Verwaltung und Nachweis von Protein-Kennzeichen auf Arthropoden für Dispersal Forschung

Das übergeordnete Ziel dieser Demonstration ist es, zu beschreiben, wie Insekten mit Protein für die Ausbreitungs- oder Migrationsforschung markiert werden können. In dieser Demonstration sind Methoden zum Nachweis der Markierungen durch ein Sandwich oder einen indirekten enzymgebundenen Immunsorbent-Assay enthalten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Insektenausbreitungsforschung zu beantworten.

Es kann verwendet werden, um die Migrationsmuster von Insekten, die Präferenzen von Wirtspflanzen von Insekten und die Ausbreitung invasiver Arten zu untersuchen. Die Vorteile dieser Technik bestehen darin, dass die Nachweismethode einfach und kostengünstig ist. Geeignet für hohen Durchsatz, und die Tiere können einfach direkt in ihrem natürlichen Lebensraum markiert werden.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, weil sie schwieriger erscheint, als sie ist, da die meisten Feldforscher keine Erfahrung mit dieser einfachen Technik haben. Die Idee zu dieser Methode hatte ich erstmals 1989. Wir züchteten großäugige Käferräuber mit künstlicher Nahrung.

Wir waren besorgt, dass diese Käfer keine effektiven Fressfeinde für einen Lygus-Schädling sein würden, nachdem sie lange Zeit in Gefangenschaft mit einer unnatürlichen Ernährung aufgezogen wurden. Mit anderen Worten, sie würden domestiziert. Wir brauchten eine sichere, effektive und kostengünstige Methode, um sie nach ihrer Freilassung im Feld von ihren einheimischen Artgenossen zu unterscheiden.

Keine der aktuellen Markierungsmethoden erfüllt diese Kriterien. Eine frühere Erfahrung, die ich mit dem ELISA-Verfahren gemacht habe, um Analysen des Raubdarmgehalts auf Lygus-spezifische Proteinreste durchzuführen, brachte mich auf die Idee, eine Fremdproteinmarkierung auf den im Labor gezüchteten Räuber aufzubringen. Im Gegenzug konnten wir die im Feld gesammelten Großaugenwanzen auf Lygus-Überreste und auf die fremden Proteinreste untersuchen.

Sammeln Sie zu Beginn etwa 100 interessante Insekten aus einer Laborkolonie oder vom Feld und verteilen Sie sie auf zwei saubere Aufzuchtbehälter. Beladen Sie einen Behälter mit einer normalen 20-Milliliter-Diätpackung, die als Negativkontrolle dient. Für den anderen schnüren Sie eine Diätpackung mit einem Milligramm Hühnchen-IgG-IgY.

Fügen Sie einen Milliliter Lösung hinzu und mischen Sie gründlich. Verwenden Sie bei Bedarf das, was die Insekten normalerweise anstelle der Packung füttern. Nach 24 Stunden Aufzucht mit diesen Futterpackungen versorgen Sie beide Insektengruppen mit normalem, unmarkiertem Futter.

Sammle in den gewünschten Zeitabständen 20 einzelne Insekten aus jeder Kohorte. Frieren Sie sie bei minus 20 Grad Celsius ein, bis alle benötigten Kohorten für das Experiment gesammelt sind. Um eine 96-Well-Platte für den ELISA vorzubereiten, fügen Sie zu jeder Vertiefung 50 Mikroliter Kaninchen-Anti-Hühner-IgY-Primärantikörper hinzu, verdünnt eins zu 500 in Tris-gepufferter Kochsalzlösung oder TBS.

Lassen Sie die beladene Platte mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Leeren Sie später die Vertiefungen und geben Sie 300 Mikroliter Blocklösung in jede Vertiefung. Dabei handelt es sich um eine einprozentige fettfreie Trockenmilchlösung.

Lassen Sie die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Während der Blockinkubation werden einzelne gefrorene Insekten in Mikrozentrifugenröhrchen überführt, die mit einem Milliliter TBS beladen sind. Homogenisieren Sie dann jedes Insekt gründlich mit einem sauberen Stößel.

Wenn die Platte fertig ist, befüllen Sie jede Vertiefung mit 100 Mikrolitern einer homogenisierten Insektenprobe. Jede 96-Well-Platte bietet Platz für 80 Proben. Lassen Sie die erste und letzte Spalte des Tellers für die Steuerelemente leer.

Laden Sie in die erste Spalte allein sieben 100-Mikroliter-Aliquots TBS und laden Sie eine Vertiefung mit 100 Mikrolitern TBS mit Eiweiß-Positivkontrolle. In die letzte Spalte werden 100 Mikroliter von acht einzelnen unmarkierten Insektenpräparaten geladen. Lassen Sie die Proben mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Waschen Sie die Vertiefungen nach der Inkubation vorsichtig dreimal vorsichtig mit phosphatgepuffertem Kochsalzlösung Tween oder PBS-Tween. Durch unsere Erfahrung haben wir gelernt, dass die meisten Fehler während der Waschschritte auftreten. Spritzen kann zu einer hohen Anzahl von falsch positiven Reaktionen führen, seien Sie also vorsichtig.

Fügen Sie nach dem Waschen 50 Mikroliter Kaninchen-Anti-Hühner-IgG-IgY hinzu, das an Meerrettichperoxidase konjugiert ist, und verdünnen Sie es auf 10.000 in einer einprozentigen Milchlösung. Lassen Sie die Lösung mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur in den Vertiefungen inkubieren. Später die Platte wie zuvor dreimal mit PBS-Tween auswaschen.

Beladen Sie dann die Vertiefungen mit 50 Mikrolitern TMB-Substrat. Es kann sein, dass Sie sofort eine Farbveränderung feststellen. Lassen Sie die Platte 10 Minuten inkubieren, bevor Sie sie mit einem Mikrotiterplatten-Spektralphotometer ablesen.

Lesen Sie die Platte bei 650 Nanometern ab und notieren Sie die Werte. Um Insekten äußerlich zu markieren, bereiten Sie Ein-Liter-Plastikflaschen mit Zugangslöchern vor und teilen Sie 100 Insekten in zwei Flaschen auf. Besprühen Sie dann die Insekten in einem Behälter mit einem Milliliter destilliertem Wasser, das als Negativkontrolle dient.

Befestigen Sie als Nächstes einen medizinischen Vernebler an einem Luftauslass und stellen Sie den Luftstrom so ein, dass der Vernebler Dampf erzeugt. Besprühen Sie die anderen Insekten mit einem Milliliter fünfprozentiger Hühnereiweißlösung. Der Sprühvorgang sollte zwischen zwei und fünf Minuten dauern.

Verkorken Sie dann die Löcher und lassen Sie die Lösung vollständig bei Raumtemperatur trocknen. Nach dem Trocknen werden die Insekten mit ihrer normalen Nahrung wieder in ihre normalen Aufzuchtbehälter umgefüllt und wie gewohnt aufbewahrt. Sammeln Sie die Insekten später in festgelegten Zeitabständen zum Testen.

Um die externe Markierungsretention zu überprüfen, verwenden Sie ein Verfahren, das mit dem ELISA-Assay zur Prüfung der internen Markierungsretention identisch ist, mit geringfügigen Änderungen. Nachdem die Insekten in Mikrozentrifugenröhrchen mit TBS überführt wurden, lassen Sie sie eine Stunde lang bei 120 U/min auf einem Orbitalschüttler einweichen, anstatt sie zu homogenisieren. Nachdem Sie die Insekten eingeweicht haben, pipettieren Sie 100 Mikroliter der Lösung in die Plattenvertiefungen und lassen Sie die Platte mindestens eine Stunde lang inkubieren.

Nach dem Auswaschen der Insektenproben geben Sie 300 Mikroliter PBS mit einem Prozent BSA in jede Vertiefung. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur die Vertiefungen zweimal mit PBS-Tween waschen. Geben Sie dann in jede Vertiefung 50 Mikroliter Kaninchen-Anti-Ei-Albumin-Primärantikörper, verdünnt von eins zu achttausend in PBS-BSA-Silhouette.

Inkubieren Sie die Platte mindestens eine Stunde lang und waschen Sie die Vertiefungen wie zuvor aus. Geben Sie dann in jede Vertiefung 50 Mikroliter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit Meerrettichperoxidase und verdünnt eins zu zweitausend in PBS-BSA-Silhouette. Lassen Sie die Platte mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren und fahren Sie dann mit dem Protokoll wie zuvor beschrieben fort.

Die Beibehaltung der internen Markierung wurde zu vier Zeitpunkten getestet. Insgesamt ergaben die ohne Protein behandelten Insekten konstant niedrige ELISA-Werte. Alle Insekten, die mit dem proteinangereicherten Futter gefüttert wurden, zeigten konstant hohe ELISA-Werte.

Zu vier Zeitpunkten wurden auch externe Markierungen getestet. Die Insekten, die topisch mit Eiweiß markiert wurden, lieferten konstant hohe Werte. Wie vorherzusehen war, zeigten die mit Wasser bespritzten Negativkontrollen sehr niedrige ELISA-Werte.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Insekten markiert und sie auf das Vorhandensein der Markierung analysiert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden und 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Laufe eines Tages können 16 Assay-Platten mit weit über 1000 Proben bearbeitet werden.

Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Assay extrem empfindlich ist. Daher ist es zwingend erforderlich, dass alle Oberflächen, Behälter und Geräte frei von Proteinkontaminationen sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, lokale und flächendeckende Ausbreitungsmuster von Insekten in landwirtschaftlichen, städtischen, Wald- und anderen natürlichen Lebensräumen zu erforschen.

Wir haben hier ein Beispiel in kleinem Maßstab demonstriert, aber die Technik wurde in einem viel größeren Maßstab eingesetzt, um die Insekten direkt in ihrem natürlichen Lebensraum mit kommerziellen Sprühgeräten zu markieren. Wir waren erstaunt über die kreativen Anwendungen unserer Mitarbeiter.