Strömungsmuster Guided Herstellung von High-Density-Barcode Antikörper Microarray

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, ein Antikörper-Array herzustellen, das in der Einzelzellanalyse Anwendung findet. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Einzelzellanalyse zu beantworten, z. B. wie wir geheime Proteine und intrazelluläre Proteine gleichzeitig aus derselben einzelnen Zelle nachweisen können. Und wie können wir eine Micro-Array-Plattform herstellen, um dieses Ziel zu erreichen?

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie anpassbar ist. Durch Variieren der Strategien zur Erstellung von Strömungsmustern können Arrays mit verschiedenen Dimensionen erstellt werden. Generieren Sie im Voraus den SU-8-Master für die Barcode-Flussmuster.

Anweisungen finden Sie im Textprotokoll. Dazu gehört das Entwerfen und Erstellen einer Chrom-Fotomaske. Das Auftragen der Maske auf eine Fotolackschicht und das Auftragen von UV sorgt für das Muster.

Um mit der Vorbereitung der PDMS-Barcode-Form zu beginnen, kombinieren Sie 40 Gramm Silikonelastomerbasis mit vier Gramm Härter und rühren Sie dann 10 Minuten lang kräftig um. Entgasen Sie dann die Prepolymerlösung 20 Minuten lang unter Vakuum. Laden Sie als Nächstes die Lösung in eine Petrischale, die einen Siliziumwafer mit dem SU-8-Master des Barcode-Musters enthält.

Gießen Sie die Lösung bis zu einer Tiefe von 7,45 Millimetern. Entgasen Sie dann die Mischung in der Schüssel, um alle verbleibenden Blasen zu entfernen. Nach der Entgasung die Mischung eine Stunde lang bei 75 Grad Celsius backen, um das PDMS auszuhärten.

Schneiden Sie anschließend mit einem Skalpell und entfernen Sie vorsichtig die Barcode-Form. Dann schälen Sie die Platte vorsichtig von der Waffel. Schneiden Sie als Nächstes die Kanten der Platte ab, um die gewünschte Form für die Form zu erhalten.

Stellen Sie die Form fertig, indem Sie einen Biopsiestempel mit Kolben verwenden, um halbe Millimeter Löcher an den kreisförmigen Merkmalen auf dem Muster auszustanzen, die Ein- und Auslässe darstellen. Nachdem Sie den Staub von einem mit Poly-L-Lysin beschichteten Glasobjektträger mit einer Stickstoff-Blaspistole abgeblasen haben, befestigen Sie die PDMS-Form an der Schiene. Richte die Ränder der Form vorsichtig an der Rutsche aus.

Backen Sie nun die Baugruppe 90 Minuten lang bei 75 Grad Celsius, um die Verbindung zwischen dem PDMS und der Folie zu stärken. In der Zwischenzeit 20 Stück flexible Polyethylenschläuche für die Ein- und Auslässe vorbereiten. Befestigen Sie an jedem Schlauchstück einen Hohlstift aus Edelstahl mit einem Durchmesser von einem Millimeter.

Füllen Sie dann über die Stifte die Längen mit einem Zentimeter oder mehr Poly-L-Lysin. Sobald sie mit dem Glas verbunden sind, befestige die Stifte vorsichtig an den Einlässen der Form. Dies ist der schwierigste Schritt der Vorbereitung.

Überstürzen Sie den Prozess nicht. Befestigen Sie das andere Ende der Rohre an einem druckgeregelten Stickstofftank, der aus einem Netzwerk von 20 Dreiwegeventilen besteht und zwei Formen gleichzeitig verarbeiten kann. Blasen Sie die Lösung mit dem Setup mindestens sechs Stunden lang bei 0,5 bis 1 PSI durch die Form.

Beginnen Sie mit dem Aspirieren frisch zubereiteter einzelsträngiger DNA-Lösungen in BS-3 durch die Edelstahlstifte und in den Polyethylenschlauch. Koppeln Sie dann die PDMS-Form an die Stickstoffquelle und lassen Sie die Lösung etwa 40 Minuten lang durch die Barcode-Form fließen oder bis alle Kanäle gefüllt sind. Stoppen Sie dann den Fluss und lassen Sie die Form zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Nach ein paar Stunden die Barcode-Form bei 75 Grad Celsius eine Stunde lang backen. Nach dem Backen die Form von der Folie lösen und die Folie vorsichtig mit 01 % SDS waschen. Waschen Sie die Rutsche dann dreimal mit Reinstwasser.

Trocknen Sie den Barcode-Objektträger nach dem Waschen mit einem Dia-Spinner. Bewahren Sie den Barcode-Objektträger nach dem Trocknen in einer sauberen 50-Milliliter-Tube auf. Um fortzufahren, befolgen Sie das Textprotokoll, um das eindimensionale Muster zu validieren.

Um das Validierungsverfahren durchzuführen, blockieren Sie den Objektträger, hybridisieren Sie drei komplementäre Cyanin-DNA damit und messen Sie die Ergebnisse. Der SU-8-Master für ein drei mal drei Array hat ein Strömungsmuster, das senkrecht zu dem des ersten Designs verläuft. Verwenden Sie die zuvor beschriebene Methode, um eine neue PDMS-Form dieses Musters zu erstellen.

Stellen Sie zunächst neue Arbeitskonzentrationen der neun Oligonukleotide her. Fließen Sie nun eine dreiprozentige BSA-Blockierungslösung eine Stunde lang mit 0,5 bis einem PSI in alle 20 Kanäle des Array-Objektträgers. Laden Sie als Nächstes die DNA-Lösungen in ihre jeweiligen Kanäle.

Nachdem Sie sie etwa 40 Minuten lang fließen ließen, inkubieren Sie den Objektträger zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, damit die DNA hybridisieren kann. Lassen Sie als nächstes eine Stunde lang drei Prozent BSA-Blockierungslösung in alle 20 Kanäle fließen. Dadurch wird die nicht-hybridisierte DNA entfernt.

Ziehen Sie nun die Array-Folie aus dem PDMS ab, und tauchen Sie die Folie einmal in drei Prozent BSA. Tauchen Sie dann die Folie zweimal in PBS ein, gefolgt von einem Rückgang in zwei Prozent PBS. Trocknen Sie den Objektträger dann wie bisher mit einem Objektträger-Spinner.

Um fortzufahren, führen Sie einen Validierungsschritt aus, der dem Validieren eindimensionaler Folien ähnelt. Verwenden Sie Oligonukleotide mit einer Primzahl bis neun Primzahlen, die alle mit Cyanin drei konjugiert sind. Bewahren Sie den drei mal drei Array-Objektträger in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen für die spätere Verwendung auf.

Das Textprotokoll erklärt weiter, wie das DNA-Array in ein Antikörper-Array umgewandelt wird. Nach der Vorbereitung und Reinigung der Antikörper-Oligo-Konjugate wird eine weitere PDMS-Form mit Mikrokammern vorbereitet. Weitere Informationen finden Sie im Text.

Verbinden Sie diese Form mit der Array-Folie. Blockieren Sie nun den Objektträger mit einem Prozent BSA und inkubieren Sie ihn eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Bereiten Sie während der Inkubation 200 Mikroliter Antikörper-Oligonukleotid-Konjugate vor.

Fügen Sie nach dem Block den Antikörper-Oligo-Cocktail zum Setup hinzu. Lassen Sie die Antikörper eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius auf dem Array inkubieren, reinigen und trocknen Sie dann den Objektträger, bevor Sie mit den im Textprotokoll beschriebenen Objektträger-Dips fortfahren. Nach Befolgung des beschriebenen Protokolls unter Verwendung eines drei mal drei Arrays wurde das resultierende Antikörperpanel für die Multiplex-Detektion verwendet, hauptsächlich über eine Sandwich-ELISA-Plattform.

Die Proteine zeigten eine Variation von weniger als 10 % von einem Ende zum anderen Ende des Objektträgers. Auf dem drei mal drei Array können bis zu sieben Proteine nachgewiesen werden, zusammen mit einer Referenz, die mit Cyanin drei markiert ist, und einer Negativkontrolle. In einem Einzelzellexperiment, das für eine Tumorstudie durchgeführt wurde, wurden die sechs Proteine alle gleichzeitig nachgewiesen.

Zur Kalibrierung wurden rekombinante Proteine in verschiedenen Konzentrationen auf ein Array aufgebracht. Die Empfindlichkeit der Detektion war ziemlich ähnlich wie bei einem herkömmlichen Sandwich-ELISA. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die PDMS-Formen frei von Partikeln zu halten.

Staub in den Kanälen kann zu Arrays mit schlechter Gleichmäßigkeit und geringer Empfindlichkeit führen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Krebsforschung, die Zell-Zell-Signalübertragung anhand von Modellen von Tumormikroumgebungen zu erforschen.