Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Proteinspiegel in situ in Präimplantationsembryonen von Mäusen zu quantifizieren. Diese Methode ermöglicht es uns also, halbautomatisiert eine Hochdurchsatzanalyse von konfokalen Mikroskopiebildern mit Einzelzellauflösung durchzuführen. Diese Methode kann verwendet werden, um Proteinkonzentrationen auf konfokalen Bildern zu quantifizieren, wenn eine hohe Kerndichte vorhanden ist und wenn man Heterogenitäten innerhalb von Zellpopulationen untersuchen möchte.

Ziehen Sie zunächst mit einer offenen Flamme auf einer Glaspasteurpipette ein Kapillarende an der Spitze. Reiben Sie das hintere Ende der Pipette vorsichtig gegen die Kapillare, um sie zu brechen und ein stumpfes Ende zu erzeugen. Nachdem Sie eine trächtige weibliche Maus am gewünschten embryonalen Entwicklungstag geopfert haben, legen Sie die Baucheingeweide gemäß dem Textprotokoll frei und lokalisieren Sie die Gebärmutter.

Halten Sie das zervikale Ende fest, schneiden Sie durch den Gebärmutterhals und ziehen Sie es vorsichtig nach oben, um beide Gebärmutterhörner zu dehnen. Schneiden Sie das Fett ab und achten Sie darauf, die Gebärmutterwand nicht zu durchstechen. Schneiden Sie oberhalb der Eileiter, unterhalb der Eierstöcke, um die gesamte Gebärmutter freizugeben, und legen Sie sie auf eine Petrischale.

Bedecken Sie als Nächstes die Gebärmutter mit PBS und trennen Sie beide Gebärmutterhörner, indem Sie das proximale Ende auf beiden Seiten des Gebärmutterhalses durchschneiden. Trennen Sie dann jeden Eileiter von der Gebärmutter, indem Sie unter dem Isthmus schneiden, der sie verbindet. Verwenden Sie unter einem Dissektionsmikroskop eine Ein-ml-Spritze mit einer Injektionsnadel, um die Blastozysten aus der Gebärmutter in das Manipulationsmedium zu spülen, indem Sie 0,5-1 ml Medium durch jedes Horn aus der Gebärmutterhalsöffnung drücken.

Warten Sie bis zu ein bis zwei Minuten, bis die Blastozysten nach dem Spülen auf den Boden der Schale sinken. Lokalisieren Sie dann die Blastozysten und sammeln Sie mit der mundgesteuerten Glaspasteurpipette mit einem Kapillarende die Blastozysten und geben Sie sie in einen frischen Tropfen Medium. Entfernen Sie nach dem Spülen der Blastozysten die Zona pellucida, indem Sie die Embryonen kurz mit der sauren Tyrodelösung waschen.

Sobald die Zona nicht mehr sichtbar ist, übertragen Sie die Blastozysten zurück in das Manipulationsmedium. Waschen Sie die Blastozysten bei Raumtemperatur PBS und fixieren Sie sie, indem Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf 4%PFA in PBS übertragen. Nach der Fixierung werden die Blastozysten zur Lagerung bei vier Grad Celsius wieder in PBS überführt.

Nach der Durchführung der Imunofluoreszenz gemäß dem Textprotokoll werden mit einer feinen Mundpipette Mikrotropfen von PBS oder nuklearer Fleckenlösung auf die Glasoberfläche einer 35-mm-Glasbodenschale aufgetragen und mit Mineralöl bedeckt. Legen Sie die Embryonen in die Mikrotropfen und ordnen Sie sie gleichmäßig an, vorzugsweise mit dem ICM-Kavitätenzugang parallel zur Glasoberfläche, dann stellen Sie die Schale auf den Mikroskophalter. Verwenden Sie für die konfokale Bildgebung die niedrigste Laserleistung, die ein starkes Signal-Rausch-Verhältnis bietet, ohne die Fluorophore auszubleichen.

Passen Sie die Verstärkung und den Offset an, um den größten Dynamikbereich zu erhalten, ohne das Sample zu überbelichten. Die Erfassung des größten Teils oder des gesamten Graustufenbereichs erleichtert die Erkennung kleiner Intensitätsunterschiede zwischen Bildern. Befolgen Sie die zusätzlichen Details im Textprotokoll, um Embryonen über die gesamte Z-Achse abzubilden.

Folgen Sie der grafischen Benutzeroberfläche des MATLAB-basierten Segmentierungstools Modular Interactive Nuclear Segmentation (MINS), um ein konfokales Bild oder einen ganzen Z-Stapel von Rohdaten zu laden, die vom Mikroskop generiert wurden. Um das Ergebnis der einzelnen Schritte anzuzeigen, klicken Sie auf die entsprechende Schaltfläche "Ansicht". Ein gelbes Etikett über der Schaltfläche zeigt an, dass der Vorgang in Bearbeitung ist.

Ein grünes Etikett zeigt an, dass der Vorgang abgeschlossen ist. Bewerten Sie das Ergebnis des Erkennungsschritts, bevor Sie mit der Segmentierung fortfahren. Wenn die Erkennung nicht zufriedenstellend ist, ändern Sie die Erkennungsparameter und führen Sie sie erneut aus.

Klicken Sie im Menü "Ausführen" im Batch-Modus auf Dateien hinzufügen" und laden Sie alle Dateien, die auf einmal verarbeitet werden sollen. Klicken Sie auf "Start Batch Mode Run" und lassen Sie der Software Zeit, die Dateien zu verarbeiten. Die Ausgabe der Segmentierung wird im selben Verzeichnis wie die Originaldateien gespeichert.

Identifizieren Sie falsch positive Ergebnisse wie apoptotische Vesikel oder andere Elemente, die keine intakten Kerne sind, aber möglicherweise durch MINS als solche identifiziert wurden. Löschen Sie die entsprechenden Einträge für False Positives aus der sternenstatistik. csv-Datei.

Bewahren Sie die ursprüngliche starstatistics. csv Datei zum späteren Nachschlagen auf, und bearbeiten Sie nur eine Kopie davon. Wenn ein Zellkern übersegmentiert und als zwei oder mehr Kerne dargestellt wurde, führen Sie entweder die Aufzeichnungen zusammen, indem Sie ihren Intensitätsgrad mitteln, oder behalten Sie einen der Datensätze für diese Zelle und verwerfen Sie den Rest.

Um die Segmentierung aufzulösen, identifizieren Sie Ereignisse, bei denen MINS die Grenze zwischen zwei oder mehr Kernen nicht erkennen und sie als einen einzigen segmentieren konnte, oder bei denen ein Kern nicht vollständig erkannt werden konnte. Verwenden Sie ImageJ, um den durchschnittlichen Grauwert für jeden Kanal in den unter- oder unsegmentierten Zellen zu messen. Suchen Sie als Nächstes einen medialen Schnitt des unteren oder unsegmentierten Kerns auf dem DNA-Kanal, indem Sie mit dem Freihandauswahlwerkzeug den Umfang des unteren oder unsegmentierten Kerns umreißen.

Drücken Sie dann Strg M"oder gehen Sie zum Menü "Analysieren"und wählen Sie Messen"Dadurch wird der mittlere Grauwert für den umrandeten Bereich aufgezeichnet und in einem neuen Fenster angezeigt. Wiederholen Sie unter Verwendung des gleichen umrissenen Bereichs, der gerade im DNA-Kanal ausgewählt wurde, die Messung jedes der interessierenden Fluoreszenzkanäle. Die Ergebnisse werden im Fenster mit den Messergebnissen auf den Kopf gestellt.

Verwenden Sie dann die erhaltenen Messungen, um die fehlerhaften Datensätze in der starstatistics. csv Datei zu ersetzen. Wenn der Zellkern untersegmentiert wurde, duplizieren Sie seine Zeile, weisen Sie jeder neuen Zelle unterschiedliche Zell-IDs zu und fügen Sie die in ImageJ erhaltenen Werte in die entsprechende Spalte ein.

In diesem Fall teilen sich beide Zellen räumliche Koordinaten. Wenn mitotische Zellkerne in der Analyse separat betrachtet werden sollen, bewerten Sie sie manuell und fügen Sie die Informationen der Datendatei hinzu. Weitere Anweisungen zur Bildverarbeitung finden Sie im Textprotokoll.

Diese Abbildung zeigt Beispiele von intakten Blastozysten in verschiedenen Stadien mit erweiterter Kavität. Hier sind Beispiele für gute Antikörper für eine Reihe von nukleären Proteinen zu sehen, darunter CDX2, GATA4, GATA6, NANOG und OCT4. Diese Probe wurde mit dem zytoplasmatischen Protein DAB2 markiert, das ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufweist.

In diesem Panel werden Beispiele für eine schlechte Färbung von GATA4 mit einem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis gezeigt, bei der die Proben nur 10 Minuten fixiert wurden. Dieser spezielle Anti-GATA4-Antikörper muss über Nacht fixiert werden, um ein starkes Signal zu liefern. Diese Embryonen wurden mit einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv mit einer NA von 1,30 und einem Arbeitsabstand von 0,21 mm abgebildet. Die mittleren Felder zeigen Vergrößerungen der ICMs bzw. einzelner Kerne und die Grenze zwischen ihnen ist zu unterscheiden.

Die unteren Felder veranschaulichen, dass die Kerndichte umso höher ist, je weiter der Embryo fortgeschritten ist, und desto größer ist die Wahrscheinlichkeit von Segmentierungsfehlern. Diese Bilder zeigen Fehler, die MINS begehen kann, wie z. B. die Erkennung apoptotischer Kerne als lebende Zellen, Übersegmentierung oder Untersegmentierung. Diese Sequenz von Z-Segmenten zeigt ein Untersegmentierungsereignis, bei dem zwei Zellen als eine identifiziert wurden.

Einmal gemeistert, kann dieses Protokoll in drei bis vier Tagen von Anfang bis Ende durchgeführt werden, mit einer Zeitbelastung von zwei bis vier Stunden pro Tag. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, sehr konsistent mit den Versuchsbedingungen zu sein, d. h. mit Immunfluoreszenzprotokollen und Bildgebungsparametern. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie von Mäusen, um in situ quantitative Analysen der Gen- und Proteinexpression in einzelnen Zellen durchzuführen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Bilddaten erfassen können, die für die quantitative In-situ-Expressionsanalyse geeignet sind.