Geschlechtsunterschiede in Mäuse Hippocampus Astrozyten nach

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, angereicherte, geschlechtsspezifische Hippocampus-Astrozytenkulturen aus neugeborenen Mäusen herzustellen, um die geschlechtsspezifischen Funktionen von Astrozyten nach Sauerstoff- und Glukoseentzug sowie Reoxygenierung zu untersuchen und so eine hypoxisch-ischämische Situation im lebenden Organismus in einem Zellkultursystem nachzuahmen. Diese Methode kann helfen, zentrale mechanistische und translationsrelevante Fragen bezüglich der geschlechtsspezifischen Rolle von Hippocampus-Astrozyten nach hypoxisch-ischämischen Ereignissen in sich entwickelnden männlichen und weiblichen Gehirnen zu beantworten. Entnehmen Sie das Gehirn aus dem Kopf eines neugeborenen Mäusewelpen, indem Sie mit kleinen Scheren einen medianen Schnitt von posterior nach anterior durch die Haut führen, um den Schädel freizulegen.

Schneiden Sie den Schädel mittig von der Halsregion bis zur Nase vorsichtig auf. Heben Sie mithilfe steriler flacher Pinzetten den Schädel ab. Entfernen Sie das Hirnstammgewebe mit Hilfe einer gebogenen Pinzette und legen Sie das verbleibende Gehirn in eine Schnappschale.

Heben Sie das Gehirn mit gebogenen Pinzetten um, sodass die ventrale Fläche nach oben zeigt, und trennen Sie dann die Hemisphären mit einem scharfen, sterilen chirurgischen Skalpell. Klappen Sie mit flachen, gebogenen Pinzetten die Großhirnhemisphären zurück und entfernen Sie vorsichtig das hervortretende Mittelhirn- und Thalamusgewebe, um den Hippocampus freizulegen – eine kleine, seepferdchenförmige Struktur im medialen Temporallappen. Entfernen Sie beide Hippocampuslappen und reinigen Sie vorsichtig die Meningen und Fibroblasten von der Oberfläche der Lappen, indem Sie mit feiner Pinzette ziehen.

Überführen Sie beide hippocampalen Lappen eines einzelnen Mäuses in eine zweite Schale, die mit etwa 5 Milliliter HBSS gefüllt ist, und stellen Sie sie auf Eis. Zerkleinern Sie die Lappen mithilfe einer scharfen, sterilen chirurgischen Klinge etwa viermal. Übertragen Sie mit einer sterilen Pipette von 1 Milliliter das HBSS und das Gewebe in ein steriles kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie anschließend 5 Minuten bei 300 × g.

Nach der Zentrifugation wird der Überstand abpipettiert. Geben Sie 3 Milliliter 0,25-prozentiges Trypsin hinzu, mischen Sie gründlich und inkubieren Sie das Gewebe 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter vorsichtigem Schütteln. Anschließend wird die Probe 5 Minuten bei 300 ×g zentrifugiert.

Nach dem Zentrifugieren verwenden Sie eine sterile Glaspipette, um das Überstandsvolumen vorsichtig abzusaugen, und geben Sie dann 10 Milliliter vorgewärmtes Astrozyten-Plattierungsmedium hinzu. Pipettieren Sie 20 bis 30 Mal mit einer flammenglatten Glaspipette. Nach einer weiteren Zentrifugation von 5 Minuten bei 300 ×g wird der Überstand abgesaugt und 2 Milliliter Astrozyten-Plattierungsmedium hinzugefügt.

Leiten Sie die Zellsuspension durch einen 70-Mikrometer-Netzfilter in ein neues kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie die gesamte Zellsuspension in einen beschichteten sterilen T-25-Kulturkolben, der 3 Milliliter Astrozyten-Ansaatmedium enthält. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.

Am nächsten Tag die Ausbreitung der astrogliären Konfluenz unter dem Lichtmikroskop beobachten, das Medium abpipettieren und durch 2 Milliliter frisches Astrozyten-Plattierungsmedium ersetzen. Etwa am 11. Tag in vitro die konfluenten Astrozyten gewinnen, indem das Medium abpipettiert und anschließend 2 Milliliter 0,25 %iger Trypsin zugegeben werden. Das Gefäß vorsichtig mehrmals rotieren lassen und danach den Trypsin mit einer sterilen Glaspipette abpipettieren.

Geben Sie weitere 2 Milliliter 0,25 %iges Trypsin hinzu und lassen Sie das Gefäß 4–5 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Nach dem Entfernen des Trypsins stellen Sie das Gefäß 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einen 5 % CO2-Inkubator. Fügen Sie nach der Inkubation 5 Milliliter Astrozyten-Plattiermedium hinzu und lösen Sie die Astrozytenschicht durch 3–4-maliges Anschlagen des Gefäßes ab.

Pipettieren Sie die Zellsuspension vorsichtig über den Boden des Kolbens, um eine vollständige Ablösung zu erreichen, und sammeln Sie die Astrozyten dann in einem 15-Milliliter-Konischgefäß. Zentrifugieren Sie das Gefäß bei 300 × g für 5 Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und geben Sie anschließend 1 Milliliter frisches Astrozyten-Plattierungsmedium hinzu.

Geben Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension auf ein Hämozytometer und zählen Sie die Zellen im großen zentralen Rasterbereich mit einem umgekehrten Phasenkontrastmikroskop und einer 10x-Objektivlinse. Verdünnen Sie die Zellen auf etwa 1 × 10⁵ Zellen pro 2 Milliliter Astrozyten-Plattiermedium. Pipettieren Sie 2 Milliliter der Zellsuspension auf eine mit Poly-D-Lysin beschichtete Glasdeckfolie in der Vertiefung einer 24-Loch-Kulturschale.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Um die Sauerstoff- und Glukoseentzug (OGD) zu beginnen, aspirations das Medium von der Deckglasfläche mit anhaftenden Astrozyten und spülen Sie einmal mit 1 Milliliter isotonischer OGD-Lösung. Geben Sie 0,2 Milliliter OGD-Lösung in die Vertiefung und stellen Sie sie in einen hypoxischen Inkubator.

Vorsichtig mit einem Rotationsschüttler, der auf 50 U/min eingestellt ist, für die ersten 30 Minuten der Hypoxie mischen. Für die Reoxygenierung die OGD-Lösung durch 2 Milliliter Astrozyten-Plattierungsmedium ersetzen und 5 Stunden lang bei 5 % Kohlendioxid und atmosphärischer Luft bei 37 Grad Celsius inkubieren. Dieses Immunfluoreszenzbild zeigt die Reinheit der primären Maus-Hippocampus-Astrozytenkultur.

Die Astrozytenkultur wurde immunhistochemisch gefärbt, um den neuronalen Dendritenmarker MAP2 in Rot und den Mikroglia-Marker IBA1 in Grün darzustellen. Die Kerne sind mit DAPI angefärbt, das blau erscheint. Der Pfeil zeigt eine Kontamination mit Mikroglia an.

Dieses repräsentative immunfluoreszenzfarbene Bild von kultivierten hippocampalen Astrozyten unter normoxischen Bedingungen zeigt die GFAP-Immunreaktivität in Rot und die HIF1-alpha-Färbung in Grün. Auch hier wurden die Kerne mit DAPI gefärbt, das blau erscheint. Der Pfeil weist auf eine geringe HIF1-alpha-Expression hin.

Nach 2 Stunden Sauerstoff- und Glukoseentzug sowie 5 Stunden Reoxygenierung war die HIF1-alpha-Expression in kultivierten hippocampalen Astrozyten erhöht, wie durch den Pfeil angezeigt, der auf eine gesteigerte nukleäre HIF1-alpha-Expression hinweist. Die Expression von GFAP und S100b war in hippocampalen Astrozytenkulturen von männlichen Mäusen nach Sauerstoff- und Glukoseentzug sowie Reoxygenierung hochreguliert. Eine Hochregulierung von S100b und GFAP wurde ebenfalls in Astrozyten von weiblichen Mäusen beobachtet.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie quantitative PCR, Western Blotting, siRNA und immunhistochemische Färbungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise geschlechtsspezifische Veränderungen in der Expression bestimmter Gene und Proteine nach in-vitro-Ischämie. Nach ihrer Entwicklung kann diese Technik für Forscher im Bereich der Neurowissenschaften den Weg ebnen, die Wirkungen und Folgen eines Schlaganfalls im Hippocampus zu untersuchen, wobei Astrozyten in Kultur analysiert werden.