sauberen, scharfen chirurgischen Klinge, kratzen Sie das überschüssige Fett und Bindegewebe von der Flanke Haut. </li><li> Platzieren 3 Stück Flanke Haut von 3 Mäusen in ein konisches 50 ml-Röhrchen mit 10 ml HBSS RT [mit Phenolrot, ohne Calcium oder Magnesium, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1- piperazinethansulfonsäure (HEPES) und 10% fötalem Rinderserum (FBS)]. </li></ol> 3. Pre-Verdauung Tissue Wasch <ol><li> Das Röhrchen enthaltenden Hautstücke auf einem Drehteller für 30 min in einem trockenen nicht-begasten Brutschrank bei 37 ° C gehalten. </li><li> Vortex kräftig für 10 Sekunden am Ende der Inkubationszeit. </li><li> Der Stamm der Inhalt des Röhrchens durch einen 70 &amp; mgr; mSchmutzfänger, um den Waschpuffer verwerfen und sammeln das Gewebe. Ein einzelnes Sieb kann während des gesamten Verfahrens in einer biologischen Behandlungsgruppe wiederverwendet werden. </li><li> Verwendung eines Paars von Zangen, übertragen die Flankenhaut von dem Sieb in ein neues 50 ml konischen Röhrchen, die 10 ml frisches, RT HBSS Medium (enthaltend EDTA, HEPES und FBS, wie oben beschrieben). </li><li> Mit einer 12,5 cm Paar chirurgische Dissektion in das Rohr eingetaucht ist, Hackfleisch jedes Stück Flanke Haut, so dass die mittlere Gewebestück ist etwa 2,2 mm x 2,2 mm in der Umgebung. </li><li> Das Röhrchen enthaltenden Hautstücke auf einem Drehteller für 30 min in einem trockenen nicht-begasten Brutschrank bei 37 ° C gehalten. </li><li> Vortex kräftig für 10 Sekunden am Ende der Inkubationszeit </li></ol> 4. Kollagenaseverdau der Haut <ol><li> Der Stamm der Inhalt des Röhrchens durch einen 70 &amp; mgr; m Sieb, sammeln und übertragen Sie die Flankenhautstücke in ein neues 50 ml konischen Röhrchen mit 10 ml fresh, RT HBSS Medium mit 0,7 mg ergänzt / ml D. Kollagenase </li><li> Das Röhrchen enthaltenden Digestionsmedium und Hautstücke auf einem Drehteller für 30 min in einem trockenen nicht-begasten Brutschrank bei 37 ° C gehalten. </li><li> Wirbel Inhalt Rohr kräftig für 10 Sekunden am Ende der Inkubationszeit. </li><li> Filterinhalt des Rohres durch ein 70 um Sieb in ein neues 50 ml konischen Röhrchen; halten den Durchfluss mit dem verdauten Gewebe und entsorgen Sie das Sieb und flankieren Haut Schutt. </li><li> Die Durchströmungswäsche in 50 ml HBSS Medium, Zentrifuge für 5 Minuten bei 350 g, und dekantiert den Überstand. </li></ol> 5. Dichte-Zentrifugation <ol><li> Verwendung einer serologischen Pipette 3 ml 67% RT Dichtegradientenzentrifugation Medien in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in ein neues 15 ml konischen Röhrchen für jede Probe. </li><li> Zellpellet in 5 ml 44% RT Dichtegradientenzentrifugation Medien in HBSS mit Phenolrot. </li><li> Gently Schicht 5 ml des 44% Dichtegradientenzentrifugation Medium, das die Zellen auf der Oberseite des 67% Dichtegradientenzentrifugation Medien Probe unter Verwendung einer serologischen Pipette. Achten Sie auf die Pipette auf die langsamste Geschwindigkeit eingestellt, und legen Sie die Pipette entlang der Wand des konischen Rohrs. Seien Sie vorsichtig, nicht zu zittern, zu stören oder zu invertieren die Steigung. </li><li> Beschleunigung auf die niedrigste Einstellung, löst die Bremse, und Zentrifuge die Gradienten bei 931 × g für 20 min bei RT, sicherzustellen, dass die Zentrifuge ausgeglichen ist. </li><li> Nach der Zentrifugation vorsichtig den Gradienten aus der Zentrifuge und schonend zu transportieren, um die Laborbank hält das Rohr aufrecht. Unter Verwendung einer 5 ml-Plastiktransferpipette Entfernen der Zellschicht an der Grenzfläche der 44% und 67% Dichtegradientenzentrifugation Medien und in ein neues 15 ml konischen Röhrchen. Wenn die Schnittstelle nicht angezeigt wird, entfernen Sie einfach etwa 2 ml Flüssigkeit an der 67% -44% Grenze. </li><li> Füllen Sie das konische Röhrchen mit Zellen aus der inten-Schnittstelle mit 2% FBS in 1X eiskaltem PBS, Zentrifuge Zellen für 5 Minuten bei 350 · g, und dekantieren Sie den Überstand. Anmerkung: Dies ist das erste Mal, dass die Zellen abgekühlt werden / kalt gehalten, da Aufschlussschritte werden bei 37 ° C und Dichtegradientenzentrifugation Medien Schritte sind bei RT. Die Zellen können in einem 1 resuspendiert werden: 1 Trypanblau Verdünnung und zählt und Lebensfähigkeit Information kann an dieser Stelle erreicht werden. </li></ol> 6. Sperren und Färbung für Analyse über Durchflusszytometrie <ol><li> Block FcyRII / III-Rezeptoren auf Zellen, die nicht-spezifische Antikörperfärbung zu verhindern. Für die hier beschriebenen Experimente machen Antikörper Mastermixe in PBS mit 2% FBS, das 1: 100-Verdünnung von unkonjugiertem Antikörper gegen CD16 / 32 (2.4G2) zu binden und zu blockieren FcyRII / III-Rezeptoren. </li><li> Blockiert Inkubieren Zellen mit entsprechenden Mastermixen von Antikörpern gegen CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8a (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14) und Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5) sowie Brilliant Violet 510 lebend / tot-Färbung, um tote Zellen zu identifizieren. Verwenden Sie alle Antikörper entweder an der Verdünnung durch Hersteller empfohlen oder zuvor von Forschern optimiert. Für die hier beschriebenen Experimente verwenden alle Antikörper bei 1: 100 Verdünnung. </li><li> Waschen und resuspendieren Zellen in 50 ul 1X PBS Färbepuffer mit 2% FBS. Halten auf Eis bis Fluoreszenzdaten auf einem Durchflusszytometer erfasst werden. Anmerkung: Es ist wichtig, dass Kompensationsparameter mit einer lymphatischen Gewebe und einen gemeinsamen Zelloberflächenantigen (wie CD4 oder CD8) vor dem Erwerb von Fluoreszenzdaten voroptimierte. </li><li> Um die Anzahl der Zellen, die für Downstream-Durchflusszytometrie zu erhöhen, Daten zu erfassen vom gesamten Proben von gefärbten Zellen. </li></ol> 7. Analysieren Sie Flow Cytometry Daten mit Standardmethoden, um die unten aufgeführten Schritten Accomplish <ol><li> Ersten Gate auf die Lymphozyten Bereich der Vorwärtsstreuung(Fläche), die durch Seitenstreuung (Bereich) Plot. </li><li> Wählen Sie dann einzelne Zellen mit Hilfe der Vorwärtsstreuung (Breite) durch Seitenstreuung (Breite), um zu vermeiden, die Analyse Dubletten. Dies kann auch mit einem Vorwärtsstreuhöhe von Seitenstreuhöhe Grundstück durchgeführt werden. </li><li> Dann Tor auf Linie (CD11b, CD11c und CD45R / B220) -negativen und CD3-positive Ereignisse, die auszuschließen sind Makrophagen, dendritische Zellen und B-Zellen sind und beschränken Analysen der T-Zelle Fach, wenn das Ziel ist, wie es hier ist, um zu beurteilen infiltrierenden T-Zellen. </li><li> Nächstes Tor auf lebende Zellen, die das Live / Dead-Färbung auszuschließen. </li><li> Schließlich Tor auf der Zellpopulation von Interesse (siehe repräsentative Ergebnisse Abschnitt). </li></ol>

<ol><li>Hay, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Global+Burden+of+Skin+Disease+in+2010%3A+An+Analysis+of+the+Prevalence+and+Impact+of+Skin+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).</li>
<li>Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+immune+events+in+the+murine+contact+hypersensitivity+model%3A+toward+the+understanding+of+allergic+contact+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis.</a> J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).</li>
<li>Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Mouse models of psoriasis.</a> J. Invest. Dermatol. 127 (6), 1292-1308 (2007).</li>
<li>Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Models+of+Innate+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Mouse+Models+of+Innate+Immunity%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mouse Models of Innate Immunity.</a> Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).</li>
<li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+Edge%3A+CD69+Interference+with+Sphingosine-1-Phosphate+Receptor+Function+Regulates+Peripheral+T+Cell+Retention%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immun%22%5BJournal%5D)">Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention.</a> J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).</li>
<li>Schaerli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+skin-selective+homing+mechanism+for+human+immune+surveillance+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells.</a> J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).</li>
<li>Zaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+skin-resident+memory+T+cells+within+an+epidermal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).</li>
<li>Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+vitiligo+with+focused+epidermal+depigmentation+requires+IFN-%CE%93+for+autoreactive+CD8%2B+T+cell+accumulation+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin.</a> J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Single-Cell+Suspensions+from+Mouse+Spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> J. Vis. Exp. (22), e1029(2008).</li>
<li>Nagao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+epidermal+Langerhans+cells+and+langerin-expressing+dermal+dendritic+cells+are+unrelated+and+exhibit+distinct+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).</li>
<li>Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue.</a> J. Vis. Exp. (29), e1267(2009).</li>
<li>Dudeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+are+key+promoters+of+contact+allergy+that+mediate+the+adjuvant+effects+of+haptens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens.</a> Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).</li>
<li>Hershko, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+Cell+Interleukin-2+Production+Contributes+to+Suppression+of+Chronic+Allergic+Dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis.</a> Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).</li>
<li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).</li>
<li>Tabatabaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+partial+characterization+of+human+amniotic+epithelial+cells%3A+The+effect+of+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Avicenna+J+Med.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin.</a> Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).</li>
<li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).</li>
<li>Gu, D., Fan, Q., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+population+analyses+during+skin+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell population analyses during skin carcinogenesis.</a> J. Vis. Exp. (78), e50311(2013).</li>
<li>Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Murine+Lymph+Node+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22+J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells.</a> J. Vis. Exp. (90), e51803(2014).</li>
<li>Martinov, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+hypersensitivity+to+oxazolone+provokes+vulvar+mechanical+hyperalgesia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice.</a> PloS one. 8 (10), e78673(2013).</li>
<li>Katsares, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Accurate+Method+for+the+Stem+Cell+Viability+Evaluation%3A+The+Case+of+the+Thawed+Umbilical+Cord+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Med%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood.</a> Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).</li>
<li>Thomas, M. L., Lefrançois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+the+leucocyte-common+antigen+family%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Today%22%5BJournal%5D)">Differential expression of the leucocyte-common antigen family.</a> Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).</li>
<li>Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Ly6G-specific+monoclonal+antibody+to+deplete+neutrophils+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice.</a> J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen oder sonstigen Interessen offen zu legen.

Charakterisierung von Veränderungen der Hautansässigen Leukozyten in Nagetiermodellen von Hauterkrankungen wie Neurodermitis oder Psoriasis ist wichtig für das Verständnis der mechanistischen Zusammenhänge zwischen entzündlichen Zell Zustrom und Krankheitspathologie. Hier beschreiben wir eine wirtschaftliche Technik, um Leukozyten aus Hautgewebe mit Grundausstattung in den meisten biomedizinischen Forschungslabors gefunden zu isolieren. Diese relativ schnelle Technik vermeidet die Verwendung von teuren Gewebedissoziatio...

Hauterkrankungen, die von Kontaktdermatitis, Ekzem, Schuppenflechte, Zellulitis, Pilzinfektionen und Abszesse, um Nicht-Melanom-Hautkrebs wurden gefunden, um unter den 50 häufigsten Krankheiten weltweit zu sein, und die vierte weltweit führende Ursache für nicht-tödlichen Krankheiten im Jahr 2010 1. Dementsprechend ist die Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen vielfältige Hautpathologien ist ein notwendiger und aktives Forschungsgebiet. Nagetiermodellen haben im Verständnis von entzündlichen Hautzuständen bemerkenswert nützlich gewesen wie atopische Dermatitis 2, Psoriasis 3 oder Staphylococcus aureus Infektion 4. Kostengünstige, effiziente und einfache Protokolle für die enzymatische Verdauung von Maushautgewebe kann Zubereitungen von Zellen, die für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen verwendet werden kann, um die Pathophysiologie von Haut Krankheiten besser zu verstehen. Hier ist ein einfaches und wirtschaftliches Verfahren zur enzymatischen Spaltung von Mäusehaut beschriebenGewebe und die Isolierung von Haut infiltrierenden Leukozyten, die für die Zellkultur, in vivo adoptiven Transfer genutzt werden können, durchflusszytometrische Analyse und Sortierung oder Genexpressionsstudien. Das übergeordnete Ziel dieser Vorgehensweise ist, um eine Einzelzellsuspension aus haut infiltrieren Leukozyten mit hoher Zelllebensfähigkeit vorzubereiten, während die Kosten in der Regel mit eigenen Reagenzien-Kits und mechanische dissociators assoziiert zu minimieren. Bestehende Hautgewebe Dissoziation Verfahren 5-7 können in geringen Zelllebensfähigkeit und Oberflächenmarker Integrität führen oder erfordern kundenspezifische Enzym-Kits und teuer Gewebedissoziation Maschinen 8-11. Während der Verdauung der Mausohr Hautgewebe ist recht verbreitet 12-13, Verdauen stark verhornte Hautgewebe (zB von der Flanke) in Zellpräparaten mit großen Mengen an nicht-Zelltrümmer kontaminiert führen. In einer aktuellen Studie, Zaid und Kollegen verdaut Maus Flankenhaut für 90 Minuten in 2,5 mg / ml Dispase, Follovon 45 min in 3 mg / ml Kollagenase 7 vermählen. In einer anderen Studie verwendet diese Forscher mehreren Inkubationen mit einem kombinierten Aufschluss von 2,5 Stunden, einschließlich der Verwendung von Trypsin / EDTA, Collagenase III und Dispase 5. Die Verwendung von Trypsin ist nicht für die enzymatische Verdauung Haut empfohlen, da die Behandlung mit Trypsin von verschiedenen Herstellern wurde gezeigt, meßbar beeinflussen die Integrität von Zelloberflächenproteinen auf Säugetierzellen 14-15. Zusätzlich kann Dispase signifikante Wirkungen auf proliferative Fähigkeit der CD4 T-Zellen und CD8a auswirken und Oberflächenfluss von wenigstens 20 Molekülen, einschließlich der gemeinsamen T-Zellaktivierung Marker wie CD62L 16. Andere Protokolle verwenden RPMI 1640 bei der Verdauung Medium 6. Jedoch kann die Anwesenheit von Mg 2+ und Ca 2+ in RPMI verursachen umfangreiche Zellaggregation 17. Ein ideales Protokoll für Gewebedissoziation sollte für Hochzelllebensfähigkeit, geringe zielenEbenen der Zellaggregation und minimale Beschädigung Oberflächenproteine ​​zu Zelle. Hochwertige Lymphknoten Stromazellen Vorbereitungen mit Protokollen, die kürzer Enzyminkubationen, Ca 2+ und Mg 2+ freien Medien zu verwenden erreicht worden, und Trypsin zu vermeiden und Dispase 18. Jedoch haben Protokolle dieser Art nicht für die Dissoziation von ganzen Mäusehaut nachgewiesen. Hier wird ein Protokoll beschrieben zu distanzieren, zu isolieren und zu bereichern haut infiltrieren Leukozyten aus allergenfochten Maus Flanke Haut. Kurz gesagt, herausgeschnitten Haut in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit 10% fötalem Rinderserum für 1 Stunde vorinkubiert, um das Gewebe für die Verdauung zu erweichen und zu entfernen überschüssiges tote Haut oder Fettgewebe. Dies wird durch eine 30 min enzymatischen Aufschlußschritt mit 0,7 mg gefolgt / ml Kollagenase D. Kollagenase D hat minimale Auswirkungen auf Dichte der Zelloberflächenmarker und keine Wirkung auf die T-Zellproliferation in vitro 16,18, so dass essehr gut geeignet für Anwendungen, die die Charakterisierung von Oberflächenproteinen. Folgende enzymatische Verdauung wurde diskontinuierlichen Dichtegradientenzentrifugation zum Epithelzellen und Schmutz von der Einzelzellsuspension zu entfernen und anzureichern hämatopoetischen Zellen. Wichtiger ist, vermeidet dieses Verfahren teuer spaltenbasierten Magnetzellseparation Reagenzien und Gewebedissoziation Maschinen 8-11 und können mit Geräten und Materialien in einem basischen biomedizinischen Forschungslabors gefunden geführt werden. Hier wurde dieses Protokoll verwendet, um Leukozyten aus Flankenhaut dreimal herausgefordert mit dem Hapten Oxazolon (Ox) bei bereits sensibilisierten ND4 Swiss Mäuse (ab 19 angepasst) zu isolieren. Zellen wurden unter Verwendung von Mehrparameter Durchflusszytometrie analysiert. Diese Technik ergab eine Zellsuspension mit minimalem Rückstand und&gt; 95% Lebensfähigkeit der isolierten Lymphozyten, die von Mehrparameter Flow-Zytometrie analysiert wurden, um die Infiltration von T-Lymphozyten und Neutrophilen in die betroffene sk messenim.

<table><tbody><tr><td>HBSS mit Phenolrot, ohne Calcium, ohne Magnesium, flüssig</td><td>Sigma Aldrich</td><td>55021C</td> Bis <td>zum Tag der Anwendung steril halten.</td></tr><tr><td>HEPES, &ge; 99,5 % (Titration)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Dinatriumsalzlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td> Bis <td>zum Tag der Anwendung steril halten.</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, USDA, hitzeinaktiviert, Premium Select</td><td>MidSci</td><td>S01520HI</td><td>Bis zum Tag der Anwendung steril halten.</td></tr><tr><td>Percoll, pH 8,5-9,5 (25°; C)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Steril halten. Percoll muss vor der Verwendung isotonisch mit sterilem 10X PBS gemacht werden.</td></tr><tr><td>Trimmer-Combo-Kit</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-1201&nbsp;</td><td>Verwenden Sie den größeren Trimmer, um die Flanke und den Rücken zu rasieren.</td></tr><tr><td>4-Ethoxymethylen-2-phenyl-2-oxazolin-5-on</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E0753-10G</td><td>Lösen Sie sich in 100% EtOH bei 50 ΰ auf; C 15 Minuten lang auf einer rotierenden Platte ziehen.</td></tr><tr><td>Gereinigter Anti-Maus-CD16/CD32 (2.4G2)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td>Antikörper zur Blockierung der unspezifischen Antikörperbindung während der Antikörperfärbung für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Anti-CD3&epsilon;-BV650 (145-2C11)</td><td>Becton Dickinson</td><td>564378</td> Antikörper <td>zur Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)</td><td>eBioscience</td><td>47-0042-80</td><td>Antikörper zur Färbung von Zellen für den Durchfluss </td></tr><tr><td>anti-CD8&alpha;-BV785 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100749</td><td>Antikörper zur Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>48-0112-80</td><td>Antikörper zur Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>anti-CD11c-eFluor450 (N418)</td><td>eBioscience</td><td>48-0114-80</td><td>Antikörper zur Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>anti-CD44-BV711 (IM7)</td><td>Becton Dickinson</td><td>563971</td><td>Antikörper zur Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC (30-F11)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0451-U025</td><td>Antikörper zur Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>48-0452-80</td><td>Antikörper zur Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)</td><td>BioLegend</td><td>104431</td><td>Antikörper zur Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108407</td><td>Antikörper zur Färbung von Zellen für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Ghost Dye-BV510</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>13-0870-T100</td><td>Viabilitätsfarbstoff für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>LSR Fortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td>N/A</td><td>Zellanalysator (18 Parameter)</td></tr><tr><td>Kollagenase D aus Clostridium histolyticum</td><td>Roche Applied Science</td><td>11088858001</td><td>Aliquot lyophilisiertes Enzym bei 5 mg/ml in HBSS mit Phenolrot, ohne Calcium und ohne Magnesium in 1 mL Aliquots. Sofort bei -20° lagern; C für bis zu sechs Monate.</td></tr><tr><td>ND4 Schweizer weibliche Mäuse</td><td>Harlan</td><td>0-32</td><td>8-12 Wochen alt; konventionell untergebracht mit freiem Zugang zu Futter und Wasser und gemäß den IACUC-Richtlinien des Macalester College verwendet.</td></tr></tbody></table>

isolation der infiltrierenden leukozyten aus mäusehaut unter verwendung enzymatischer digest und gradiententrennung

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Die Dissoziation der Maushaut in eine Einzelzellsuspension ist essentiell für nachgelagerte zelluläre Analysen, wie z.B. die Charakterisierung von infiltrierenden Immunzellen in Nagetiermodellen für Hautentzündungen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Verdauung von Maushaut in einer nährstoffreichen Lösung mit Kollagenase D, gefolgt von der Trennung hämatopoetischer Zellen unter Verwendung eines diskontinuierlichen Dichtegradienten. Die so gewonnenen Zellen können für In-vitro-Studien, In-vivo-Transfers und andere nachgelagerte zelluläre und molekulare Analysen einschließlich Durchflusszytometrie verwendet werden. Dieses Protokoll ist eine effektive und wirtschaftliche Alternative zu teuren mechanischen Dissoziatoren, spezialisierten Trennsäulen und härteren Trypsin- und Dispase-basierten Verdauungsmethoden, die die zelluläre Lebensfähigkeit oder Dichte von Oberflächenproteinen, die für die phänotypische Charakterisierung oder zelluläre Funktion relevant sind, beeinträchtigen können. Wie hier in unseren repräsentativen Daten gezeigt, produzierte dieses Protokoll hochlebensfähige Zellen, enthielt spezifische Immunzell-Untergruppen und hatte keinen Einfluss auf die Integrität gängiger Oberflächenmarkerproteine, die in der durchflusszytometrischen Analyse verwendet werden.

Kollagenase D behandelten Splenozyten zeigen ähnliche Niveaus von CD4- und CD8-α auf T-Zellen im Vergleich zu Medien behandelten Kontrollen Zunächst wurden die möglichen Auswirkungen Kollagenase D von der Frequenz und Oberflächen Fülle von Abstammung und Aktivierungsmarkern auf T-Zell-Untergruppen mit sekundären lymphatischen Gewebe als Kontrolle bewertet. Eine Suspension von Splenocyten aus Mäusen erhalten ND4 und für 1 Stunde mi...

Dieses Protokoll beschreibt die enzymatische Verdauung von Maushaut in nährstoffreichem Medium, gefolgt von einer Gradiententrennung, um Leukozyten zu isolieren. Die so abgeleiteten Zellen können für vielfältige nachgelagerte Anwendungen eingesetzt werden. Dies ist eine effektive, wirtschaftliche und verbesserte Alternative zu Gewebedissoziationsmaschinen und härteren Trypsin- und Dispase-basierten Gewebeverdauungsprotokollen.

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, hautinfiltrierende Leukozyten mittels enzymatischem Verdau und Dichtegradiententrennung zu isolieren. Diese Methode kann zur Untersuchung zellulärer und molekularer Mechanismen in vielen Mausmodellen von Hauterkrankungen, einschließlich atopischer Dermatitis, angewendet werden. Obwohl diese Methode Einblicke in die Biologie der hautinfiltrierenden Leukozyten geben kann, kann sie auch auf die Untersuchung anderer residenter Zellpopulationen angewendet werden.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten mit der Hautentnahme, die eine vollständige Entfernung des überschüssigen Fett- und Bindegewebes beinhaltet. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Hautentnahme und der Umgang mit dem Dichtegradienten schwer zu erlernen sind und Präzision und Übung erfordern. Verwenden Sie zum richtigen Zeitpunkt nach der Behandlung eine 10 Zentimeter große chirurgische Schere, um vorsichtig einen 25 x 25 Millimeter großen Bereich der rasierten Flankenhaut einer erwachsenen acht- bis zwölfwöchigen weiblichen ND4-Swiss-Webster-Maus herauszuschneiden.Verwenden Sie eine saubere, scharfe chirurgische Klinge, um das überschüssige Fett und Bindegewebe von der Haut abzukratzen, übertragen Sie dann die Haut in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern HBSS bei Raumtemperatur, das mit EDTA, HEPES und FBS ergänzt ist, und verdauen Sie das Gewebe auf einer rotierenden Platte 30 Minuten lang in einem trockenen, nicht gastierten, 37 Grad Celsius Inkubator. Am Ende der Inkubation das Röhrchen zehn Sekunden lang kräftig durchwirbeln und die Gewebeaufschlämmung durch ein 70-Mikron-Sieb filtrieren. Als nächstes übertragen Sie mit einer Pinzette die Flankenhautstücke aus dem Sieb in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen, das zehn Milliliter frisches HBSS-Medium bei Raumtemperatur enthält, ergänzt mit EDTA, HEPES und FBS, und verwenden Sie dann eine 12,5 Zentimeter große chirurgische Präparierschere, um jedes Stück Flankenhaut so zu zerkleinern, dass das durchschnittliche Gewebestück etwa 2,2 x 2,2 Millimeter groß ist.Wenn alle Stücke zerkleinert sind, stellen Sie das Röhrchen für eine weitere 30-minütige Inkubation wieder auf die rotierende Platte. Wirbeln Sie das Röhrchen am Ende der Inkubation 10 Sekunden lang kräftig vor und filtrieren Sie den Inhalt durch das 70-Mikron-Sieb. Sammeln Sie die verbleibenden Flankenhautstücke in einem neuen 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern HBSS, ergänzt mit 0,7 Milligramm pro Milliliter Kollagenase D, und stellen Sie das Röhrchen für eine weitere 30-minütige Inkubation wieder auf die rotierende Platte.Nach weiteren 10 Sekunden Vortexen filtern Sie den Inhalt des Röhrchens erneut, diesmal entsorgen Sie die Rückstände auf dem Sieb, füllen Sie dann das Röhrchen mit bis zu 50 Millilitern HBSS, EDTA, HEPES, FBS, schleudern Sie die Zellen herunter und dekantieren Sie den Überstand. Geben Sie drei Milliliter Zentrifugationsmedium mit Gradientenzentrifugation bei Raumtemperatur und 67 Prozent Dichte in PBS in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen und resuspendieren Sie das Zellpellet in fünf Millilitern Zentrifugationsmedium mit Gradientenzentrifugation bei Raumtemperatur und 44 Prozent Dichte in HBSS mit Phenolrot. Stellen Sie die Pipette auf die niedrigste Geschwindigkeit ein, platzieren Sie die Pipette an der Seite des Röhrchens und schichten Sie die Zellen vorsichtig auf das Gradientenzentrifugationsmedium mit 67 Prozent.Achten Sie bei der Arbeit mit Dichtegradienten darauf, dass keine Blasen entstehen und Unterbrechungen der Gradientenschnittstelle minimiert werden. Trennen Sie dann die Zellen mit einer Fünf-Milliliter-Transferpipette, um die Zellen am Ende der Zentrifugation an der Grenzfläche zu sammeln. Da das sanfte Schichten des Gradienten und das sorgfältige Extrahieren der Grenzfläche der Gradienten kritische Schritte sind, ist es ratsam, die Schichtung des Dichtegradientenzentrifugationsmediums und die Grenzflächenentfernung mit der Suspension von murinen Splenozyten zu üben, bevor das Verfahren mit den interessierenden experimentellen Zellen versucht wird.Zum Schluss waschen Sie die gesammelten Zellen in eiskaltem PBS, das mit FBS ergänzt ist, in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch Trypanblau-Ausschluss. Die CD4- und CD8-alpha-Oberflächenexpression wird durch den Kollagenase-D-Verdau nicht beeinflusst, da die gleiche Anzahl von CD4-positiven und CD8-alpha-positiven Zellen mit oder ohne enzymatischen Verdau nachgewiesen wird. Darüber hinaus zeigt der Kollagenase-D-Verdau keinen Einfluss auf die Oberflächendichte der T-Zell-Aktivierungsmarker CD44 und CD62L auf CD4-positiven T-Zellen.Nach der Gradiententrennung werden etwa 250 lebensfähige Immunzellen pro Quadratmillimeter Flankengewebe aus Oxazolon oder Ochsen-herausgeforderten Mäusen isoliert, verglichen mit nur vier lebensfähigen Immunzellen pro Quadratmillimeter Gewebe bei Vehikel-herausgeforderten Mäusen, die zuvor mit Ochse sensibilisiert waren.95 Prozent der Einzelzellen mit geringer Vorwärts- und Seitenstreuung bei Ochsen-herausgeforderten Mäusen, und 71 Prozent dieser Zellen bei Vehikel-herausgeforderten Kontrollen sind lebende CD45-positive Zellen. Dies entspricht einem etwa 67-fachen Anstieg der infiltrierenden CD45-positiven Immunzellpopulation in der Flankenhaut nach drei täglichen Ochsen-Provokationen. Tatsächlich führt die Ochsen-Provokation zu einer ausgeprägten Infiltration von T-Zellen und Neutrophilen in die Flankenhaut, wobei 42 Prozent der einzelnen, lebenden CD45-positiven Zellen bei Ochsen-behandelten Tieren, offensichtliche Gr-1-positive Neutrophile und etwa 84 Prozent CD3-positive T-Zellen, die CD8-alpha oder CD4 exprimieren, im Vergleich zu mit Ethanol behandelten Kontrolltieren bestehen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa drei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, den Dichtegradienten vorsichtig zu handhaben. Vergessen Sie nicht, bei diesem Verfahren immer ein Zentrifugationsmedium mit Dichtegradienten bei Raumtemperatur zu verwenden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie durchflusszytometrische Analysen, Zellsortierung, Zelltransfer oder in vitro-Zellkulturen durchgeführt werden, um den Phänotyp und die Funktion der hautinfiltrierenden Leukozyten zu bewerten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hautinfiltrierende Leukozyten mithilfe von enzymatischem Verdau und Dichtegradientenzentrifugation isoliert.

isolation-infiltrating-leukocytes-from-mouse-skin-using-enzymatic

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ein schnelles Verfahren zur Infiltration von Leukozyten aus dem murinen Gehirns zu erhalten, ist beschrieben. Diese Methode verwendet einen kontinuierlichen und diskontinuierlichen Percoll-Gradienten Ficollgradienten auszuwählen und zu reinigen, die Leukocyten-angereicherte Schicht. Isolierte Leukozyten kann dann durch durchflusszytometrische Messungen charakterisiert werden.

Isolierung von Brain-infiltrierenden Leukozyten

Ein effizienter Weg, um Lymphozyten, die aus Maus Genitaltrakt isolieren beschrieben. Diese Methode nutzt Enzym Verdauung und Percoll Gradienten Trennung effiziente Isolierung ermöglichen. Diese Technik ist auch anpassbar für die Verwendung in anderen...

Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genital Tract Mucosa

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von mononukleären Zellen der Lamina propria aus murinem Dickdarmgewebe durch enzymatischen Verdau unter Verwendung von Kollagenase E und Siliziumdioxid-basierter Dichtetrennmedien-Gradiententrennung. Die isolierten mononukleären Zellen können für die anschließende Downstream-Analyse verwendet werden.

Isolierung mononukleärer Zellen von Lamina Propria: Eine Dichtegradientenzentrifugationstechnik auf Siliziumdioxidbasis zur Gewinnung mononukleärer Zellen aus dem Dickdarm der Maus

Wir beschreiben ein Protokoll zur effizienten Isolierung von hautresidenten T-Zellen aus menschlichen Hautbiopsien. Dieses Protokoll liefert eine ausreichende Anzahl lebensfähiger Lymphozyten in der menschlichen Haut für die durchflusszytometrische Analyse und die Ex-vivo-Kultur.

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Zellkultur

Die Haut beherbergt ein komplexes Immunzellnetzwerk. Wir beschreiben eine effiziente Methodik für die Verdauung von Maushaut aus verschiedenen Körperteilen des Tieres, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten und die verschiedenen Leukozytenpopulationen, die in der Haut leben, mittels Durchflusszytometrie zu analysieren.

Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Cytofluorimetric Analyse von verschiedenen Mäusehaut Regionen

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Isolierung myeloischer Zellen aus der Maushaut und der Drainage von Lymphknoten nach intradermaler  Injektion von Plasmodium-Sporozoiten. Die Durchflusszytometrie der gesammelten Zellen bietet einen zuverlässigen Assay zur Charakterisierung der Entzündungsreaktion der Haut und der Drainage von Lymphknoten auf den Parasiten.

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoiten

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus die induktive Stätten wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe Peyer Patches und mesenterialen Lymphknoten und der Effektor-Websites einschließlich der Lamina Propria und der Darmepithel des kleinen intestinalen Immunsystems.

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

Dieses Protokoll beschreibt, wie Hautkeratinozyten von Mausmodellen isoliert werden, mit metallmarkierten Antikörpern gefärbt werden und wie man gefärbte Zellen durch Massenzytometrie analysiert, um das Expressionsmuster von Proteinen zu profilieren, die in den verschiedenen Zellzyklusphasen von Interesse sind.

Isolierung und Färbung der Maushaut Keratinozyten für Zellzyklus spezifische Analyse der zellulären Proteinexpression durch Massenzytometrie

Das Ziel dieses Protokolls ist es, mononukleäre Zellen, die in der Lamina-Propria des Dickdarms durch enzymatische Verdauung des Gewebes mit Kollagennase leben zu isolieren. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Isolierung mononukleativer Zellen, was zu einer Einzelzellsuspension führt, die wiederum für eine robuste Immunphenotypisierung verwendet werden kann.

Isolierung von Lamina Propria Mononukleären Zellen aus murine Colon mit Kollagenase E

In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur magnetischen Bead-basierten Isolierung von murinen Endothelzellen aus dermalen lymphatischen Kapillaren beschrieben. Die isolierten lymphatischen Endothelzellen können für nachgelagerte In-vitro-Experimente und Proteinexpressionsanalysen verwendet werden.

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung lebender immuner und nicht-immuner Populationen aus der Lunge von Mäusen in einem stabilen Zustand und nach einer Influenzainfektion. Es bietet auch Gating-Strategien zur Identifizierung von epithelialen und myeloischen Zelluntergruppen.

Isolierung von lebenden myeloischen und epithelialen Zellpopulationen aus der Lunge der Maus

Erfahren Sie die Isolierung infiltrierender Leukozyten aus Mäusehaut mittels enzymatischer Digestion und Gradiententrennung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Mechanismen bei Hauterkrankungen wie atopischer Dermatitis.

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

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