Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn von Mäusen zu isolieren, um sie durch multiparametrische Durchflusszytometrie zu quantifizieren und phänotypisch zu charakterisieren. Die Analyse der postischämischen Entzündung im Gehirn mittels Mehrfarben-Durchflusszytometrie bietet ein tiefes Verständnis der immunologischen Prozesse, die an der Progression der Läsion, der Reparatur und dem Gesamtergebnis des Schlaganfalls beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens ist die schnelle, einstufige Dichtegradientenzentrifugation, die die Isolierung einer großen Anzahl lebensfähiger Immunzellen aus dem ischämischen Mausgehirn ermöglicht.

Die Anwendung dieser Technik zielt auf die Identifizierung und Validierung neuer immunmodulatorischer Behandlungsstrategien ab, die in einem breiteren Zeitfenster des Schlaganfalls angewendet werden können. Beginnen Sie damit, ein Ende eines peristaltischen Perfusionspumprohrs in eiskaltes, kalzium- und magnesiumfreies HBSS zu tauchen. Befestigen Sie eine stumpfe 23-Gauge-Nadel am anderen Ende des Röhrchens.

Und schalten Sie die Pumpe ein, um den Schlauch vollständig mit HBSS zu füllen. Legen Sie als nächstes eine euthanasierte Maus dorsal auf ein Sezierbrett, das in eine Plastikschale eingebettet ist, und stecken Sie die Vorder- und Hinterpfoten so weit wie möglich mit 20-Gauge-Nadeln fest. Fassen Sie mit einer geraden Zange mit zwei mal zwei Zähnen die Bauchhaut und machen Sie mit einer scharfen Irisschere einen seitlichen Schnitt durch das Integument und die Bauchdecke, um die Leber freizulegen.

Hebe dann das Brustbein an und benutze die stumpfe Klinge einer scharfen, stumpfen Irisschere, um das Zwerchfell einzuschneiden. Schneiden Sie den seitlichen Brustkorb weiterhin auf beiden Seiten in kaudokranialer Richtung auf, achten Sie darauf, Lunge, Herz und Brustarterien nicht zu verletzen, und verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um den Hautlappen anzupassen. Stecken Sie die Klappe an das Präparierbrett und trennen Sie das Herz vorsichtig vom Bindegewebe.

Halten Sie das Herz mit einer stumpfen Pinzette fest und führen Sie dann die Spitze der 23-Gauge-Nadel am Ende des Perfusionsschlauchs in die Spitze des linken Ventrikels ein, wobei Sie darauf achten, dass das intraventrikuläre Septum nicht verletzt wird. Schneiden Sie mit einer scharfen Irisschere den rechten Vorhof ein und starten Sie sofort die Pumpe, wobei Sie darauf achten, dass sich beim Pumpen keine Blasen bilden. Wenn die Leber eine helle Kaffeefarbe annimmt, verwenden Sie eine gerade chirurgische Schere, um die Maus direkt hinter dem Schädel zu enthaupten.

Verwenden Sie dann die Irisschere, um einen Schnitt in der Mitte der Kopfhaut zu machen. Wenn der Schädel sichtbar ist, stecken Sie eine Spitze einer scharfen Irisschere in das Foramen magnum und machen Sie einen seitlichen Schnitt in den Knochen. Wiederholen Sie den Schnitt auf der anderen Seite.

Schneiden Sie dann mit einer scharfen Irisschere vorsichtig von der gleichen Kavität die Mittellinie hinauf in Richtung Nase. Schälen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig die Schädelknochen von jeder Gehirnhälfte. Heben Sie dann das Gehirn mit einem Spatel an und verwenden Sie eine scharfe Irisschere, um die Hirnnervenfasern, mit denen es am Schädel befestigt ist, vorsichtig zu präparieren.

Legen Sie das Gehirn in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das 10 Milliliter HBSS mit Kalzium und Magnesium auf Eis enthält. Um das Hirngewebe in eine einzellige Suspension zu dissoziieren, entfernen Sie zunächst mit einer sauberen Rasierklinge vorsichtig den Hirnstamm und das Kleinhirn. Verwenden Sie dann eine weitere saubere Rasierklinge, um das Gehirn zu halbschneiden, indem Sie jede Hemisphäre entlang der koronalen Ebene in drei etwa gleich große Stücke schneiden.

Zerdrücken Sie mit dem Kolbenende einer Fünf-Milliliter-Spritze die Hirngewebestücke durch ein 100-Mikron-Zellsieb und spülen Sie das Sieb kontinuierlich mit eiskaltem HBSS mit Kalzium und Magnesium aus. Legen Sie dann die homogenisierten Gewebe auf Eis. Wenn alle Proben verarbeitet sind, schleudern Sie die Zellsuspensionen herunter und entsorgen Sie die Überstände vorsichtig.

Die Pellets werden in einem Milliliter Aufschlusspuffer resuspendiert. Dann überführen Sie die Zellsuspension in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen und inkubieren die Zellen unter langsamer, kontinuierlicher Rotation bei 37 Grad Celsius. Nach einer Stunde sieben Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikron-Zellsieb und spülen den Filter gründlich mit drei Millilitern Waschpuffer aus, der DNase enthält.

Waschen Sie dann das Sieb mit 15 Millilitern DNase-freiem Waschpuffer, schleudern Sie die Zellen herunter und entsorgen Sie den Überstand. Um die Zelltrümmer und das Myelin zu entfernen, resuspendieren Sie die Zellen in fünf Millilitern Raumtemperatur mit 25 % Dichtegradient und überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Mischen Sie die Zellen im Gradienten gründlich mit wiederholtem sanftem Pipettieren.

Schleudern Sie dann die Zelllösung herunter. Am Ende der Trennung aspirieren Sie vorsichtig die Myelinhülle und den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren die Zellen in 10 Millilitern DNase-freiem Waschpuffer. Füllen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie sie wieder herunter, wobei Sie das Pellet in 100 Mikrolitern Kaltwaschpuffer resuspendieren.

Zählen Sie dann die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch Trypanblau-Ausschluss und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Bevor Sie mit der Immunfärbung beginnen, inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit einem anti-murinen CD26/CD32-Fc-Rezeptor-Blockierungsreagenz, um eine unspezifische Bindung zu verhindern. Geben Sie dann die Fluorophor-konjugierten Primärantikörper von Interesse bei vier Grad Celsius für 20 Minuten im Dunkeln hinzu.

Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation in zwei Millilitern Durchflusszytometrie-Puffer. Drehen Sie nach unten. Suspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern Durchflusszytometrie-Puffer und lagern Sie die Proben bis zur durchflusszytometrischen Analyse bei vier Grad Celsius.

Um die absolute Anzahl der infiltrierenden Immunzellen durch Bead-Zählung zu quantifizieren, pipettieren Sie genau 40 Mikroliter Durchflusszytometrie und 10 Mikroliter Zellsuspension in ein Zählröhrchen, das eine bekannte Anzahl von fluoreszierenden Kügelchen enthält. Als nächstes inkubieren Sie die Zell- und Bead-Suspension mit FITC-markiertem CD45-Antikörper bei vier Grad Celsius für 20 Minuten im Dunkeln, gefolgt von der umgekehrten Befüllung des Zählröhrchens mit 200 Mikrolitern Durchflusszytometrie-Puffer. Führen Sie dann sofort die Probe auf dem Durchflusszytometer durch und zeichnen Sie die Beads und CD45-positiven Zellereignisse auf.

24 Stunden nach dem Verschluss der mittleren Hirnarterie können die hirninfiltrierenden Leukozyten an ihrer CD45-hohen Expression identifiziert werden. Innerhalb der CD45-hohen Population sind die polymorphkernigen Neutrophilen anhand ihrer LY-6G-Expression zu identifizieren, während die T-Lymphozyten einen CD45-hohen, CD3-positiven Phänotyp der Zelloberfläche aufweisen. Die restlichen CD45-hohen Zellen können weiter durch ihre CD19- und CD11b-Expression unterschieden werden.

Während die CD11b-positive Fraktion in Ly-6C-hohe inflammatorische Monozyten und eine Ly-6C-niedrige Population, die die Monozyten-, Makrophagen- und dendritischen Zellpopulationen umfasst, unterteilt werden kann. Im akuten Stadium des Schlaganfalls gelangen Ly-6G-positive Neutrophile nach einem Gefäßverschluss schnell in das Gehirn. Im Gegensatz dazu nehmen die Frequenzen der CD3-positiven T-Zellen in der ischämischen Hemisphäre im Vergleich zu Scheinoperationen im Gehirn und der kontralateralen Hemisphäre ab.

Innerhalb der CD11b-positiven Population verschiebt die Hirnischämie das Gleichgewicht in Richtung eines starken Übergewichts von Ly-6C-hohen inflammatorischen Monozyten. Darüber hinaus sind die Gesamtleukozytenzahlen in der infarktierten Hemisphäre im Vergleich zu den Gehirnen der kontralateralen Hemisphäre und der Scheinchirurgie 24 Stunden nach dem Verschluss der mittleren Hirnarterie signifikant erhöht. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Immunzellen durch mechanische Fragmentierung, enzymatische Verdauung und Dichtegradientenzentrifugation aus dem ischämischen Gehirn isoliert und wie diese Zellen durch Durchflusszytometrie charakterisiert werden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Gesamtzellausbeute entscheidend von einer gründlichen Dissoziation des Gehirngewebes abhängt. Darüber hinaus ist eine ausreichende transkardiale Perfusion notwendig, um eine Kontamination der hirninfiltrierenden Leukozyten mit nicht-inflammatorischen zirkulierenden Immunzellen zu verhindern.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Genexpressionsassays oder Zytokinprofilanalysen durchgeführt werden, um zusätzliche Einblicke in die funktionelle Relevanz eines ausgeprägten Immunabszesses im Rahmen des ischämischen Schlaganfalls zu gewinnen.