Name: Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Lernen Sie die quantitative Proteinanalyse in Maus-Präimplantationsembryonen mit Einzelzellauflösung. Diese Konfokalmikroskopie-Methode ermöglicht Hochdurchsatzanalysen zur Untersuchung der Linienspezifikation.

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Die Autoren danken Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan und Panagiotis Xenopoulos für ihren Input zur Datenverarbeitung, -analyse und -darstellung, Berenika Plusa für die Unterstützung bei der Entwicklung des Immunfluoreszenzprotokolls und der Antikörpertests sowie den Mitgliedern des Hadjantonakis-Labors für ihre Kommentare zum Manuskript und zur Entwicklung dieses Protokolls. Die Arbeit in unserem Labor wird von den National Institutes of Health R01-HD052115 und R01-DK084391 sowie von NYSTEM N13G-236 unterstützt.

<ol><li>Saiz, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+fate+decisions+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Early cell fate decisions in the mouse embryo.</a> Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).</li>
<li>Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+a+blastocyst%3A+cell+behaviors+driving+cell+fate+choice+and+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).</li>
<li>Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cells+get+together%3A+High-resolution+approaches+to+study+the+dynamics+of+early+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development.</a> Seminars in cell & developmental biology. , (2015).</li>
<li>Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Efficient+2D%2F3D+Nuclear+Segmentation+Method+for+Analysis+of+Early+Mouse+Embryo+and+Stem+Cell+Image+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data.</a> Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).</li>
<li>Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oct4+is+required+for+lineage+priming+in+the+developing+inner+cell+mass+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst.</a> Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).</li>
<li>Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+Levels+Modulate+Primitive+Endoderm+Cell+Fate+Choice+and+Timing+in+the+Mouse+Blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst.</a> Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).</li>
<li>Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneities+in+Nanog+Expression+Drive+Stable+Commitment+to+Pluripotency+in+the+Mouse+Blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst.</a> Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).</li>
<li>Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. Optical Methods in Developmental Biology III, 9334, (2015).</li>
<li>Fleming, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+cell+allocation+to+trophectoderm+and+inner+cell+mass+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).</li>
<li>Dietrich, J. -E., Hiiragi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+patterning+in+the+mouse+pre-implantation+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo.</a> Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).</li>
<li>Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sequential+cell+behaviours+direct+primitive+endoderm+formation+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst.</a> Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).</li>
<li>Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+Lrp2+pathway+members+reveals+progressive+epithelial+differentiation+of+primitive+endoderm+in+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).</li>
<li>Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Erk+signalling+promotes+ground+state+pluripotency+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo.</a> Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).</li>
<li>Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signal-dependent+segregation+of+primitive+endoderm+and+epiblast+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst.</a> Development. 137 (5), 715-724 (2010).</li>
<li>Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+formation+of+the+first+two+distinct+cell+types+of+the+inner+cell+mass+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).</li>
<li>Artus, J., Panthier, J. -J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+PDGF+signaling+in+expansion+of+the+extra-embryonic+endoderm+lineage+of+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst.</a> Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).</li>
<li>Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primitive+endoderm+lineage+of+the+mouse+blastocyst%3A+Sequential+transcription+factor+activation+and+regulation+of+differentiation+by+Sox17%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17.</a> Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).</li>
<li>Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF4+is+required+for+lineage+restriction+and+salt-and-pepper+distribution+of+primitive+endoderm+factors+but+not+their+initial+expression+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse.</a> Development. 140 (2), 267-279 (2013).</li>
<li>Bessonnard, S., De Mot, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata6%2C+Nanog+and+Erk+signaling+control+cell+fate+in+the+inner+cell+mass+through+a+tristable+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network.</a> Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).</li>
<li>Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+RR+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).</li>
<li>Czechanski, A., Byers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li>
<li>Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cell+lineage+specification+in+a+marsupial%3A+a+case+for+diverse+mechanisms+among+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals.</a> Development. 140, 965-975 (2013).</li>
<li>Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitotic+progression+and+preimplantation+lethality+in+mice+lacking+OMCG1%2C+a+new+evolutionarily+conserved+nuclear+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein.</a> Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).</li>
<li>Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+protein+kinase+C+couples+cell+sorting+with+primitive+endoderm+maturation+in+the+mouse+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst.</a> Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode, um eine quantitative Analyse von Vollmontage Immunfluoreszenz auf Präimplantationsstadium Mausembryonen durchzuführen. Eine robuste Immunfluoreszenz-Protokoll 22 durch hochauflösende folgt, ganze-mount konfokaler Bildgebung und durch Bildsegmentierung ein maßgeschneidertes Stück Software 4 verwenden. Während die Wahl von Immunfluoreszenz-Protokoll nicht kritisch ist, finden wir das hier 22 präsentiert eine schnelle, zuverlässige, und wir...

Die Maus preimplantation Embryo ist ein Paradigma die Entstehung und Aufrechterhaltung von Pluripotenz in vivo zu untersuchen, sowie ein Modell für die Untersuchung von Zellschicksal Spezifikation und de novo Epithelisierung in Säugetieren. Die preimplantation Stadien der Entwicklung von Säugetieren sind für die Errichtung der drei Zelllinien her, die zur Blastozyste ausmachen, nämlich die pluripotenten Epiblasten -, die zu den meisten somatischen Geweben und Keimzellen gibt - und zwei extraAbstammungsLinien, die Trophektoderm (TE) und der primitive Endoderm (PRE) (1A) 1,2. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren (1) Ernte und Präimplantationsstadium Mausembryonen zu beheben, (2) durchführen Immunfluoreszenz-Proteine ​​von Interesse zu kennzeichnen, (3) durchzuführen ganze-mount-Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop mit z-Schnittfunktionen verwenden und (4) Kern Segmentierung von konfokalen Bildern durchführen und die anschließende quantitative Bildanalysen. Diese Pipeline erlaubt ter unvoreingenommene Messung der Proteinspiegel für die Zuordnung von Zellidentitäten Subpopulationen von Zellen in situ zu charakterisieren. Für einen einzigen Wurf (in der Regel bis zu 10 Maus-Embryonen) vor 4 Tagen, von Embryo-Entnahme zur Datenanalyse (Abbildung 1B) - Dieses Protokoll kann in weniger als 3 durchgeführt werden. Die gleichzeitige Analyse mehrerer Würfe würde die Bildgebung und Datenanalysezeit Belastung erhöhen, wodurch die Gesamtlänge des Protokolls erstreckt. Die Präimplantationsstadium Mausembryo ist ein experimentell handhabbar System, das aufgrund seiner geringen Größe und stereotypen Morphologie 3, geeignet ist, auch für in toto Imaging von zellulären Prozessen mit Einzelzellauflösung. Um eine unvoreingenommene, Systemebene Analyse einer statistisch relevanten Anzahl von Embryonen durchgeführt werden, eine automatisierte, ist die quantitative Analyse Pipeline wünschenswert. Aufgrund der hohen Kerndichte von der inneren Zellmasse (ICM) von Blastozysten ( <stRong&gt; 1A, 2A), versagen herkömmliche Bildsegmentierung Plattformen ausreichender Genauigkeit, um eine automatische oder halbautomatische Arbeitsablauf zu schaffen. Auf der anderen Seite, manuelle Segmentierung, während genau, erlaubt es nicht, die Verarbeitung großer Kohorten von Zellen und Embryonen, noch ist es geeignet für eine reproduzierbare, objektive Bestimmung von Zellidentitäten - was besonders wichtig ist, wenn Entwicklungsstadien studiert, wo Muster von Marker Ausdruck noch nicht vollständig gelöst (zB keine binäre Distribution über eine Bevölkerung aufweisen). Wir haben vor kurzem ein Bild Segmentierungsverfahren zugeschnitten für Maus Präimplantationsstadium Embryonen und embryonalen Stammzellen der Maus (ES-Zellen), die eine hohe Genauigkeit erreicht, während erfordert nur minimalen Benutzereingaben 8.4 entwickelt und validiert. Die Analyse Pipeline hier vorgestellten dreht sich um die MATLAB-basierte Bildsegmentierung Werkzeug Modular Interactive Kernsegmentierung (MIN) 4. MINS performs unbeaufsichtigt Kernsegmentierung auf große Chargen von konfokalen Z-Stapel, nachdem der Benutzer eine minimale Anzahl von Bildeigenschaften hergestellt ist, eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) (Tabelle 1) 4 verwendet wird. Diese Pipeline effizient zur Erzeugung von Hochdurchsatz-Daten auf die Proteinexpression und Zellortung sowohl in Wildtyp erwiesen hat, experimentell behandelt und genetisch Embryonen und WSR 7.5 geändert. Im vorliegenden Protokoll beschreiben wir die Anwendung von Minuten, um die Segmentierung von preimplantation stufigen Embryo Bilder. Beispiele für MINS Leistung auf WSR verweisen wir auf 4,7. Die automatisierte Kernsegmentierungsschritt reduziert die zeitliche Belastung der Zelle Identifikationsprozess, während die räumlichen und Fluoreszenzintensitätsmessungen eine unvoreingenommene Bestimmung von Zellidentitäten und die Erzeugung von dreidimensionalen Karten der Genexpression Domänen und Zellenposition in dem Embryo (Abbildung ermöglichen 1C </strong&gt;). Darüber hinaus ermöglicht die Skalierbarkeit dieses Workflows anwendbar es um die Analyse der einzelnen Würfe durch die großen Kohorten von experimentell behandelten Embryonen oder Embryonen von unterschiedlichen genetischen Hintergründe 5,6. MIN ist bei http://katlab-tools.org (die Software erfordert eine MATLAB Lizenz) frei verfügbar. Kein Ansatz bis heute entwickelt erlaubt die Erzeugung solche eingehende Daten auf die Proteinexpression und Zellortung in Maus Präimplantationsembryonen. Alle Versuche, die bisher in dieser Art von Daten zu quantifizieren sind für verschiedene Bevölkerungsgruppen in den Embryo (entweder völlig manuell oder softwaregestützt) 9-19 auf die manuelle Ermittlung und Quantifizierung von Zellzahlen beschränkt. Dieser Ansatz (unter Einbeziehung der MIN-Software) wurde auf Maus Präimplantationsembryonen und WSR zugeschnitten für und getestet; trotzdem seine Leistung auf anderen Systemen mit hoher Atomdichte, obwohl noch nicht erprobt, wird voraussichtlich gleichwertig zu sein.

<table><tbody><tr><td>Embryo Collection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>stumpfe Sonde zur Steckerprüfung</td><td>Roboz</td><td>RS-9580</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Roboz</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgieschere</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur Pipetten</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Vormontiertes Aspiratorrohr & Mundstück</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Längerer Gummischlauch</td><td>Fisher</td><td>14-178-2AA&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>M2</td><td>Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>FHM</td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>Saure Tyrodenlösung</td><td>Millipore</td><td>MR-004-D</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>4-Well-Platten</td><td>Nunc/Thermo-Fisher</td><td>12-566-300&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><stark>Immunfluoreszenz</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-U-Bodenplatten</td><td>Fisher</td><td>14-245-73</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Sigma</td><td>H0146<</td><td></td></tr><tr><td>stark>Primäre Antikörper</stark></td><td></td><td></td><td>Concentration</td></tr><tr><td>CDX2</td><td>Biogenex</td><td>AM392-5M</td><td>1:200</td></tr><tr><td>GATA6</td><td>R& D</td><td>AF1700</td><td>1:100</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9053</td><td>1:100, 10 min Fixierung</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1237</td><td>1:100, O/N Fixierung</td></tr><tr><td>SOX17</td><td>R& D</td><td>AF1924</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>1:500</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:100, 10 min to O/N Fixation</td></tr><tr><td>DAB2</td><td>BD</td><td>BD-610464</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Sekundärantikörper</td><td>Life Technologies</td><td>Various</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Glasbodenschalen</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Segmentation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer mit 64-Bit-Windows-Betriebssystem</td><td></td><td>n/a</td><td>Überprüfen der minimalen Systemanforderungen bei http://katlab-tools.org und in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports</td></tr><tr><td>MATLAB (Software)</td><td>Mathworks</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>MINS (Software)</td><td>Kostenlos</td><td>n/a</td><td>http://katlab-tools.org</td></tr></tbody></table>

quantitative analyse der proteinexpression zu studieren lineage spezifikation in maus präimplantationsembryonen

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Dieses Protokoll stellt ein Verfahren, in situ quantitative Einzelzellexpressionsanalysen von Protein durchzuführen Abstammung Spezifikation zu studieren in Maus Präimplantationsembryonen. Die Verfahren, die für die Embryo-Entnahme, Immunfluoreszenz-Bildgebung auf einem konfokalen Mikroskop und Bildsegmentierung und Analyse beschrieben. Dieses Verfahren erlaubt die Quantifizierung der Expression von mehreren Kernmarken und die räumliche (XYZ) Koordinaten aller Zellen im Embryo. Es nutzt MINS, einer Bildsegmentierung Software-Tool speziell für die Analyse von konfokalen Bildern von Präimplantationsembryonen entwickelt und embryonalen Stammzellen (ESC) Kolonien. MINS trägt über den X, Y unbeaufsichtigt Kernsegmentierung und Z Abmessungen und erzeugt Informationen über die Zellposition im dreidimensionalen Raum sowie Kernfluoreszenz Ebenen für alle Kanäle mit minimalem Benutzereingabe. Während dieses Protokoll wurde für die Analyse der Bilder optimiertein gutes Signal-Rausch-Verhältnis und bei denen eine hohe Keimdichte stellt eine Hürde für die Bildsegmentierung von Präimplantationsstadium Maus-Embryonen, kann es leicht auf die Analyse von allen anderen Proben angepasst werden ausstellenden (z. B. Expressionsanalyse von embryonalen Stammzellen (ESC ) Kolonien, Zellen in Kultur, Embryonen von anderen Arten oder Stadien, etc.) zu differenzieren.

Zur Interpretation der Daten und Präsentation zu erleichtern, sollte darauf geachtet werden, nicht die Embryonen während der Entnahme und Manipulation zu beschädigen, so dass alle Zellen und ihre relative Position analysiert werden 2A -. D zeigt Beispiele von intakten Blastozysten in unterschiedlichen Stadien mit einem erweiterten Hohlraum. Sollten Schäden auftreten, sollte besonders darauf geachtet werden, bei der Analyse und Interpretation der Ergebnisse. <p class=...

Dieses Protokoll stellt eine Methode quantitative, single-cell in situ Analyse der Proteinexpression durchzuführen lineage in mouse Spezifikation Präimplantationsembryonen zu studieren. Die Verfahren, die für die Sammlung von Blastozysten, Vollmontage Immunfluoreszenz-Nachweis von Proteinen, Imaging von Proben auf einem konfokalen Mikroskop und Kern Segmentierung und Bildanalyse beschrieben.

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Proteinspiegel in situ in Präimplantationsembryonen von Mäusen zu quantifizieren. Diese Methode ermöglicht es uns also, halbautomatisiert eine Hochdurchsatzanalyse von konfokalen Mikroskopiebildern mit Einzelzellauflösung durchzuführen. Diese Methode kann verwendet werden, um Proteinkonzentrationen auf konfokalen Bildern zu quantifizieren, wenn eine hohe Kerndichte vorhanden ist und wenn man Heterogenitäten innerhalb von Zellpopulationen untersuchen möchte.Ziehen Sie zunächst mit einer offenen Flamme auf einer Glaspasteurpipette ein Kapillarende an der Spitze. Reiben Sie das hintere Ende der Pipette vorsichtig gegen die Kapillare, um sie zu brechen und ein stumpfes Ende zu erzeugen. Nachdem Sie eine trächtige weibliche Maus am gewünschten embryonalen Entwicklungstag geopfert haben, legen Sie die Baucheingeweide gemäß dem Textprotokoll frei und lokalisieren Sie die Gebärmutter.Halten Sie das zervikale Ende fest, schneiden Sie durch den Gebärmutterhals und ziehen Sie es vorsichtig nach oben, um beide Gebärmutterhörner zu dehnen. Schneiden Sie das Fett ab und achten Sie darauf, die Gebärmutterwand nicht zu durchstechen. Schneiden Si

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir zeigen eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Methode, um Wechselwirkungen zwischen Faktoren bei Gewebe-spezifische Gene während oder nach dem Einsetzen der Gewebe-spezifische Gen-Expression in embryonalen Maus-Gewebe zu identifizieren. Dieses Protokoll sollte allgemein anwendbar für die Untersuchung von Gewebe-spezifische Genaktivierung, wie es während der normalen Embryonalentwicklung auftritt.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Die Analyse der Proteinexpression in jungen embryonalen Mausklappen wurde durch das begrenzte verfügbare Gewebe erschwert. Dieses Manuskript enthält ein Protokoll zur Präparation von Proteinen aus sich entwickelnden embryonalen Mausklappenregionen für die Western-Blot-Analyse.

Proteinisolierung aus den Entwicklungs embryonalen Mäuseherzklappen Region

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein Verlust- zu beschreiben und zu gewinnen-Funktionsmethode, die zur Identifizierung Neogenin als stufenspezifischen Rezeptor anwendbar ist, die und die innere Zellmasse Differenzierung in preimplantation Maus-Embryonen zu Trophektoderm führt.

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

Die Segmentierungsuhr steuert die oszillatorische Genexpression über das präsomitische Mesoderm (PSM). Die dynamische Kerbaktivität ist der Schlüssel zu diesem Prozess. Wir verwenden bildgebende und computergestützte Analysen, um die zeitliche Dynamik aus räumlichen Expressionsdaten zu extrahieren und zu zeigen, dass die Expression von Delta-Liganden und Notch-Rezeptoren im PSM von Wirbeltieren oszilliert.

Zeitliche Reihenfolge der dynamischen Ausdruck von Daten aus Detaillierte Spatial Expression Maps

Diese Arbeit beschreibt ein semi-high-throughput-Protokoll, das eine gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Embryogenese in 80–100 C. elegans Embryonen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Darüber hinaus sind Bildverarbeitungs- und Visualisierungstools enthalten, um die Datenanalyse zu optimieren. Die Kombination dieser Methoden mit kundenspezifischen Reporterstämmen ermöglicht eine detaillierte Überwachung der Embryogenese.

Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

Hier präsentierten wir eine multiplexierte einzellige mRNA-Sequenzierungsmethode, um die Genexpression in embryonalen Geweben der Maus zu profilieren. Die tropfenbasierte einzelzellbasierte mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) in Kombination mit Multiplexing-Strategien kann Einzelne Zellen aus mehreren Proben gleichzeitig profilieren, was die Reagenzkosten deutlich reduziert und experimentelle Chargeneffekte minimiert.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Wir beschreiben eine Technik zur Profilierung von microRNAs in frühen Mausembryonen. Dieses Protokoll überwindet die Herausforderung des niedrigen Zelleingangs und der kleinen RNA-Anreicherung. Dieser Assay kann verwendet werden, um Veränderungen in der miRNA-Expression im Laufe der Zeit in verschiedenen Zelllinien des frühen Mausembryons zu analysieren.

Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen

In dieser Arbeit beschreiben wir eine massenspektrometriebasierte proteomische Charakterisierung von Zelllinien mit bekannten Gewebeschicksalen im Embryo von Xenopus laevis im Wirbeltier.

Zellliniengesteuerte Massenspektrometrie-Proteomik im sich entwickelnden (Frosch-)Embryo

In dieser Arbeit wird eine Pipeline für hochwertige Einzelzell- und Zellkernsuspensionen von gastrulierenden Mausembryonen für die Sequenzierung von Einzelzellen und Zellkernen etabliert.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Dieses Protokoll bietet eine optimierte rechnerische Pipeline zur Quantifizierung von naszierenden Enhancer-Transkripten. Durch die Integration von Chromatinzugänglichkeit, Chromatinmerkmal und Transkriptionsdaten ermöglicht es einen genauen Nachweis und eine strangspezifische Analyse der Enhanceraktivität in komplexen intragenen Regionen, während es für Forscher ohne umfangreiche bioinformatische Ausbildung zugänglich bleibt.

Eine computergestützte Pipeline für die Quantifizierung intergener/intragener Enhancer-RNA in embryonalen Stammzellen der Maus

Lernen Sie die quantitative Proteinanalyse in Maus-Präimplantationsembryonen mit Einzelzellauflösung. Diese Konfokalmikroskopie-Methode ermöglicht Hochdurchsatzanalysen zur Untersuchung der Linienspezifikation.

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

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