Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung
25. Januar 2016
Dieses Protokoll beschreibt die enzymatische Verdauung von Maushaut in nährstoffreichem Medium, gefolgt von einer Gradiententrennung, um Leukozyten zu isolieren. Die so abgeleiteten Zellen können für vielfältige nachgelagerte Anwendungen eingesetzt werden. Dies ist eine effektive, wirtschaftliche und verbesserte Alternative zu Gewebedissoziationsmaschinen und härteren Trypsin- und Dispase-basierten Gewebeverdauungsprotokollen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, hautinfiltrierende Leukozyten mittels enzymatischem Verdau und Dichtegradiententrennung zu isolieren. Diese Methode kann zur Untersuchung zellulärer und molekularer Mechanismen in vielen Mausmodellen von Hauterkrankungen, einschließlich atopischer Dermatitis, angewendet werden. Obwohl diese Methode Einblicke in die Biologie der hautinfiltrierenden Leukozyten geben kann, kann sie auch auf die Untersuchung anderer residenter Zellpopulationen angewendet werden.
Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten mit der Hautentnahme, die eine vollständige Entfernung des überschüssigen Fett- und Bindegewebes beinhaltet. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Hautentnahme und der Umgang mit dem Dichtegradienten schwer zu erlernen sind und Präzision und Übung erfordern. Verwenden Sie zum richtigen Zeitpunkt nach der Behandlung eine 10 Zentimeter große chirurgische Schere, um vorsichtig einen 25 x 25 Millimeter großen Bereich der rasierten Flankenhaut einer erwachsenen acht- bis zwölfwöchigen weiblichen ND4-Swiss-Webster-Maus herauszuschneiden.
Verwenden Sie eine saubere, scharfe chirurgische Klinge, um das überschüssige Fett und Bindegewebe von der Haut abzukratzen, übertragen Sie dann die Haut in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern HBSS bei Raumtemperatur, das mit EDTA, HEPES und FBS ergänzt ist, und verdauen Sie das Gewebe auf einer rotierenden Platte 30 Minuten lang in einem trockenen, nicht gastierten, 37 Grad Celsius Inkubator. Am Ende der Inkubation das Röhrchen zehn Sekunden lang kräftig durchwirbeln und die Gewebeaufschlämmung durch ein 70-Mikron-Sieb filtrieren. Als nächstes übertragen Sie mit einer Pinzette die Flankenhautstücke aus dem Sieb in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen, das zehn Milliliter frisches HBSS-Medium bei Raumtemperatur enthält, ergänzt mit EDTA, HEPES und FBS, und verwenden Sie dann eine 12,5 Zentimeter große chirurgische Präparierschere, um jedes Stück Flankenhaut so zu zerkleinern, dass das durchschnittliche Gewebestück etwa 2,2 x 2,2 Millimeter groß ist.
Wenn alle Stücke zerkleinert sind, stellen Sie das Röhrchen für eine weitere 30-minütige Inkubation wieder auf die rotierende Platte. Wirbeln Sie das Röhrchen am Ende der Inkubation 10 Sekunden lang kräftig vor und filtrieren Sie den Inhalt durch das 70-Mikron-Sieb. Sammeln Sie die verbleibenden Flankenhautstücke in einem neuen 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern HBSS, ergänzt mit 0,7 Milligramm pro Milliliter Kollagenase D, und stellen Sie das Röhrchen für eine weitere 30-minütige Inkubation wieder auf die rotierende Platte.
Nach weiteren 10 Sekunden Vortexen filtern Sie den Inhalt des Röhrchens erneut, diesmal entsorgen Sie die Rückstände auf dem Sieb, füllen Sie dann das Röhrchen mit bis zu 50 Millilitern HBSS, EDTA, HEPES, FBS, schleudern Sie die Zellen herunter und dekantieren Sie den Überstand. Geben Sie drei Milliliter Zentrifugationsmedium mit Gradientenzentrifugation bei Raumtemperatur und 67 Prozent Dichte in PBS in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen und resuspendieren Sie das Zellpellet in fünf Millilitern Zentrifugationsmedium mit Gradientenzentrifugation bei Raumtemperatur und 44 Prozent Dichte in HBSS mit Phenolrot. Stellen Sie die Pipette auf die niedrigste Geschwindigkeit ein, platzieren Sie die Pipette an der Seite des Röhrchens und schichten Sie die Zellen vorsichtig auf das Gradientenzentrifugationsmedium mit 67 Prozent.
Achten Sie bei der Arbeit mit Dichtegradienten darauf, dass keine Blasen entstehen und Unterbrechungen der Gradientenschnittstelle minimiert werden. Trennen Sie dann die Zellen mit einer Fünf-Milliliter-Transferpipette, um die Zellen am Ende der Zentrifugation an der Grenzfläche zu sammeln. Da das sanfte Schichten des Gradienten und das sorgfältige Extrahieren der Grenzfläche der Gradienten kritische Schritte sind, ist es ratsam, die Schichtung des Dichtegradientenzentrifugationsmediums und die Grenzflächenentfernung mit der Suspension von murinen Splenozyten zu üben, bevor das Verfahren mit den interessierenden experimentellen Zellen versucht wird.
Zum Schluss waschen Sie die gesammelten Zellen in eiskaltem PBS, das mit FBS ergänzt ist, in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch Trypanblau-Ausschluss. Die CD4- und CD8-alpha-Oberflächenexpression wird durch den Kollagenase-D-Verdau nicht beeinflusst, da die gleiche Anzahl von CD4-positiven und CD8-alpha-positiven Zellen mit oder ohne enzymatischen Verdau nachgewiesen wird. Darüber hinaus zeigt der Kollagenase-D-Verdau keinen Einfluss auf die Oberflächendichte der T-Zell-Aktivierungsmarker CD44 und CD62L auf CD4-positiven T-Zellen.
Nach der Gradiententrennung werden etwa 250 lebensfähige Immunzellen pro Quadratmillimeter Flankengewebe aus Oxazolon oder Ochsen-herausgeforderten Mäusen isoliert, verglichen mit nur vier lebensfähigen Immunzellen pro Quadratmillimeter Gewebe bei Vehikel-herausgeforderten Mäusen, die zuvor mit Ochse sensibilisiert waren.95 Prozent der Einzelzellen mit geringer Vorwärts- und Seitenstreuung bei Ochsen-herausgeforderten Mäusen, und 71 Prozent dieser Zellen bei Vehikel-herausgeforderten Kontrollen sind lebende CD45-positive Zellen. Dies entspricht einem etwa 67-fachen Anstieg der infiltrierenden CD45-positiven Immunzellpopulation in der Flankenhaut nach drei täglichen Ochsen-Provokationen. Tatsächlich führt die Ochsen-Provokation zu einer ausgeprägten Infiltration von T-Zellen und Neutrophilen in die Flankenhaut, wobei 42 Prozent der einzelnen, lebenden CD45-positiven Zellen bei Ochsen-behandelten Tieren, offensichtliche Gr-1-positive Neutrophile und etwa 84 Prozent CD3-positive T-Zellen, die CD8-alpha oder CD4 exprimieren, im Vergleich zu mit Ethanol behandelten Kontrolltieren bestehen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa drei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, den Dichtegradienten vorsichtig zu handhaben. Vergessen Sie nicht, bei diesem Verfahren immer ein Zentrifugationsmedium mit Dichtegradienten bei Raumtemperatur zu verwenden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie durchflusszytometrische Analysen, Zellsortierung, Zelltransfer oder in vitro-Zellkulturen durchgeführt werden, um den Phänotyp und die Funktion der hautinfiltrierenden Leukozyten zu bewerten.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hautinfiltrierende Leukozyten mithilfe von enzymatischem Verdau und Dichtegradientenzentrifugation isoliert
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von in die Haut eindringenden Leukozyten mittels enzymatischer Verdauung und Dichtegradiententrennung. Diese Methode eignet sich zur Untersuchung zellulärer und molekularer Mechanismen in Mausmodellen von Hauterkrankungen wie der atopischen Dermatitis.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Immunologie
Hintergrund
- In die Haut eindringende Leukozyten spielen eine entscheidende Rolle bei Hauterkrankungen.
- Herkömmliche Methoden zur Gewebe-Dissociation können aggressiv und weniger wirksam sein.
- Der enzymatische Verdau bietet eine kostengünstigere Alternative.
- Bei der Gewinnung von Hautproben und der Handhabung von Dichtegradienten ist Genauigkeit erforderlich.
Zweck der Studie
- Isolierung von Leukozyten aus der Maushaut für weitere Analysen.
- Gewinnung von Erkenntnissen zur Biologie der in die Haut eindringenden Leukozyten.
- Erleichterung der Untersuchung anderer residenter Zellpopulationen.
Verwendete Methoden
- Enzymatische Verdauung von Maushaut in nährstoffreichem Medium.
- Gradientenseparation zur Isolierung von Leukozyten.
- Sorgfältige Entfernung der Haut mit einer chirurgischen Schere.
- Visuelle Demonstration zur Unterstützung beim Erlernen der Technik.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von Leukozyten aus der Maushaut.
- Verbessertes Verständnis der Biologie hautinfiltrierender Leukozyten.
- Mögliche Anwendungen bei der Untersuchung verschiedener Hautpathologien.
- Nachgewiesene Wirksamkeit der Methode im Vergleich zu herkömmlichen Techniken.
Schlussfolgerungen
- Die enzymatische Verdauung und die Dichtegradiententrennung sind wirksam und kostengünstig.
- Dieses Protokoll kann die Forschung zu hautbezogenen Erkrankungen verbessern.
- Visuelle Hilfsmittel sind entscheidend, um die Technik zu beherrschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung lebensfähiger, in die Haut eindringender Leukozyten ermöglicht die mechanistische Absicherung therapeutischer Zielstrukturen in Modellen entzündlicher Hauterkrankungen. Dieses Protokoll unterstützt die Zielstrukturvalidierung, indem es reproduzierbaren Zugang zu Immunzellpopulationen für die phänotypische und funktionelle Analyse bereitstellt. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit in präklinischen Studien, da die Integrität der Oberflächenmarker, die für die entscheidungsrelevante Durchflusszytometrie entscheidend sind, erhalten bleibt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Isolierung infiltrierender Immunzellen aus erkrankter Haut.
- Operativer Wert: Bietet eine kostengünstige Alternative zu mechanischen Dissoziiergeräten und aggressiven enzymatischen Methoden, die die Zellviabilität beeinträchtigen.
- Prädiktiver Wert: Erhält die Integrität von Oberflächenmarkern wie CD4, CD8-alpha, CD44 und CD62L und ermöglicht dadurch eine zuverlässige phänotypische Charakterisierung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt hochviable Einzelzell-Suspensionen, die für nachgeschaltete Durchflusszytometrie- und Funktionsanalysen geeignet sind.
- Operativer Wert: Verwendet leicht verfügbare Reagenzien (Kollagenase D, Dichtegradientenmedien) und Standard-Laborgeräte, wodurch die Standardisierung von Analysen verbessert wird.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht eine konsistente Ausbeute an Immunzellen (~250 vitale Zellen/mm² in entzündeter Haut) für reproduzierbare Screening-Workflows.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht die Analyse von Immuninfiltraten in Modellen der Hautentzündung wie der Oxazolon-induzierten Dermatitis.
- Mechanistische Entwicklungsrisikominimierung: Ermöglicht die Quantifizierung des CD45+ Immunzellinfiltrats (67-facher Anstieg nach der Provokation) zur Beurteilung der Targetbindung.
- Relevanz des präklinischen Modells: Isoliert T-Zellen und Neutrophile, deren Infiltrationsmuster der menschlichen Hautpathologie entsprechen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Hypothesenprüfung in der frühen Immunologie bis hin zur Optimierung von Wirkstoffkandidaten mittels Immunzellprofiling in Modellen entzündlicher Erkrankungen ein.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch die Isolierung von in die Haut eindringenden Leukozyten, um immunologische Mechanismen bei Hauterkrankungen aufzuklären.
- Screening: Ermöglicht zellbasierte Assays in Form von gebrauchsfertigen Zellsuspensionen zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die Rekrutierung oder Aktivierung von Immunzellen.
- Analytik: Liefert quantitative Ergebnisse wie Anzahlen lebensfähiger Zellen und für die Durchflusszytometrie geeignete Zellsubpopulationen zur vergleichenden Analyse unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Validierung, indem Marker erhalten bleiben, die zur Verfolgung von Immunzellphänotypen über verschiedene Modelle hinweg erforderlich sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft ein wiederverwendbares Isolationsprotokoll, das auf verschiedene Modelle von Hauterkrankungen und auf unterschiedliche residente Zelltypen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem präzise Charakterisierung infiltrierender Leukozyten-Subpopulationen ermöglicht wird.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte enzymatische Verdauung und Gradiententrennungsschritte.
- Strategischer Wert: Verringert biologische Risiken bei der Leitverbindungsauswahl, indem zuverlässige Daten zu Immunzellen für Go/No-Go-Entscheidungen bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen basierend auf der Wirksamkeit der Immunmodulation in relevanten präklinischen Modellen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Gewebeentnahme, insbesondere beim Entfernen von Fett- und Bindegewebe aus der Maushaut.
- Setzt Zugang zu einer Zentrifuge, einer rotierenden Platte, 70-Mikron-Sieben und chirurgischen Instrumenten zum Zerkleinern des Gewebes voraus.
- Erfordert Schulung in der Schichtung von Dichtegradienten und der Extraktion von Grenzflächen, um Blasenbildung zu vermeiden und eine zuverlässige Gewinnung sicherzustellen.
- Möglicherweise sind Anpassungen erforderlich, wenn die Methode auf verschiedene Mausstämme, Altersgruppen oder Modelle der Hautverletzung über die Oxazolon-Herausforderung hinaus angewendet wird.
- Praktische Einschränkung: Die Beherrschung erfordert Übung, insbesondere im Umgang mit Gradienten, um konsistente Leukozytengewinne zu erzielen.
