Zeitraffer-Video-Mikroskopie für die Beurteilung der EYFP-Parkin Aggregation als Marker für Cellular Mitophagie

Das übergeordnete Ziel dieser Zeitraffervideomikroskopie besteht darin, den selektiven, von Parkin vermittelten Abbau geschädigter Mitochondrien während des Mitophagie-Prozesses zu verfolgen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des molekularen Stoffwechsels zu beantworten, beispielsweise wie die Mitophagie anhaltende pathologische Zustände beeinflusst. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein äußerst leistungsfähiges Werkzeug bietet, um die Dynamik markierter Proteine während ihrer molekularen Prozesse zu verfolgen.

Diese Methode kann Einblicke in den mitochondrialen Lebenszyklus geben. Sie kann außerdem auf andere Systeme angewendet werden, wie beispielsweise primäre Zellkulturen, embryologische Untersuchungen und die Vorhersage einer Priorität. Die in dieser Studie verwendeten immortalisierten murinen embryonalen Fibroblasten werden in vollständigem DMEM-Medium auf einer zehn Zentimeter großen Zellkulturschale bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre mit fünf Prozent Kohlendioxid gezüchtet.

Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 Prozent erreicht haben, entfernen Sie das Medium durch sterile Absaugung und geben Sie zehn Milliliter sterile PBS hinzu. Entfernen Sie die PBS und geben Sie ein Milliliter 0,25-prozentiges Trypsin-EDTA hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für zwei bis drei Minuten, bis sich die Zellen gelöst haben.

Geben Sie vier Milliliter vollständiges DMEM-Medium hinzu und resuspendieren Sie die Zellen. Entnehmen Sie zehn Mikroliter der Zellsuspension, um die Zellen mit einem Hämozytometer zu zählen. Säen Sie eine mal zehn hoch sechs Zellen auf eine zehn Zentimeter große Zellkulturschale aus und inkubieren Sie 24 Stunden lang.

Am folgenden Tag die Zellen einmal mit PBS waschen und durch Trypsinierung ablösen, wie zuvor gezeigt. Vier Milliliter komplettes DMEM-Medium hinzufügen, die Zellen erneut suspendieren und die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen. Die Zellen bei 250 × g und vier Grad Celsius fünf Minuten lang zentrifugieren.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter steriler PBS. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut. Entfernen Sie den Überstand nach der zweiten Zentrifugation.

Geben Sie 100 Mikroliter der Elektroporationslösungsmischung zum Zellpellet und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig durch Pipettieren. Fügen Sie dann der Zellsuspension zwei Mikrogramm EYFP-Parkin-Expressionsplasmid und ein Mikrogramm DsRed2-Mito-Expressionsplasmid hinzu. Überführen Sie die Lösung mit einer Einweg-Pasteurpipette in eine sterile Küvette.

Elektroporieren Sie die Zellen mithilfe eines voreingestellten Programms. Unmittelbar nach der Elektroporation 500 Mikroliter frisches, vorgewärmtes komplettes DMEM-Medium zu den Zellen geben und die Zellen auf einer sechs Zentimeter großen, für Live-Bildgebung geeigneten Zellkulturplatte ausplattieren.

Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang in einer befeuchteten Atmosphäre mit fünf Prozent Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie vor Beginn dieses Verfahrens die Temperatur der Mikroskopkammer auf 37 Grad Celsius ein. Bereiten Sie anschließend ein spezielles Medium für die Live-Bildgebung vor, indem Sie Folgendes mischen: phenolfreies DMEM, ergänzt mit zehn Prozent FBS, zwei Millimolar pro Liter L-Glutamin, 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und 100 Milligramm pro Milliliter Streptomycin.

Das Medium im Wasserbad auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Das Medium der elektroporierten Zellen unter sterilen Bedingungen absaugen und ein Milliliter vorgewärmtes Medium für die Live-Bildgebung hinzufügen. Die Platte 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Nachdem bestätigt wurde, dass die Kammer des Mikroskops eine stabile Temperatur von 37 Grad Celsius aufweist, strömt man fünf Prozent Kohlendioxid in die Kammer ein. Anschließend wird die Platte mit den elektroporierten Zellen vorsichtig und ohne größere Bewegungen oder Schwingungen in die Kammer des Mikroskops platziert.

Stellen Sie über die Software-Schnittstelle das Mikroskop so ein, dass es die fluoreszierenden Signale der Fusionsproteine erfasst, die durch die Expressionsvektoren EYFP Parkin und DsRed2 Mito kodiert werden. Öffnen Sie die Software für die zeitraffende Videomikroskopie. Wählen Sie im oberen Menü FITC für EYFP Parkin und Rhodamin für DsRed2 Mito aus.

Wählen Sie eine Vergrößerung von 20X. Suchen Sie mithilfe der Software-Schnittstelle nach einer einzelnen Zelle, die beide kotransfizierten Vektoren exprimiert, und registrieren Sie die Position. Wiederholen Sie dies für mindestens 10 Zellen pro experimentellen Bedingung.

Wählen Sie im Menü Apps und klicken Sie auf Mehrdimensionale Aufnahme. Wählen Sie in den Fenstern zur mehrdimensionalen Aufnahme die erforderlichen Parameter aus, wie beispielsweise die Anzahl der Aufnahmen, das Zeitintervall zwischen den einzelnen Aufnahmen und die Position der aufgezeichneten Zelle. Klicken Sie auf Aufnehmen, um die basale Aufnahme beider fluoreszierender Signale zu starten.

Sammeln Sie alle fünf Minuten Bilder über einen Gesamtzeitraum von fünfzehn Minuten. Während der Bildaufnahme bereiten Sie ein vorgewärmtes Medium für die Live-Bildgebung vor, das Carbonyl Cyanid 4-trifluormethoxyphenylhydrazon, oder FCCP, in einer Konzentration, die doppelt so hoch ist wie die endgültige Arbeitskonzentration, enthält. Unterbrechen Sie den Aufnahmeprozess und geben Sie vorsichtig ein Milliliter des vorgewärmten Mediums für die Live-Bildgebung mit FCCP in die Platte innerhalb der Kammer des Mikroskops.

Nach der Zugabe von FCCP ist es wichtig, das Mikroskop erneut zu fokussieren, bevor die Bildaufnahme fortgesetzt wird. Starten Sie den Aufnahmeprozess wie zuvor beschrieben erneut und sammeln Sie Bilder über einen Zeitraum von insgesamt drei Stunden unter Verwendung der aufgezeichneten Position. Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, speichern Sie alle aufgenommenen Bilder zur späteren Analyse.

Abgebildet sind hier Zeitrafferaufnahmen der fluoreszierenden Signale von EYFP-Parkin und DsRED2-Mito in Fibroblasten vor der Gabe von FCCP. Die weißen Boxen markieren die vergrößerten Bereiche der jeweiligen rechten Panels. Während der Ausgangszeitpunkte ist EYFP-Parkin, dargestellt in Grün, homogen im gesamten Zellbereich verteilt.

Das in Rot dargestellte Mitochondriennetzwerk erscheint gut vernetzt, wie durch die weißen Pfeile angezeigt. Nach Gabe von FCCP wird innerhalb von fünf Minuten eine Fragmentierung der Mitochondrien aufgrund einer Membran-Depolarisation beobachtet. EYFP-Parkin ist jedoch weiterhin homogen im Zytoplasma verteilt.

55 Minuten nach der Gabe von FCCP wird EYFP-Parkin an die beschädigten mitochondrialen Membranen rekrutiert, um den Mitophagie-Prozess auszulösen. Die Bewegung von EYFP-Parkin zur mitochondrialen Membran nach der FCCP-Gabe ist in diesem repräsentativen Zeitrafferfilm dargestellt. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der Autophagie, um den mitochondrialen Recyclingprozess zu untersuchen. Sie ermöglicht es, den Mitophagieprozess als mitochondriale Qualitätskontrolle in den Zellen zu erforschen.