Geschlechtsunterschiede in Mäuse Hippocampus Astrozyten nach In-Vitro Ischemia

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist die Herstellung angereicherter geschlechtsspezifischer hippokampaler Astrozytenkulturen von neugeborenen Mäusen als Werkzeug zur Untersuchung der geschlechtsspezifischen Rollen von Astrozyten nach Sauerstoff- und Glukoseentzug und Reoxygenierung, um in vivo hypoxische Ischämie in einer Zellkulturumgebung nachzuahmen. Diese Methode kann helfen, wichtige mechanistische und translationale Fragen zur geschlechtsspezifischen Rolle von hippokampalen Astrozyten nach hypoxischer Ischämie bei der Entwicklung des männlichen und weiblichen Gehirns zu beantworten. Präpariere das Gehirn vom Kopf eines neugeborenen Mauswelpen, indem du mit einer kleinen Schere einen Schnitt von hinten nach vorne durch die Haut machst, um den Schädel freizulegen.

Schneiden Sie die Schädelmittellinie vorsichtig vom Hals bis zur Nase ab. Verwenden Sie eine sterile Pinzette mit flacher Spitze, um den Schädel abzuschälen. Entfernen Sie den Hirnstamm mit Hilfe einer gebogenen Pinzette und legen Sie das verbleibende Gehirn in eine Präparierschale.

Drehen Sie das Gehirn mit einer gebogenen Pinzette so, dass die Bauchfläche nach oben zeigt, und trennen Sie dann die Hemisphären mit einer scharfen, sterilen chirurgischen Klinge. Schälen Sie mit einer flachen, gebogenen Pinzette die Gehirnhälften zurück und entfernen Sie vorsichtig das pralle Mittelhirn- und Thalamusgewebe, um den Hippocampus freizulegen, eine kleine seepferdchenförmige Struktur im medialen Temporallappen. Entfernen Sie beide Hippocampuslappen und reinigen Sie die Hirnhäute und Fibroblasten vorsichtig von der Oberfläche der Lappen, indem Sie mit einer feinen Pinzette ziehen.

Übertragen Sie beide Hippocampuslappen einer einzelnen Maus in eine zweite Schale, die mit etwa 5 Millilitern HBSS gefüllt ist, und legen Sie sie auf Eis. Hacken Sie die Lappen ca. 4 Mal mit einer scharfen, sterilen chirurgischen Klinge. Verwenden Sie eine sterile 1-Milliliter-Pipette, um das HBSS und das Gewebe in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen zu übertragen, und zentrifugieren Sie dann 5 Minuten lang bei 300-fachem G.

Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand abgesaugt. Fügen Sie 3 Milliliter 0,25 Prozent Trypsin hinzu, mischen Sie und inkubieren Sie das Gewebe 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie das Röhrchen 5 Minuten lang bei 300 mal G.

Nach dem Schleudern den Überstand mit einer sterilen Glaspipette vorsichtig absaugen und dann 10 Milliliter vorgewärmtes Astrozyten-Beschichtungsmedium hinzufügen. Zerreiben Sie 20 bis 30 Mal mit einer feuerpolierten Glaspipette. Nach einer weiteren 5-minütigen Zentrifugation bei 300-fachem G wird der Überstand aspiriert und 2 Milliliter Astrozyten-Beschichtungsmedium hinzugefügt.

Führen Sie die Zellsuspension durch den 70-Mikron-Maschenfilter in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Die gesamte Zellsuspension wird in einen beschichteten sterilen T-25-Kulturkolben gegeben, der 3 Milliliter Astrozyten-Beschichtungsmedium enthält. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator.

Beobachten Sie am nächsten Tag das Fortschreiten der astrozytären Konfluenz unter einem Lichtmikroskop, aspirieren Sie das Medium und ersetzen Sie es durch 2 Milliliter frisches Astrozyten-Beschichtungsmedium. Etwa 11 Tage in vitro werden die konfluenten Astrozyten geerntet, indem Sie das Medium aspirieren und dann 2 Milliliter 0,25 % Trypsin hinzufügen. Drehen Sie den Kolben vorsichtig einige Male und aspirieren Sie dann das Trypsin mit einer sterilen Glaspipette.

Fügen Sie weitere 2 Milliliter 0,25%iges Trypsin hinzu und lassen Sie den Kolben 4-5 Minuten bei Raumtemperatur ziehen. Nachdem Sie das Trypsin entfernt haben, stellen Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten in einen 5%CO2-Inkubator. Nach der Inkubation fügen Sie 5 Milliliter Astrozyten-Beschichtungsmedium hinzu und lösen Sie die Astrozytenschicht ab, indem Sie den Kolben 3 bis 4 Mal klopfen.

Die Zellsuspension wird vorsichtig über den Boden des Kolbens verzerrt, um eine vollständige Ablösung zu erreichen, und dann werden die Astrozyten in einem konischen 15-Liter-Röhrchen gesammelt. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 mal G für 5 Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie dann 1 Milliliter frisches Astrozyten-Beschichtungsmedium hinzu.

Geben Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension in ein Hämozytometer und verwenden Sie ein inverses Phasenkontrastmikroskop mit einem 10-fach-Objektiv, um die Zellen in der großen zentralen Gitterfläche zu zählen. Verdünnen Sie die Zellen auf etwa 10 bis 5 Zellen pro 2 Milliliter Astrozyten-Beschichtungsmedium. Pipettieren Sie 2 Milliliter der Zellsuspension auf ein mit Poly-D-Lysin beschichtetes Glasdeckglas in der Vertiefung einer 24-Well-Kulturschale.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator. Um mit Sauerstoff- und Glukoseentzug zu beginnen, saugen Sie das Medium aus dem Deckglas mit den anhaftenden Astrozyten ab und spülen Sie es einmal mit 1 Milliliter isotonischer OGD-Lösung aus. Geben Sie 0,2 Milliliter OGD-Lösung in die Vertiefung und geben Sie sie in einen hypoxischen Inkubator.

Mischen Sie vorsichtig mit einem Orbitalschüttler, der auf 50 U/min eingestellt ist, für die ersten 30 Minuten der Hypoxie. Ersetzen Sie zur Reoxygenierung die OGD-Lösung durch 2 Milliliter Astrozyten-Beschichtungsmedium und inkubieren Sie 5 Stunden lang in 5 % Kohlendioxid und atmosphärischer Luft bei 37 Grad Celsius. Dieses Immunfluoreszenzbild zeigt die Reinheit der primären hippokampalen Astrozytenkultur der Maus.

Die Astrozytenkultur wurde immungefärbt, um den neuronalen Dendritenmarker MAP2 in Rot und den Mikrogliamarker IBA1 in Grün zu zeigen. Die Zellkerne werden mit DAPI gefärbt, das blau erscheint. Der Pfeil zeigt die Kontamination der Mikroglia an.

Dieses repräsentative Immunfluoreszenzbild von kultivierten hippokampalen Astrozyten unter normoxischen Bedingungen zeigt die GFAP-Immunreaktivität in rot und die HIF1-alpha-Markierung in grün. Auch hier werden die Zellkerne mit DAPI gefärbt, das blau erscheint. Der Pfeil zeigt eine niedrige HIF1-alpha-Expression an.

Nach 2 Stunden Sauerstoff- und Glukoseentzug und 5 Stunden Reoxygenierung war die HIF1-alpha-Expression in kultivierten hippokampalen Astrozyten erhöht, wie die Pfeilspitze zeigt, was auf eine erhöhte HIF1-alpha-Kernexpression hinweist. Die GFAP-Expression und die S100b-Expression wurden in hippokampalen Astrozytenkulturen von männlichen Mäusen nach Sauerstoff- und Glukoseentzug und Rexoygenation hochreguliert. Eine Hochregulierung von S100b und GFAP wurde auch in Astrozyten beobachtet, die von weiblichen Mäusen gewonnen wurden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie quantitative PCR, Western Blotting, siRNA und immunhistochemische Färbungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie geschlechtsspezifische Veränderungen bestimmter Gen- und Proteinexpressionen nach in vitro Ischämie zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung kann diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg ebnen, um die Auswirkungen und Folgen eines Schlaganfalls im Hippocampus zu erforschen und die Astrozyten in Kultur zu untersuchen.