Name: Initiieren Differenzierung in Immortalisierte multipotenten Vorläuferzellen Otic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Erfahren Sie die Differenzierung von iMOP-Zellen in Innenohrzelltypen für die auditive Regeneration. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen zur Entwicklung von Cochlea-Haarzellen und auditorischen Neuronen.

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Die Arbeit wurde teilweise durch den Duncan and Nancy MacMillan Faculty Development Chair Endowment Fund (K.Y.K.), Busch Biomedical Research Grant (K.Y.K.) und den Rutgers Faculty Development Grant (K.Y.K.) unterstützt.

1. Die Aufrechterhaltung der Selbsterneuerung in IMOP Cells <ol><li> Bereiten iMOP Kulturmedien: DMEM / F12, 1X B27 ergänzen, 25 ug / ml Carbenecillin und 20 ng / ml bFGF. Machen Sie 50 ml iMOP Kulturmedien unter Verwendung von sterilen Reagenzien. Warm up 49 ml DMEM / F12 in einem 50 ml konischen in einem 37 ° C Wasserbad. <ol><li> Auftau 50X B27 Supplement und filtersterilisiert 100 mg / ml Carbenecillin Aliquots für 5 min in einem 37 ° C Wasserbad. Auftauen 100 ug / ml bFGF Aliquot bei RT. 1 ml 50X B27, 10 ul 100 ug / ml bFGF und 12,5 &amp; mgr; l von 100 mg / ml Carbenecillin in DMEM / F12. </li></ol></li><li> Verwenden Sie 3 ml Medium in einem 60 mm-Gewebekulturschale zur Züchtung iMOP Zellen. In frischem Medium, um Kulturen jeden zweiten Tag durch eine Verdoppelung des Volumens der Medien. Sicherzustellen, dass die Konzentration von bFGF nicht unter 5 ng / ml abfiel. <ol><li> Kultur iMOP Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 Passage-Zellen nach 5-7 Tagen in Kultur, wie in den unten aufgeführten Schritte. Übertragungs Kultur in einen 15ml konischen Verwendung einer 10 ml Pipettenspitze. </li></ol></li><li> Stellen 1 mM EDTA in HBSS durch Verdünnen von 0,1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 in 50 ml HBSS. Pre-warmen 1 mM EDTA in HBSS in einem 37 ° C Wasserbad gestellt. </li><li> Ernten der Zellen durch Schwerkraftsedimentation oder durch Zentrifugieren bei 200 xg für 5 min. bei RT. Für Schwerkraftsedimentation, legen Sie die 15-ml-Erlen mit den Kulturen in der 37 ° C Inkubator für 5 bis 10 min. Nach dieser Zeit wird, beobachten die otospheres sammeln sich am Boden des konischen 15 ml. HINWEIS: Übermäßiger Zentrifugalkraft können Zellschäden verursachen. </li><li> Saugen Sie vorsichtig den verbrauchten Medien mit einer 2 ml Ansaugpipette ohne das Zellpellet zu stören. 0,5 ml vorgewärmtes, 1 mM EDTA HBSS Lösung Pellet Zelle. Mit Hilfe eines P1000 Pipette vorsichtig pipettieren nach oben und unten 2 - 3-mal. Zeigen konischen bei 37 ° C und Inkubation für &lt;5 min zur Dissoziation in Einzelzellen zu erleichtern. </li><li> Vorsichtig schwenken die Zell-Lösung zu bestimmen, ob otospheres dissoziiert sind. Wenn keine otoSphären zu sedimentieren zu dem Boden des konischen werden die Zellen dissoziiert. Die Inkubationszeit kann variieren. HINWEIS: Längerer Inkubation mit EDTA in übermäßigen Zelltod führen. </li><li> Entfernen Zellen von 37 ° C, 2 ml Medium zu neutralisieren und zu verdünnen das EDTA. Sammeln der Zellen durch Zentrifugation bei 200 xg für 5 Minuten bei RT. Saugen Sie verdünnten EDTA unter Verwendung einer 2 ml Ansaugpipette und 5 ml 1X PBS, um die Zellen zu waschen. </li><li> Spin Zellen nach unten bei 200 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur und saugen aus 1X PBS mit einem 2 ml Ansaugpipette. Resuspendieren der Zellen unter Verwendung eines P1000 Pipetten in 0,5 ml iMOP Kulturmedium durch sanftes Auf- und Abpipettieren 2-3 mal. </li><li> Graf Zellen unter Verwendung eines mikrofluidischen Partikelzähler mit den entsprechenden Kassetten 28. Ein konfluenten Platte iMOP Zellen ~ 6 X10 enthalten 6 Zellen. Zellen verdünnt 1: 100 in Medium und füge 75 ul der Zell-Lösung in die Kassette für die Zählung. Platte 1 x 10 6 Zellen in einer 6-cm-Schale in iMOP culture Medien (~ 1: 10 Verdünnung). Passage iMOPs alle 5 - 7 Tage die. Hinweis: Zellen, die große otospheres bilden oder sich an der Unterseite der Gewebekulturschale wird unterscheiden. Die Zellen werden auch sterben, wenn die Kulturen über konfluent. </li></ol> 2. Einfrieren und Auftauen IMOP Cells <ol><li> Vorbereitung synthetischen Einfriermedium durch Auftauen und Äquilibrieren der Lösung auf 4 ° C vor dem Gefrierzellen. </li><li> Sammeln Sie Zellen aus einer konfluenten 6 cm Schüssel iMOP Zellen. Verwenden Sie eine 10 ml Pipette und Übertragungszellen (~ 6 - 8 x 10 6 Zellen) in einen 15-ml-Erlen. </li><li> Ernten der Zellen durch Schwerkraftsedimentation oder durch Zentrifugieren bei 200 xg für 5 Minuten bei RT. Wenn die otospheres sind klein, werden Zellen, die nicht durch die Schwerkraft Sedimentation absetzen. Optional: Zählen von Zellen mit Schritt 1,9 bis Gesamtzellzahl zu bestimmen. </li><li> Saugen Sie verbrauchte Medium mit einem 2 ml Ansaugpipette während die losen Zellpellet hinter. </li><li> In 0,25 ml synthetischen Einfrieren Medien ce resuspendierenlls in einer Dichte von ~ 5 × 10 5 bis 3 × 10 6 Zellen / ml. Gently Pipette Zellen mit einem P1000 Pipette. Übertragen Sie die Zellsuspension in Kryoröhrchen mit einem P1000 Pipette mit 1 ml gefilterte Spitze. </li><li> Legen Sie die Fläschchen in einem Alkohol frei Gefrierbehälter und setzen Sie den Gefrierbehälter bei -80 ° C, die Temperatur 1 ° C pro Minute zu verringern, bis die Temperatur erreicht 80 ° C. </li><li> Für langfristige Lagerung von Zellen, übertragen die Vials in die Dampfphase aus einem Flüssigstickstofflagertank. Auftauen Zellen für die Kultur, ins Gleichgewicht Kryo-Fläschchen mit gefrorenen Zellen bei -80 ° C. </li><li> Pre-warmen iMOP Kulturmedien in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Auftauen gefrorenen Fläschchen schnell von Wirbeln den Boden des Fläschchens in einem 37 ° C Wasserbad. 1 ml der vorgewärmten iMOP Kulturmedien, um aufgetauten Zellen, sobald die letzten Eiskristall verschwindet. Übertragungszellen in einem 15 ml konischen und fügen zusätzliche 4 ml iMOP Nährmedien </li><li> Drehen Sie das 15 ml Conische für 5 min. bei 200 xg und saugen die verbrauchte Medien. Resuspendieren der Zellen in 2 ml iMOP Kulturmedien und Zellen in einer Platte 6 cm Schale. Kulturen bei 37 ° C mit 5% CO 2 für die Expansion. </li></ol> 3. Differenzierung IMOP Cells in Sinnesepithelien <ol><li> Bereiten Sie 50 ml iMOP Sinnesepithelien Differenzierungsmedium: DMEM / F12, 1X B27 ergänzen, 25 ug / ml Carbenecillin. Machen Sie 50 ml iMOP Sinnesepithelien Differenzierung Medien. Warm up 49 ml DMEM / F12 in einem 50 ml konischen in einem 37 ° C Wasserbad. Auftau 50X B27 Supplement und 100 mg / ml Carbenecillin Aliquots für 5 min. in einem 37 ° C Wasserbad. 1 ml 50X B27 und 12,5 &amp; mgr; l von 100 mg / ml Carbenecillin in DMEM / F12. </li><li> Zu ernten, zu distanzieren, resuspendieren und zählen Zellen Wiederholen Sie die Schritte 1,4-1,9 </li><li> Platte 1 x 10 6 Zellen in einer 6-cm-Schale an Tag -3 Verwendung iMOP Kulturmedien. Am Tag 0 Transfer Kulturen mit einer 10 ml Pipette in ein 15-ml-Erlen. Sammeln Sie die otoKugeln durch die Schwerkraft der Sedimentation, wie in Schritt 1.6 angegeben. Aspirat aus verbrauchten Medien unter Verwendung einer 2 ml Ansaugpipette und lassen die otospheres auf der Unterseite des konischen. </li><li> Sanft fügen in 2 ml Sinnesepithelien Differenzierung Medien. Transfer otospheres zu einer 6 cm-Schale mit einer großen Bohrung 10 ml Pipette. HINWEIS: Mechanische Scher vor rauen Pipettieren können Zellen aus den otospheres distanzieren. </li><li> 2 ml frischem sensorischen Epitheldifferenzierung Medien Kulturen jeden zweiten Tag. Falls erforderlich, können die Zellen durch Schwerkraftsedimentation und Medien ersetzt gesammelt werden. </li><li> Sammeln otospheres am Tag 10 durch die Übertragung von einer 15-ml-Erlen und es den otospheres sedimentieren, wie in Schritt angegeben 1.6.Aspirate die verbrauchten Medien unter Verwendung einer 2 ml-Pipette und verlassen Ansaugen der otospheres ungestört. </li><li> Fix otospheres durch Inkubation in 4% Formaldehyd in 1 × PBS für 15 min bei RT. Entfernen Formaldehydlösung, waschen otospheres mit Waschpuffer (1X PBS, das 0,1% Triton X-100) vor der Inkubation in Blockierungspuffer (1 × PBS, das 10% normales Ziegenserum und 0,1% Triton X-100) für 1 Stunde. <ol><li> Ersetzen Puffer und Inkubation Proben in Blocking-Puffer mit verdünnter Antikörper. Inkubieren bei 4 ° C. Wasch Proben mit 1X PBS, enthaltend 0,1% Triton X-100 unterliegt die otosphere der Immunofärbung 27. Transfer otospheres in 1X PBS und Ort otospheres in die Montagetechnik auf einen Glasobjektträger mit einem P1000 Pipette. Setzen Sie ein Deckglas über die Probe und lassen Sie die Montage Medien bei 4 ° C zu trocknen. </li></ol></li><li> Erwerben Epifluoreszenz Bildern unter Verwendung eines Umkehrmikroskops Setup mit einem 16-Bit-CCD-Kamera und entweder 20X 0,75 Luft oder 40X 1,3 NA -Ölimmersionsobjektiv ausgestattet. Sammeln Fluoreszenz von verschiedenen Farbkanälen unter Verwendung der genannten (Anregung und Emission) Wellenlängen: blau (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), Grün (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), rot (562 ± 20 nm / und 625 ± 20 nm) und Infrarot (628 ± 20 nm / und 692 ± 20nm). </li></ol> 4. Assaying EdU Incorporation <ol><li> Am Tag -3, Platte 1 x 10 6 iMOP Zellen in einer 6 cm Schale. Drei Tage später, am Tag 0, ernte, distanzieren, resuspendieren und zählen Sie die Zellen durch Wiederholen der Schritte von 1,4 bis 1,9. </li><li> Platte 2,5 x 10 5 Zellen in iMOP Nährmedien und 5 x10 5 Zellen in Sinnesepithelien Differenzierungsmedium in verschiedenen Vertiefungen einer 6 Well-Platte. </li><li> Bestimmen den Prozentsatz an Zellen in S-Phase durch EdU Einarbeitung am Tag 3 durch Verwendung eines EdU Inkorporationstest <ol><li> Hinzufügen EdU Lager direkt an die iMOP Kulturen bis zu einer Endkonzentration von 1 uM EdU in dem Kulturmedium zu erhalten. </li><li> Inkubieren EdU in iMOP Kulturen für 2 Stunden und bei 37 ° C mit 5% CO 2. Harvest, distanzieren und sammeln Zellen wiederholen Sie die Schritte 1,4-1,9. Hinzufügen in 4% Formaldehyd in 1 × PBS für 15 min. bei RT, um Zellen zu reparieren. Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 200 xg für 5 Minuten bei RT. Entfernen Formaldehydlösung und properly entsorgen. </li><li> Etikett Kerne von Zellen mit Hoechst und einge EdU mit grünem Fluoreszenzfarbstoff-Azid gemß dem Protokoll des Herstellers. HINWEIS: Alle Waschungen werden mit 1X PBS, 3% BSA und 0,1% Tween 20. Wasche die Zellen mit 1 × PBS zweimal durchgeführt. </li><li> Berg-Zellen auf einem Objektträger mit Antifade-Reagenz und legen Sie eine 1,5 Abdeckglas über die Probe. Erwerben Fluoreszenzbilder der markierten Zellen mit Hilfe eines Epifluoreszenz-Mikroskopie. </li></ol></li></ol> 5. Differenzierung IMOP abgeleiteten Neuronen <ol><li> Machen Sie 50 ml der neuronalen Differenzierung Medien: Neurobasal Medien, 1X B27 ergänzen, 2 mM L-Glutamin. Thaw Flasche 50X B27 und 200 mM L-Glutamin in 37 ° C Wasserbad für 5 min. 1ml 50X B27 und 0,5 ml 200 mM L-Glutamin 48,5 ml Neurobasal Medium. </li><li> Coat Deckglas, indem 12 mm rund 1,5 Deckgläser in einer sterilen 10 cm Platte und fügen Sie 70% EtOH an der Platte, die sterilisiert und reinigen Sie die Deckgläser. </li><li> Rühren Sie vorsichtig die Buchtrslips um sicherzustellen, dass sie in Ethanol abgedeckt sind. Lassen Sie die Platte für 10 Minuten bei RT. Mit steriler 1X PBS spülen Sie die Deckgläschen 3 mal zum Auswaschen der verbleibenden Ethanol. Spülen Sie das Deckglas einmal mit sterilem H 2 0 zu waschen restlichen 1X PBS. </li><li> Saugen Sie das H 2 0 mit einem 2 ml Ansaugpipette und lassen Sie die Deckgläser trocken. Setzen Sie die Deckgläser mit UV-Licht in der Gewebekultur Haube für 15 min. Speicher Deckgläschen in einer sterilen Umgebung, wenn sie nicht sofort verwendet. </li><li> Legen Sie eine 12 mm runde Deckglas in jede Vertiefung einer 24-Well-Schale. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Deckgläser liegen flach auf dem Boden des Bohrlochs. </li><li> Tau-2 mg / ml Poly-D-Lysin-Stammlösung bei RT gelöst und auf eine 10 ug / ml Poly-D-Lysin-Konzentration in 1X PBS. Zugabe von 0,25 ml von 10 ug / ml Poly-D-Lysin an die Vertiefungen. Lassen Sie die Platte in der 37 ° C-Inkubator für 1 Stunde. </li><li> 3-mal mit steriler 1X PBS Waschen Sie die Vertiefungen. Tau-10 mg / ml Laminin Stammlösung bei RT und 10 &amp; mgr; g / m verdünntenl in 1 × PBS. Zugabe von 0,25 ml von 10 ug / ml Laminin Arbeitslösung in eine einzige Vertiefung einer 24-Well-Platte mit mehreren. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C Inkubator. Saugen Sie die Laminin-Lösung unter Verwendung eines 2 ml Ansaugpipette. </li><li> 3-mal mit 1X PBS waschen des Deckglases durch Zugabe von in 1 ml 1X PBS mit einer P1000-Pipette und Entfernen des 1X PBS durch Absaugen mit einer 2 ml Ansaugpipette. Lassen 1X PBS von den letzten Wasch im Brunnen, bis die Zellen sind bereit, überzogen werden. Einzuleiten neuronale Differenzierung durch Ernten, Dissoziieren und Zählen der Zellen in den Schritten 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 Zellen in einer 6-cm-Schale an Tag -3. </li><li> Am Tag 0, ernte, distanzieren und zählen Zellen durch Wiederholen von 1,4 bis 1,9. Seed 1 x 10 5 bis 1,5 x 10 5 iMOP Zellen in 0,5 ml vorgewärmten neuronalen Differenzierung Medium pro Well in einer 24 Multi-Well-Schale. Saugen Sie und fügen vorgewärmten neuronalen Differenzierung Medien Kulturen jeden zweiten Tag. </li><li> Fix iMOP abgeleiteten Neuronen in 4% Formaldehyd für 15 min. eint RT an Tag 7. Entfernen Formaldehydlösung, Waschen iMOP abgeleiteten Neuronen mit Waschpuffer (1 × PBS, enthaltend 0,1% Triton X-100) vor der Inkubation in Blockierungspuffer (1 × PBS, das 10% normales Ziegenserum und 0,1% Triton X-100) für 1 Stunde. <ol><li> Ersetzen Puffer und Inkubation Proben in Blocking-Puffer mit verdünnter Antikörper. Inkubieren bei 4 ° C. Wasch Proben mit 1X PBS, enthaltend 0,1% Triton X-100 unterworfen Zellen an Immun 27. Vor der Platzierung auf Montagemedien Waschen Sie die Deckgläser mit 1X PBS. Lassen Sie die Montage Medien bei 4 ° C vor dem Erwerb Epifluoreszenz Bilder wie in Schritt 3.8 aufgeführten trocknen. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Überwachung IMOP Kulturen Ein Protokoll zum Aufrechterhalten der Selbsterneuerung und die Förderung der Differenzierung einer neuartigen iMOP Zellinie beschrieben und zusätzliche Plattierung Formate enthalten sind (Tabelle 1). Mehrere wichtige Schritte, die mit Routine Expansion und Differenzierung von Zellen iMOP helfen, werden zur Kenntnis genommen. Ähnlich wie pluripotente Stammzellkulturen, iMOP Zellen haben theoretisch eine unbegrenzte Lebensdauer. Um s...

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One of the authors' names was corrected from:
Jadali Azadeh
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Azadeh Jadali

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Erratum: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Die Organe des Innenohrs, der Cochlea, des Utrikels, des Saccule und der drei Bogengänge vermitteln die Fähigkeit zu hören und zu balancieren. In der Cochlea wandeln Haarzellen Geräusche in elektrische Signale um, die an die Neuronen der Spiralganglien (SGN) weitergeleitet werden. Die SGNs feuern Aktionspotentiale ab, um neuronale Signale durch den auditorischen Schaltkreis zu verbreiten. Genetische Mutationen, ototoxische Medikamente und die Exposition gegenüber lauten Geräuschen tragen zum Absterben von Haarzellen und SGN bei, die zu Hörverlustführen 1-4. Einmal verloren, werden diese Zellen nicht mehr ersetzt. Die Verwendung von iPSC und ESC zur Erzeugung von naszierenden Haarzellen oder SGNs ist vielversprechend für Therapien zum Ersatz von Innenohrzellen5-8. Eine Flut von Fortschritten hat gezeigt, dass sich pluripotente Stammzellen und aus dem Innenohr stammende Vorläuferzellen in verschiedenen Reifestadien zu Haarzellen und SGNs differenzieren können. Embryonale Stammzellen (ESC) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) können verwendet werden, um funktionelle Haarzellen und SGNs9-11 zu erzeugen. Es wurde auch gezeigt, dass Stammzellen und Vorläuferzellen, die aus dem Innenohr von Säugetieren stammen, Haarzellen und Neuronen mit Eigenschaften ihrer zellulären In-vivo-Gegenstücke bilden 12-16. 
Die Verwendung von iPSC- oder ESC-abgeleiteten otischen Vorläuferzellen als Ersatz für verlorene Haarzellen und SGNs erfordert eine effiziente Differenzierung. Eine unsachgemäße Differenzierung oder fortgesetzte Proliferation von transplantierten Stammvorläuferzellen im Innenohr kann die Innenohrfunktion verschlimmern und ein tumorigenes Risiko darstellen, wie z. B. die Bildung von Teratomen im Innenohr17. Es besteht ein klarer Bedarf an der Entwicklung von Kulturbedingungen und dem Verständnis der Differenzierung otischer Vorläuferzellen. Eine Strategie bei der Entwicklung dieser Methoden besteht darin, die Entscheidungen über das Zellschicksal, die von neurosensorischen Vorläuferzellen während der Entwicklung des Innenohrs getroffen werden, zu rekapitulieren. Protokolle, die die Proliferation verhindern und otische Vorläuferzellen in Haarzellen oder SGNs leiten, tragen dazu bei, die Sicherheit und Wirksamkeit von Ersatztherapien zu verbessern. 
Während der Entwicklung beginnt das Innenohr mit der Verdickung des Oberflächenektoderms in einer begrenzten Region zwischen den Rhomboeren 5 und 6 und wird zur otischen Plakode. Wenn die otische Plakode einstülpt, um einen Oticusbecher zu bilden, entsteht aus einer Ansammlung von Zellen im vorderen Bereich des Oticusbechers die neural-sensorisch-kompetente Domäne (NSD), die Vorläufer von Haarzellen und Neuronen des Innenohrs enthält18. Schicksalskartierungsstudien an Mäusen, Hühnern und Zebrafischen, die sich im Innenohr entwickeln, deuten auf mehrere Populationen neurosensorischer Vorläuferzellen hin, aus denen die sensorischen Haarzellen, die umgebenden Stützzellen und die otischen Neuronen hervorgehen19-22. Der Transkriptionsfaktor der Gruppe mit hoher Mobilität, Sox2, wurde mit der Spezifikation von sensorischen Zellen in Verbindung gebracht und als Marker für Innenohr-Vorläuferzellen verwendet23,24. Hypomorphe Mutationen, die die Sox2-Expression im Innenohr verringern, führen zum Verlust der Haarzellen, der Stützzellen und der SGNs in der Cochlea25,26. 
Um otische Vorläuferzellen zu untersuchen, die sich in Zellschicksalsentscheidungen befinden, wurde zuvor eine durch das Schicksal eingeschränkte immortalisierte multipotente otische Vorläuferzellen (iMOP) von Sox2-exprimierenden Cochlea-Vorläuferzellen etabliert. iMOP-Zellen wurden ursprünglich aus embryonalen E12.5-13.5 Cochlea gewonnen und mit einem c-Myc-Retrovirus infiziert27. iMOP-Zellen können sich kontinuierlich als koloniebildende Zellen, die als Otosphären bekannt sind, vermehren und haben die Fähigkeit, sich in Haarzellen, Stützzellen und SGNs zu differenzieren27. Das Verständnis der Fähigkeit von iMOP-Zellen, sich in unterschiedliche otische Linien zu differenzieren, ermöglicht die Anwendung dieser Erkenntnisse zur effizienten Erzeugung von iPSC- oder ESC-abgeleiteten Haarzellen und SGNs. Effiziente Differenzierungsprotokolle werden neue Wege für Zellersatztherapien bei Innenohrerkrankungen eröffnen, die gegenüber konventionellen Behandlungen widerspenstig sind. Ein entscheidendes Problem bei der Erzeugung von otischen Zellen durch In-vitro-Zellkultur besteht darin, Differenzierungsmarker zu haben, mit deren Hilfe festgestellt werden kann, ob sich Zellen differenzieren. Cdkn1b (p27KIP) wurde ausgiebig als früher Marker für die Differenzierung im sich entwickelnden Innenohr verwendet, jedoch wurde die Expression von Cdkn1b in iMOP-Zellen und wie sie mit der Differenzierung korreliert, nicht untersucht. In dieser Studie werden die aktuellen Kulturbedingungen und die Korrelation der Cdkn1b-Expression mit anderen Markern der iMOP-Differenzierung beschrieben.

<table><tbody><tr><td>CoolCell LX Alkoholfreie Zellgefrierbehälter</td><td>BioCision</td><td>BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>Kryofläschchen (2 ml) &nbsp;</td><td>Corning</td><td>430654</td><td></td></tr><tr><td>1,5 Dicke Glasdeckglas (rund 12 mm)</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement (50X) Serum Free</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Gelagert als 1 ml Aliquot</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM) &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Gelagert als 5 ml Aliquots</td></tr><tr><td>Natural Mouse Laminin</td><td>Life Technologies</td><td>23017-015</td><td>Gelagert als 1 mg/ml Aliquots</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>Synth-A-Freeze Kryokonservierungsmedium</td><td>Life Technologies</td><td>A12542-01</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Eindeckmittel</td><td>Life Technologies</td><td>47743-736</td><td>Gelagert als 10 mg/ml 100 & Mikro; l aliquots</td></tr><tr><td>Moxi Z Mini Automatisierter Zellzähler</td><td>Orflo&nbsp;</td><td>MXZ001</td><td></td></tr><tr><td>Moxi Z Kassette Typ S</td><td>Orflo&nbsp;</td><td>MXC002</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinanter Maus-Fibroblasten-Wachstumsfaktor, basisch (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td>Resuspendiert in 0,1 % BSA in H20 und gelagert als 20 mg/ml Aliquots</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P7886</td><td>Resuspendiert in 1X PBS und gelagert als 10 mg/ml 100 & Mikro; l aliquot</td></tr><tr><td>Carbenicillin, Dinatriumsalz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2648-1</td><td>Resuspendiert in 10 mM Hepes pH 7,4 und gelagert als 100 mg/ml Aliquote</td></tr><tr><td>5 ml Pipette einzeln verpackt Taschenbuch (200/Karton)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipette einzeln verpackt Taschenbuch (200/Karton)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>Mit Gewebekulturen behandelte Biolite 24-Well-Platte</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Mit Gewebekulturen behandelte Biolite 6-Well-Platte</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mit Gewebekulturen behandelte 6 cm Schale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130181&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore Millex Sterilspritze PVDF Filter Porengröße: 0,22 &mu; m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>TipOne Filterpipettenspitzen 0,1 - 10 &mu; l längliche Filterspitze</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne Filterpipettenspitzen 1 - 20 &mu; l Filterspitze</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne Filterpipettenspitzen 1 - 200 &mu; l&nbsp; Filterspitze</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne Filterpipettenspitzen 101 - 1000 &mu; l Filterspitze</td><td>USA Scientific</td><td>1126-7810</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konische Röhrchen steril 20 Beutel à 25 Röhrchen (500 Röhrchen)</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0511</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konische Röhrchen steril 20 Beutel à 25 Röhrchen (500 Röhrchen)</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td></td></tr></tbody></table>

initiieren differenzierung in immortalisierte multipotenten vorläuferzellen otic

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Die Verwendung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) oder embryonalen Stammzellen (ESC) für Zellersatztherapien ist vielversprechend. Mehrere Einschränkungen, darunter geringe Erträge und heterogene Populationen differenzierter Zellen, behindern den Fortschritt von Stammzelltherapien. Es wurde eine verbleibsbeschränkte immortalisierte multipotente otische Vorläuferzelllinie (iMOP) generiert, um die effiziente Differenzierung einer großen Anzahl von funktionellen Haarzellen und Spiralganglienneuronen (SGN) für Innenohr-Zellersatztherapien zu ermöglichen. Ausgehend von dissoziierten Kulturen einzelner iMOP-Zellen wurden Protokolle beschrieben, die den Austritt aus dem Zellzyklus und die Differenzierung durch den Entzug des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF) fördern. Ein signifikanter Rückgang der proliferierenden Zellen nach bFGF-Entzug wurde mit einem EdU-Zellproliferationsassay bestätigt. Parallel zu einer Abnahme der Proliferation führte die erfolgreiche Differenzierung zur Expression molekularer Marker und morphologischer Veränderungen. Die Immunfärbung von Cdkn1b (p27KIP) und Cdh1 (E-Cadherin) in iMOP-abgeleiteten Otosphären wurde als Indikator für die Differenzierung in sensorische Epithelien des Innenohrs verwendet, während die Immunfärbung von Cdkn1b und Tubb3 (neuronales β-Tubulin) zur Identifizierung von iMOP-abgeleiteten Neuronen verwendet wurde. Die Verwendung von iMOP-Zellen ist ein wichtiges Werkzeug zum Verständnis von Entscheidungen über das Zellschicksal, die von neurosensorischen Vorläuferzellen des Innenohrs getroffen werden, und wird dazu beitragen, Protokolle für die Erzeugung einer großen Anzahl von iPSC- oder ESC-abgeleiteten Haarzellen und SGNs zu entwickeln. Diese Methoden werden die Bemühungen um die Generierung von otischen Zellen für Ersatztherapien beschleunigen.

bFGF Widerrufs Verringert Proliferation in IMOP Cells Um die proliferative Kapazität von iMOP Zellen zu verringern und zu initiieren Differenzierung iMOP Zellen wurde bFGF aus den Kulturen entnommen. Um zu bestätigen, dass die Wachstumsfaktorentzug verringert Proliferation wurde EdU Einarbeitung als Proliferationstest verwendet. Der Prozentsatz von Zellen, die aus EdU otospheres mit iMOP Kulturmedium (enthalte...

Die aktuellen Protokolle zur Erhaltung immortalisierter multipotenter otischer Vorläuferzellen (iMOP) und der otischen Differenzierung werden beschrieben. Kulturbedingungen und molekulare Marker, die auf eine Differenzierung in sensorische Epithelien und Spiralganglienneuronen (SGN) hinweisen, werden hervorgehoben.

Initiieren Differenzierung in Immortalisierte multipotenten Vorläuferzellen Otic

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, immortalisierte multipotente otische Vorläuferzellen in Innenohrzelltypen zu differenzieren. Diese Methode kann uns also helfen, Schlüsselfragen der auditiven Regeneration zu beantworten, z. B. wie otische Vorläuferzellen zu Cochlea-Haarzellen oder auditorischen Neuronen werden können. Wichtig ist, dass diese Technik ein in-vitro-zelluläres System bietet, das parallel zu in-vivo-Säugetiermodellsystemen verwendet werden kann.Azadeh Jadali, eine Postdoktorandin in meinem Labor, sowie Zhichao Song und Alejandra Laureano, zwei Doktorandinnen im Labor, werden das Verfahren heute demonstrieren. Nach der Zubereitung des Nährmediums, wie im Textprotokoll beschrieben, verwenden Sie drei Milliliter dieser Flüssigkeit, um eins mal zehn auf die sechste immortalisierte multipotente Vorläuferzelle oder IMOP-Zellen in eine 60-Millimeter-Gewebekulturschale zu plättieren. Inkubieren Sie die Zellen fünf bis sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid.Verdoppeln Sie jeden zweiten Tag das Volumen der Flüssigkeit in der Kultur, indem Sie frisches Medium hinzufügen. Um die Zellen zu passieren, übertragen Sie sie zunächst aus der Kulturschale in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Und dann stellen Sie das Röhrchen fünf bis zehn Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Während dieser Zeit ist damit zu rechnen, dass sich koloniebildende Otosphären am Boden des Konischen durch Schwerkraftsedimentation ansammeln. Saugen Sie anschließend den Überstand an und achten Sie darauf, die Palette nicht zu stören. Resuspendieren Sie die Otosphären, indem Sie 0,5 Milliliter zuvor vorbereitete, vorgewärmte, ein Millimolar EDTA-verstärkte ausgewogene Salzlösung oder HBSS hinzufügen und dann zwei- bis dreimal auf und ab pipettieren.Um die Dissoziation der Otosphären in einzelne Zellen zu erleichtern, stellen Sie den Konus in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Schwenken Sie die Lösung regelmäßig und wenn keine Otosphären als Sediment am Boden des Röhrchens beobachtet werden, bringen Sie es auf Raumtemperatur. Fahren Sie fort, den Zellen zwei Milliliter Kulturmedium hinzuzufügen, um das EDTA zu neutralisieren.Und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 200 g. Aspirieren Sie dann die verdünnte EDTA-Lösung und waschen Sie die Zellen in fünf Millilitern 1x PBS. Nachdem Sie die Zellen mit den gleichen Einstellungen heruntergeschleudert haben, aspirieren Sie das 1x PBS.Geben Sie anschließend 0,5 Milliliter Nährmedium in den Konus. Und halten Sie die Zellenpalette erneut an. Zum Zählen verdünnen Sie die IMOP-Zellen eins bis hundert in Kulturmedium.Geben Sie dann 75 Mikroliter dieser Lösung in eine Kassette, die in einem mikrofluidischen Partikelzähler positioniert ist, und bestimmen Sie die Zellzahl. Anschließend werden die sechsten IMOP-Zellen wie zuvor beschrieben eins mal zehn in eine 60-Millimeter-Gewebekulturschale plättiert und diese Passageprozedur alle fünf bis sieben Tage wiederholt. Drei Tage nach dem Plattieren verwenden Sie die Schwerkraftsedimentation, um Otosphären zu sammeln, wie zuvor gezeigt.Fahren Sie mit der Aspiration des Überstands fort. Und resuspendieren Sie die Zellen sanft in zwei Millilitern sensorischem epithelialem Differenzierungsmedium. Dann überträgst du die Otosphären mit einer zehn Milliliter großen Pipette in eine neue 60-Millimeter-Schale.Differenzieren Sie die Otosphären zehn Tage lang. Jeden zweiten Tag werden zwei Milliliter frisches Differenzierungsmedium in die Kultur gegeben. Anschließend werden die Otosphären durch Schwerkraftsedimentation erneut geerntet.Und saugen Sie das verbrauchte Medium an. Als nächstes fixieren Sie die Otosphären in vier Prozent Paraformaldehyd in 1x PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann die Formaldehydlösung und waschen Sie die Zellen in 1x PBS mit 0,1 Prozent Triton x100.Fahren Sie fort, indem Sie die Otosphären in 1x PBS blockieren, ergänzt mit zehn Prozent Ziegenserum und 0,1 Prozent Triton x100. Ersetzen Sie nach einer Stunde den Blockierungspuffer durch einen Puffer, der die entsprechende Verdünnung von Cdkn1b- oder CDH1-Antikörpern enthält. Dann inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius in Primärantikörpern.Und am nächsten Tag setzen Sie die Immunfärbung mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern, Phalloidin und Hoechst, fort, wie an anderer Stelle beschrieben. Zur Vorbereitung der Bildgebung legen Sie das Eindeckmedium auf einen Objektträger. Und dann führen Sie die gefärbten Otosphären in das Medium ein.Legen Sie anschließend einen Deckzettel auf die Probe. Nachdem Sie das Eindeckmedium über Nacht bei vier Grad Celsius trocknen gelassen haben, legen Sie den Objektträger auf den Tisch eines inversen Mikroskops, das mit einer 16-Bit-CCD-Kamera ausgestattet ist. Mit dem 20x 0,75 Luftobjektiv können Sie Epifluoreszenzbilder aufnehmen, indem Sie Daten aus den blauen, grünen, roten und infraroten Kanälen sammeln.Reinigen Sie zunächst runde Glasdeckgläser, indem Sie sie in eine sterile 100-Millimeter-Platte legen und in 70 Prozent Ethanol tauchen. Rühren Sie die Deckgläser vorsichtig um, um sicherzustellen, dass sie abgedeckt sind, und lassen Sie das Gericht zehn Minuten lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie anschließend die Deckgläser dreimal in sterilem 1x PBS und dann einmal mit sterilem Wasser aus.Lassen Sie dann die Eindeckeinlagen trocknen, indem Sie sie 15 Minuten lang in einer Gewebekulturhaube UV-Licht aussetzen. Legen Sie zur sofortigen Verwendung einen sterilen Deckglas in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Und schütteln Sie die Platte vorsichtig, um sicherzustellen, dass alle Einbandfolien flach aufliegen.Beschichten Sie dann die Deckgläser, indem Sie 0,25 Milliliter 1x PBS mit 10 Mikrogamen pro Milliliter Poly-D-Lysin in jede Vertiefung geben. Nachdem die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert hat, entfernen Sie die Poly-D-Lysinlösung und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit sterilem 1x PBS. Sobald die Flüssigkeit aus der letzten Wäsche abgesaugt wurde, geben Sie 0,25 Milliliter 1x PBS mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Laminin in jede der 24 Vertiefungen.Nachdem Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, aspirieren Sie die Laminin-Lösung, waschen Sie dann jede Vertiefung dreimal mit einem Milliliter 1x PBS, aber lassen Sie das PBS von der letzten Wäsche in den Vertiefungen, bis die Zellen bereit sind, plattiert zu werden. Um mit der neuronalen Differenzierung zu beginnen, zählen Sie die Zellen aus dissoziierten Otosphären, wie zuvor beschrieben. Und dann resuspendieren Sie sie in vorgewärmtem neuronalem Differenzierungsmedium.Fahren Sie fort, indem Sie zwischen einem und einem Punkt fünf mal zehn bis zur fünften IMOP-Zellen in jede Vertiefung der Platte mit den beschichteten Deckgläsern säen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid. Das neuronale Differenzierungsmedium wird alle zwei Tage ersetzt.Nach sieben Tagen aspirieren Sie das Medium und fixieren die Zellen, die an den Deckgläsern befestigt werden sollen, indem Sie jeweils vier Prozent Formaldehyd hinzufügen. Und lassen Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Entfernen Sie dann das Formaldehyd und waschen Sie die Zellen einmal in 1x PBS mit 0,1 Prozent Triton x100.Entfernen Sie anschließend den Waschpuffer. Und fügen Sie jedem Well einen Blockierungspuffer hinzu, der aus 1x PBS besteht, das zehn Prozent normales Ziegenserum und 0,1 Prozent Triton x100 enthält. Lassen Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur.Entfernen Sie dann die Flüssigkeit und ersetzen Sie sie durch einen Blockierungspuffer, der die entsprechende Verdünnung von Cdkn1b- oder Tubb3-Antikörpern enthält. Nach einer Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS mit einem Prozent Triton x100. Fahren Sie dann mit der Immunfärbung wie zuvor beschrieben fort.Nachdem die Färbung abgeschlossen ist, führen Sie eine letzte Wäsche durch, indem Sie 1x PBS in die Vertiefungen geben. Um sie für die Analyse vorzubereiten, entfernen Sie die Deckgläser, an denen die gefärbten Zellen befestigt sind, von der 24-Well-Platte. Und platzieren Sie sie auf einem Montagemedium auf einem Objektträger.Nachdem Sie das Eindeckmedium über Nacht bei vier Grad Celsius trocknen gelassen haben, nehmen Sie Epifluoreszenzbilder wie zuvor beschrieben auf. Otosphären, die zehn Tage lang in epithelialem Differenzierungsmedium kultiviert wurden, zeigen im Vergleich zu undifferenzierten Zellen eine erhöhte Cdkn1b-Expression, einen zyklusabhängigen Kinase-Inhibitor und Marker für die Innenohrdifferenzierung. Hier wurden bei der Hoechst-Färbung Zellkerne festgestellt.Diese Zellen weisen auch morphologische Veränderungen in den Aktinfilamenten und Regionen der Zell-Zell-Adhäsion auf, die für Epithelien charakteristisch sind. Angezeigt durch das Auftreten von Phalloidin und Cdh1-Markierung an den Zellperipherien. Otosphären können auch so gelenkt werden, dass sie Neuronen bilden.Dieses Hellfeldbild zeigt, dass IMOP-Zellen nach sieben Tagen in neuronalem Differenzierungsmedium Neuriten aufweisen. Die Immunfärbung dieser Zellen mit einem neuronalen Marker Tubb3 bestätigt ihre Differenzierung. Und sie exprimieren auch robust Cdkn1b.Dies deutet darauf hin, dass das duale Tubb3, Cdkn1b-Signal als Indikator für die neuronale Differenzierung in IMOP-Zellen verwendet werden kann. Die Cdkn1b-Fluoreszenz differenzierter und undifferenzierter Zellen wurde ebenfalls normalisiert, indem ihr Verhältnis zum Hoechst-Signal bestimmt wurde, was quantitative Ergebnisse lieferte. Histogramme dieser Daten werden hier gezeigt.Die Prozentsätze undifferenzierter und differenzierter IMOP-Zellen oberhalb eines vorgegebenen Schwellenwerts für normalisiertes Cdkn1b sind in diesen Diagrammen dargestellt. Beide differenzierten Populationen zeigen einen signifikanten Anstieg des Prozentsatzes von Zellen, die Cdkn1b exprimieren, im Vergleich zu undifferenzierten Kontrollen, was die durch Immunfluoreszenz vermutete Differenzierung bestätigt. Sobald die Beherrschung ist, kann die Routinekultur und Differenzierung von IMOP-Zellen in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Differenzierung von IMOP-Zellen initiieren können. Vielen Dank, dass Sie sich dieses Video angesehen haben. Und viel Glück bei Ihren Experimenten.

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