Initiieren Differenzierung in Immortalisierte multipotenten Vorläuferzellen Otic

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, immortalisierte multipotente otische Vorläuferzellen in Innenohrzelltypen zu differenzieren. Diese Methode kann uns also helfen, Schlüsselfragen der auditiven Regeneration zu beantworten, z. B. wie otische Vorläuferzellen zu Cochlea-Haarzellen oder auditorischen Neuronen werden können. Wichtig ist, dass diese Technik ein in-vitro-zelluläres System bietet, das parallel zu in-vivo-Säugetiermodellsystemen verwendet werden kann.

Azadeh Jadali, eine Postdoktorandin in meinem Labor, sowie Zhichao Song und Alejandra Laureano, zwei Doktorandinnen im Labor, werden das Verfahren heute demonstrieren. Nach der Zubereitung des Nährmediums, wie im Textprotokoll beschrieben, verwenden Sie drei Milliliter dieser Flüssigkeit, um eins mal zehn auf die sechste immortalisierte multipotente Vorläuferzelle oder IMOP-Zellen in eine 60-Millimeter-Gewebekulturschale zu plättieren. Inkubieren Sie die Zellen fünf bis sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid.

Verdoppeln Sie jeden zweiten Tag das Volumen der Flüssigkeit in der Kultur, indem Sie frisches Medium hinzufügen. Um die Zellen zu passieren, übertragen Sie sie zunächst aus der Kulturschale in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Und dann stellen Sie das Röhrchen fünf bis zehn Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Während dieser Zeit ist damit zu rechnen, dass sich koloniebildende Otosphären am Boden des Konischen durch Schwerkraftsedimentation ansammeln. Saugen Sie anschließend den Überstand an und achten Sie darauf, die Palette nicht zu stören. Resuspendieren Sie die Otosphären, indem Sie 0,5 Milliliter zuvor vorbereitete, vorgewärmte, ein Millimolar EDTA-verstärkte ausgewogene Salzlösung oder HBSS hinzufügen und dann zwei- bis dreimal auf und ab pipettieren.

Um die Dissoziation der Otosphären in einzelne Zellen zu erleichtern, stellen Sie den Konus in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Schwenken Sie die Lösung regelmäßig und wenn keine Otosphären als Sediment am Boden des Röhrchens beobachtet werden, bringen Sie es auf Raumtemperatur. Fahren Sie fort, den Zellen zwei Milliliter Kulturmedium hinzuzufügen, um das EDTA zu neutralisieren.

Und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 200 g. Aspirieren Sie dann die verdünnte EDTA-Lösung und waschen Sie die Zellen in fünf Millilitern 1x PBS. Nachdem Sie die Zellen mit den gleichen Einstellungen heruntergeschleudert haben, aspirieren Sie das 1x PBS.

Geben Sie anschließend 0,5 Milliliter Nährmedium in den Konus. Und halten Sie die Zellenpalette erneut an. Zum Zählen verdünnen Sie die IMOP-Zellen eins bis hundert in Kulturmedium.

Geben Sie dann 75 Mikroliter dieser Lösung in eine Kassette, die in einem mikrofluidischen Partikelzähler positioniert ist, und bestimmen Sie die Zellzahl. Anschließend werden die sechsten IMOP-Zellen wie zuvor beschrieben eins mal zehn in eine 60-Millimeter-Gewebekulturschale plättiert und diese Passageprozedur alle fünf bis sieben Tage wiederholt. Drei Tage nach dem Plattieren verwenden Sie die Schwerkraftsedimentation, um Otosphären zu sammeln, wie zuvor gezeigt.

Fahren Sie mit der Aspiration des Überstands fort. Und resuspendieren Sie die Zellen sanft in zwei Millilitern sensorischem epithelialem Differenzierungsmedium. Dann überträgst du die Otosphären mit einer zehn Milliliter großen Pipette in eine neue 60-Millimeter-Schale.

Differenzieren Sie die Otosphären zehn Tage lang. Jeden zweiten Tag werden zwei Milliliter frisches Differenzierungsmedium in die Kultur gegeben. Anschließend werden die Otosphären durch Schwerkraftsedimentation erneut geerntet.

Und saugen Sie das verbrauchte Medium an. Als nächstes fixieren Sie die Otosphären in vier Prozent Paraformaldehyd in 1x PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann die Formaldehydlösung und waschen Sie die Zellen in 1x PBS mit 0,1 Prozent Triton x100.

Fahren Sie fort, indem Sie die Otosphären in 1x PBS blockieren, ergänzt mit zehn Prozent Ziegenserum und 0,1 Prozent Triton x100. Ersetzen Sie nach einer Stunde den Blockierungspuffer durch einen Puffer, der die entsprechende Verdünnung von Cdkn1b- oder CDH1-Antikörpern enthält. Dann inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius in Primärantikörpern.

Und am nächsten Tag setzen Sie die Immunfärbung mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern, Phalloidin und Hoechst, fort, wie an anderer Stelle beschrieben. Zur Vorbereitung der Bildgebung legen Sie das Eindeckmedium auf einen Objektträger. Und dann führen Sie die gefärbten Otosphären in das Medium ein.

Legen Sie anschließend einen Deckzettel auf die Probe. Nachdem Sie das Eindeckmedium über Nacht bei vier Grad Celsius trocknen gelassen haben, legen Sie den Objektträger auf den Tisch eines inversen Mikroskops, das mit einer 16-Bit-CCD-Kamera ausgestattet ist. Mit dem 20x 0,75 Luftobjektiv können Sie Epifluoreszenzbilder aufnehmen, indem Sie Daten aus den blauen, grünen, roten und infraroten Kanälen sammeln.

Reinigen Sie zunächst runde Glasdeckgläser, indem Sie sie in eine sterile 100-Millimeter-Platte legen und in 70 Prozent Ethanol tauchen. Rühren Sie die Deckgläser vorsichtig um, um sicherzustellen, dass sie abgedeckt sind, und lassen Sie das Gericht zehn Minuten lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie anschließend die Deckgläser dreimal in sterilem 1x PBS und dann einmal mit sterilem Wasser aus.

Lassen Sie dann die Eindeckeinlagen trocknen, indem Sie sie 15 Minuten lang in einer Gewebekulturhaube UV-Licht aussetzen. Legen Sie zur sofortigen Verwendung einen sterilen Deckglas in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Und schütteln Sie die Platte vorsichtig, um sicherzustellen, dass alle Einbandfolien flach aufliegen.

Beschichten Sie dann die Deckgläser, indem Sie 0,25 Milliliter 1x PBS mit 10 Mikrogamen pro Milliliter Poly-D-Lysin in jede Vertiefung geben. Nachdem die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert hat, entfernen Sie die Poly-D-Lysinlösung und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit sterilem 1x PBS. Sobald die Flüssigkeit aus der letzten Wäsche abgesaugt wurde, geben Sie 0,25 Milliliter 1x PBS mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Laminin in jede der 24 Vertiefungen.

Nachdem Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, aspirieren Sie die Laminin-Lösung, waschen Sie dann jede Vertiefung dreimal mit einem Milliliter 1x PBS, aber lassen Sie das PBS von der letzten Wäsche in den Vertiefungen, bis die Zellen bereit sind, plattiert zu werden. Um mit der neuronalen Differenzierung zu beginnen, zählen Sie die Zellen aus dissoziierten Otosphären, wie zuvor beschrieben. Und dann resuspendieren Sie sie in vorgewärmtem neuronalem Differenzierungsmedium.

Fahren Sie fort, indem Sie zwischen einem und einem Punkt fünf mal zehn bis zur fünften IMOP-Zellen in jede Vertiefung der Platte mit den beschichteten Deckgläsern säen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid. Das neuronale Differenzierungsmedium wird alle zwei Tage ersetzt.

Nach sieben Tagen aspirieren Sie das Medium und fixieren die Zellen, die an den Deckgläsern befestigt werden sollen, indem Sie jeweils vier Prozent Formaldehyd hinzufügen. Und lassen Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Entfernen Sie dann das Formaldehyd und waschen Sie die Zellen einmal in 1x PBS mit 0,1 Prozent Triton x100.

Entfernen Sie anschließend den Waschpuffer. Und fügen Sie jedem Well einen Blockierungspuffer hinzu, der aus 1x PBS besteht, das zehn Prozent normales Ziegenserum und 0,1 Prozent Triton x100 enthält. Lassen Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie dann die Flüssigkeit und ersetzen Sie sie durch einen Blockierungspuffer, der die entsprechende Verdünnung von Cdkn1b- oder Tubb3-Antikörpern enthält. Nach einer Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS mit einem Prozent Triton x100. Fahren Sie dann mit der Immunfärbung wie zuvor beschrieben fort.

Nachdem die Färbung abgeschlossen ist, führen Sie eine letzte Wäsche durch, indem Sie 1x PBS in die Vertiefungen geben. Um sie für die Analyse vorzubereiten, entfernen Sie die Deckgläser, an denen die gefärbten Zellen befestigt sind, von der 24-Well-Platte. Und platzieren Sie sie auf einem Montagemedium auf einem Objektträger.

Nachdem Sie das Eindeckmedium über Nacht bei vier Grad Celsius trocknen gelassen haben, nehmen Sie Epifluoreszenzbilder wie zuvor beschrieben auf. Otosphären, die zehn Tage lang in epithelialem Differenzierungsmedium kultiviert wurden, zeigen im Vergleich zu undifferenzierten Zellen eine erhöhte Cdkn1b-Expression, einen zyklusabhängigen Kinase-Inhibitor und Marker für die Innenohrdifferenzierung. Hier wurden bei der Hoechst-Färbung Zellkerne festgestellt.

Diese Zellen weisen auch morphologische Veränderungen in den Aktinfilamenten und Regionen der Zell-Zell-Adhäsion auf, die für Epithelien charakteristisch sind. Angezeigt durch das Auftreten von Phalloidin und Cdh1-Markierung an den Zellperipherien. Otosphären können auch so gelenkt werden, dass sie Neuronen bilden.

Dieses Hellfeldbild zeigt, dass IMOP-Zellen nach sieben Tagen in neuronalem Differenzierungsmedium Neuriten aufweisen. Die Immunfärbung dieser Zellen mit einem neuronalen Marker Tubb3 bestätigt ihre Differenzierung. Und sie exprimieren auch robust Cdkn1b.

Dies deutet darauf hin, dass das duale Tubb3, Cdkn1b-Signal als Indikator für die neuronale Differenzierung in IMOP-Zellen verwendet werden kann. Die Cdkn1b-Fluoreszenz differenzierter und undifferenzierter Zellen wurde ebenfalls normalisiert, indem ihr Verhältnis zum Hoechst-Signal bestimmt wurde, was quantitative Ergebnisse lieferte. Histogramme dieser Daten werden hier gezeigt.

Die Prozentsätze undifferenzierter und differenzierter IMOP-Zellen oberhalb eines vorgegebenen Schwellenwerts für normalisiertes Cdkn1b sind in diesen Diagrammen dargestellt. Beide differenzierten Populationen zeigen einen signifikanten Anstieg des Prozentsatzes von Zellen, die Cdkn1b exprimieren, im Vergleich zu undifferenzierten Kontrollen, was die durch Immunfluoreszenz vermutete Differenzierung bestätigt. Sobald die Beherrschung ist, kann die Routinekultur und Differenzierung von IMOP-Zellen in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Differenzierung von IMOP-Zellen initiieren können. Vielen Dank, dass Sie sich dieses Video angesehen haben. Und viel Glück bei Ihren Experimenten.