Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Anzahl der mononukleären Zellen des peripheren Blutes zu charakterisieren und zu quantifizieren, die in die frühe Mikroumgebung des Hirntumors eingedrungen sind. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Hirntumorimmunologie zu beantworten, indem sie Faktoren identifiziert, die für den Transport von peripheren Immunzellen in die Mikroumgebung des Hirntumors wichtig sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zeitabhängige quantitative Daten über die Anzahl und den Aktivierungsstatus der Leukozyten liefert, die in dieses ZNS eingedrungen sind.

Nachdem Sie eine anästhesierte Maus in einen stereotaktischen Rahmen eingesetzt haben, machen Sie mit einer Skalpellklinge einen zwei Zentimeter langen Schnitt in der Mittellinie über den Schädel vom Stirnbein zum Hinterhauptbein. Ziehen Sie dann die Haut am Schnitt mit Collibra-Retraktoren zurück. Senken Sie danach eine Mikroliterspritze, die mit einer 33-Gauge-Nadel bestückt ist, direkt über den BMA ab.

Passen Sie die Position der Nadel an, um die Zielstelle für die Tumorimplantation zu erreichen. Verwenden Sie dann eine Ein-Milliliter-Tuberkulinspritze, die mit einer 26-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um diese Stelle zu markieren, indem Sie das Periost danach vorsichtig abschürfen. Bohren Sie mit dem 0,8-Millimeter-Bohrer an der Zielstelle ein Loch in den Schädel, bis es während der Bohrung die darunterliegende Dura mater erreicht.

Üben Sie intermittierenden Druck aus, gefolgt von einem schnellen Entfernen des Bohrers von der Schädeloberfläche, um übermäßige Hitze und Kraft zu vermeiden. Spülen Sie anschließend die Mikroliterspritze mit 0,9 % Natriumchlorid in einem konischen 1,7-Milliliter-Mikroröhrchen aus Polypropylen, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht verstopft ist. Bewegen Sie das konische 0,6-Milliliter-Mikroröhrchen aus Polypropylen, das die Tumorzellen enthält, mehrmals vorsichtig, um die Zellen gründlich wiederzubeleben.

Ziehen Sie dann zwei Mikroliter Zellen in die Mikroliterspritze auf und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in die Spritze gelangen. Geben Sie einen Mikroliter der Zellen auf ein 70%iges Isopropylalkohol-Vorbereitungspad, wobei genau ein Mikroliter Tumorzellen in der Spritze verbleibt. Danach führst du die Nadel nach unten, bis sie die Dura mater berührt.

Senken Sie dann die Nadel 3,5 Millimeter in das Gehirn ab und ziehen Sie die Nadel anschließend langsam und sanft um 0,5 Millimeter zurück. Geben Sie die Zellen ab, indem Sie den Spritzenkolben im Laufe von ein bis zwei Minuten drücken. Zur Durchführung einer transkardialen Perfusion an der tief anästhesierten Maus.

Führen Sie eine stumpfe Nadel in die linke Herzkammer ein. Schneiden Sie mit einer kleinen Präparierschere den rechten Vorhof ab, um die Blutdurchblutung der Maus mit Tyrolösung für einige Minuten zu ermöglichen, bis Leber und Lunge durch den Blutmangel vollständig blanchiert sind. Stellen Sie sicher, dass keine grobe Menge Blut mehr aus dem rechten Vorhof austritt.

Vor dem Entfernen der 20-Gauge-Aluminiumnabe stumpfe Nadel aus dem linken Ventrikel. Nachdem Sie die Nadel entfernt haben, lösen Sie die Maus aus dem extrudierten Polystyrolschaumblock und drehen Sie die Maus mit der Bauchseite nach unten. Trennen Sie den Kopf mit einer großen Separierschere vom Rest des Körpers.

Schneiden Sie dann die Kopfhaut an der Mittellinie mit einer kleinen Präparierschere vom Hinterhauptbein bis zur Schnauze ab, um den Schädel freizulegen. Ziehen Sie anschließend die Haut auf beiden Seiten des Schädels zurück und halten Sie den Schädel fest. Verwenden Sie ein Paar Knochen-URS, um den Schädel vorsichtig zu durchbrechen, beginnend am Hinterhauptbein, und arbeiten Sie sich nach vorne, um die dorsalen und lateralen Oberflächen des Gehirns vollständig freizulegen.

Die Entnahme des Mäusegehirns aus dem Schädel, ohne diesen zu schädigen, kann sich zunächst als schwierig erweisen. Diejenigen, die mit der Technik unerfahren sind, möchten es vielleicht mehrmals versuchen, bevor sie richtige Experimente durchführen. Nachdem die Schädelknochen entfernt wurden, drehen Sie den Kopf der Maus mit der Bauchseite nach oben.

Durchtrennen Sie die Hirnnerven an der Basis des Gehirns, um es vom Schädel zu befreien. Bei diesem Verfahren wird mit einer sauberen, einschneidigen Rasierklinge der Bereich des Gehirns, in dem sich der Tumor befindet, isoliert, indem ein sagittaler Schnitt in der Mitte des Gehirns vorgenommen wird. Um die beiden Hemisphären zu präparieren, drehen Sie die ipsilaterale Hemisphäre mit der medialen Seite nach unten und machen Sie einen koronalen Schnitt am Kleinhirn und einen weiteren am Riechkolben, um das Zielgewebe zu isolieren, das das Tumorimplantat enthält.

Legen Sie als Nächstes das Zielgewebe in die beschriftete Glas-Daunen-Gewebeschleifmaschine, die einen Milliliter DPBS enthält. Schieben Sie den Kolben ganz nach unten und drehen Sie ihn siebenmal, um das Gewebe aufzubrechen. Heben Sie danach den Kolben an, damit sich die Flüssigkeit wieder auf dem Boden des Tissue-Grinders absetzen kann.

Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Drehen Sie den Kolben jedoch nur viermal während der nächsten zwei Wiederholungen und dreimal während der letzten Wiederholung. Um eine Überbeanspruchung des Gehirngewebes zu vermeiden.

Tragen Sie anschließend drei Ein-Milliliter-Volumina eiskaltes DPBS auf die Seiten des Kolbens auf, um die verbleibende Hirnsubstanz in den Gewebeschleifer zu spülen. Dann suspendieren wir die TRID-Gehirnsubstanz, indem wir auf und ab pipettieren, und geben sie in ein beschriftetes 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf Eis. Spülen Sie die Seiten des Daunenholzwolfs mit einem zusätzlichen Milliliter eiskaltem DPBS ab und geben Sie es in dasselbe 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Bewahren Sie alle Röhrchen mit TRID-Gehirnsubstanz auf Eis auf, bis alle Proben verarbeitet wurden. Dann schleudern Sie die TRID-Gehirnsubstanz in den 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen bei 740 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius herunter. Als nächstes entfernen Sie den Überstand und suspendieren die pelletierte Gehirnsubstanz in einem Milliliter einer zuvor hergestellten Mischung aus Kollagenase und DNA-Verdauungsenzymen.

Legen Sie die 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen in ein Reagenzglasgestell und stellen Sie das Gestell für 15 Minuten in ein 37-Grad-CS-Wasserbad. Rühren Sie die Proben dann während der Inkubationszeit zweimal vorsichtig um, indem Sie die Röhrchen schnippen, um die Gewebedisaggregation zu erleichtern. Geben Sie anschließend sechs Milliliter kaltes DPBS in jedes Röhrchen, um die Verdauungsenzyme zu verdünnen.

Spritzen Sie diese auf und ab, um das Gesamtvolumen zu resuspendieren und durch sterile 70-Mikron-Nylonnetzfilter in neu etikettierte 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf Eis zu filtern. Schleudern Sie anschließend die Suspension der Gehirnzellen 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 740 mal G herunter, um ein einzelnes Zellpellet zu erhalten. Nehmen Sie die 15-Milliliter-Röhrchen aus der Zentrifuge und legen Sie sie auf Eis.

Erhöhen Sie dann die Temperatureinstellung an der Zentrifuge auf etwa 21 Grad Celsius, um den nächsten Schritt vorzubereiten. Entfernen Sie anschließend die Zellsnat vollständig und resuspendieren Sie die Zellpellets zunächst in einem Milliliter Zentrifugationsmedium mit einer Dichte von 70 % mit einer P 1000-Mikropipette. Geben Sie dann vier weitere Milliliter Zentrifugationsmedium mit einer Dichte von 70 % in jedes Röhrchen.

Setzen Sie die Kappen sicher auf und homogenisieren Sie die Zellsuspension, indem Sie das Röhrchen mehrmals vorsichtig umdrehen, und übertragen Sie danach die 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit Gehirnzellen, die in einer Dichte von 70 % resuspendiert sind. Zentrifugieren Sie das Medium nacheinander aus Eis in ein Reagenzglasgestell bei Raumtemperatur. Vorsichtig zwei Milliliter Zentrifugationsmedienlösung mit 37 % Dichte auf die fünf Milliliter Zentrifugationsmedien mit 70 % Dichte auflegen, um eine saubere Grenzfläche zwischen den beiden Dichte-Zentrifugationsmedienschichten zu bilden.

Markieren Sie dann die Position der Grenzfläche zwischen den beiden Schichten mit einem Marker mit feiner Spitze, damit sie nach dem Zentrifugieren leicht identifiziert werden kann, wenn die Unterscheidung weniger sichtbar wird. Die 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen bei 740-facher G-Temperatur 20 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne Unterbrechung herunterdrehen. Um zu vermeiden, dass die Grenzfläche zwischen den Dichtezentrifugationsmedienschichten nachträglich gestört wird, sammeln Sie die pbmc, die sich an der Grenzfläche zwischen den beiden Dichtezentrifugationsmedienschichten angesammelt haben, indem Sie eine P 200-Mikropipette in das Röhrchen einführen.

vorsichtiger Umgehung der Lipidschicht auf Höhe der PBMC-Bande werden langsam 200 Mikroliter von der Oberfläche der Zentrifugationsmedienschicht mit einer Dichte von 70 % extrahiert und in ein entsprechend beschriftetes Polypropylen-Faxrohr auf Eis überführt. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal, um ein Gesamtvolumen von 400 Mikrolitern pro Probe zu erreichen. Die experimentelle Fähigkeit, eine saubere Grenzfläche zwischen den beiden Dichtezentrifugationsmedienschichten zu bilden, ist entscheidend für die reproduzierbare Isolierung von p BMCs.

Man sollte das Zentrifugationsmedium mit einer Dichte von 37 % langsam gießen, während man das Röhrchen 20 bis 30 Grad über der Tischplatte anwinkelt. Diese Abbildung zeigt die Gating-Strategie für ein typisches Experiment, Gates auf GR platziert: eine positive CD 11 B-positive myeloische Zelle (siehe Schritt fünf) und NK 1.1. Positive natürliche Killerzellen, die in Schritt sechs gezeigt werden, werden dann auf der Grundlage der GZMB-Expression in den Schritten fünf prime bzw. sechs prime stratifiziert.

In dieser Abbildung zeigt das Gating von GR, einer positiven CD 11 B-positiven myeloischen Zellen und NK 1.1 positiven natürlichen Killerzellen auf FSCA im Vergleich zu SSCA die geringere lymphoide Größe der natürlichen Killerzellen im Vergleich zur relativ größeren myeloischen Population, was eine weitere Bestätigung der Identität dieser beiden pbmc-Subpopulationen darstellt. Die Daten hier zeigen, dass die Transplantation von GL 26 sitalen Eins-I-Gliomzellen in das Syngen. Ein XC 57 schwarzes Six-J-Mausgehirn induziert schnell die Rekrutierung von CD 45-positiven PBMC-Zahlen, die in Verbindung mit jedem Datenpunkt entlang der GL 26 sit GAL one I-Kurve gezeigt werden, stellen die Falteninduktion von tumorinfiltrierendem pbmc über der Kontrolle dar.

GGL 26 sit NT-Tumoren zur angegebenen Stunde nach der Tumorimplantation oder HPI, basierend auf dem spezifischen Antikörpercocktail, der in der Demonstration verwendet wurde, GR one positive CD 11 B-positive myeloische Zellen und NK 1.1 positive natürliche Killerzellen drangen innerhalb von 48 Stunden nach der Tumortransplantation spezifisch in die Mikroumgebung des GAL 1-defizienten Tumors ein. Die Gesamtzahl der Gliome, die myeloische Zellen infiltrieren, überwog jedoch bei weitem die der natürlichen Killerzellen. Sobald die Methodik gemeistert ist, wird sie vom Brainharvesting bis zum Flow skizziert.

Die zytometrische Analyse kann in etwa sechs Stunden von einem Experimentator durchgeführt werden. Es ist zwingend erforderlich, dass das gesamte Volumen jeder PBMC-Probe mit dem Durchflusszytometer analysiert wird, um einen fairen Vergleich der Gesamtzahl der Gliome zu erhalten, die in pbmc-komplementäre Experimente infiltrieren. Eine solche immunhistochemische Analyse kann durchgeführt werden, um räumliche Daten über die Immunzellinfiltrate zu erhalten und um die Messung der Gesamttumorgröße und der Mikroanatomie zu Zeitpunkten zu ermöglichen, die denen entsprechen, die mit diesem Verfahren bewertet wurden.

Diese Technik kann auf die Untersuchung verschiedener Hirntumormodelle angewendet werden, einschließlich solcher, die de novo unter Verwendung von Onkogenen, die für Plasma-DNA kodieren, ohne signifikante Änderungen am Gesamtverfahren erzeugt wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gliomzellsuspensionen für die Stereotaktik und das Transplantat in ein Mäusegehirn vorbereitet, wie man einen starken Tumor und gehirntragende Mäuse überträgt und wie man Cyto metrisch isoliert und fließt, wie man Gliome analysiert, die mononukleäre Zellen des peripheren Blutes infiltrieren.