Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, durch Funktionsverlust- und Funktionsgewinn-Manipulationen stadienspezifische Moleküle zu identifizieren, die die Differenzierung der inneren Zellmasse von Mausembryonen während der Präimplantation steuern. Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfrage nach der frühen Befreiung des Zellschicksals in der grundlegenden Entwicklungsbiologie sowie in der Stammzellbiologie, den Tierwissenschaften und der reproduktiven Biotechnologie, wie z.B. dem Klonen von Tieren, zu beantworten. Das Hauptziel dieser Technik besteht darin, dass der stadienspezifische Rezeptor und es gibt Liganden, die verwendet werden können, um die Expression nur des embryonalen Stammzell-spezifischen Faktors während der Embryonalentwicklung zu verstärken.

Dieses Protokoll wurde in Zusammenarbeit mit mehreren Labors entwickelt. Mein Mitarbeiter, Professor Sang Jin Lee, und sein Doktorand Yong Il Cho werden den Prozess demonstrieren. 18 bis 20 Stunden nach der letzten Injektion opfern Sie die trächtigen Weibchen durch Kohlendioxidvergiftung, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation.

Öffnen Sie dann die Rückseite und schneiden Sie die innere Schicht mit einer feinen Schere durch. Suchen und heben Sie die Gebärmutterhörner mit einer feinen Pinzette auf und ziehen Sie sie zusammen mit der Gebärmutter, dem Eileiter, dem Eierstock und den Fettpolstern vorsichtig aus der Körperhöhle. Schneiden Sie anschließend den Bereich zwischen dem Eileiter und dem Eierstock mit einer feinen Schere ab.

Positionieren Sie dann die Pinzette neu und schneiden Sie die Gebärmutter in der Nähe des Eileiters, wobei mindestens ein Zentimeter des oberen Teils der Gebärmutter befestigt bleibt. Übertragen Sie nun die Eileiterampulle in den mit Mineralöl bedeckten M16-Tropfen des Mediums auf einer 35-Millimeter-Petrischale bei Raumtemperatur. Sammeln Sie die Eileiter von mehreren Mäusen in derselben Schale.

Nach der Vorbereitung der einen CC-Spritzennadel, wie im Textprotokoll angegeben, verwenden Sie eine feine Pinzette, um das Ende des Eileiters zu halten und in ihn einzudringen. Anschließend die Kumulusmasse in der Medientropfenphase vorsichtig durchstechen und ausdrücken. Unter einem Stereomikroskop werden die 2-PN-Embryonen zusammen mit den umgebenden Kumulusmassen mit einer sterilen Glaspipette entnommen und in eine neue Petrischale überführt.

Als nächstes dissoziieren Sie die Kumuluszellen, indem Sie das Gewebe in einem Milliliter Hyaluronidase-Lösung baden. Inkubieren Sie das Gericht nun bei 37 Grad Celsius für fünf bis 10 Minuten. Der nächste Schritt besteht darin, die Embryonen zu entblößen.

Lassen Sie die Badelösung mit der Glaspipette vorsichtig fließen, um die Kumuluszellen aus den umgebenden Embryonen freizusetzen. Waschen Sie anschließend die entblößten Embryonen mit 30 bis 50 Millilitern frischem PBS pro Embryo. Führen Sie diese Wäsche dreimal durch.

Übertragen Sie nun die Embryonen in eine 35-Millimeter-Kunststoffschale mit M16 plus BSA und bewahren Sie sie vor der Mikroinjektion bis zu vier Stunden in einem befeuchteten Inkubator auf. Waschen Sie die entblößten 2-PN-Embryonen vor der Mikroinjektion kurz mit einem Milliliter frischem M16. Übertragen Sie dann die Embryonen in Lösung in ein Zentrifugenröhrchen und schleudern Sie sie 10 Minuten lang bei 1.000 g herunter.

Übertragen Sie nun jeden Embryo in eine Kulturschale mit 20 bis 30 Mikrolitern M16-Medium. Dadurch werden die Vorkerne sichtbar. Decken Sie das Medium mit einer dünnen Schicht Mineralöl ab und inkubieren Sie die Embryonen bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid für ein bis zwei Stunden.

Bereiten Sie in der Zwischenzeit mit einem mechanischen Abzieher die Injektionspipetten und Haltepipetten aus den Kapillarschläuchen aus Borosilikglas vor. Stellen Sie anschließend mit einem Mikroschleifer und einem Mikroschmied die Injektionspipetten mit stumpfen Spitzen her und polieren Sie sie in zwei Mikrometer breite Öffnungen. Die Spitzenlänge sollte weniger als 500 Mikrometer betragen.

Stellen Sie auf ähnliche Weise Haltepipetten her, indem Sie stumpfe Spitzen herstellen und ihre Öffnungen auf einen Innendurchmesser von 20 Mikrometern und einen Außendurchmesser von 100 Mikrometern polieren. Beladen Sie nun die Injektionspipetten mit mindestens 200 Nanolitern Plasmidlösung in einer Konzentration von einem Mikrogramm DNA pro Mikroliter. Montieren Sie anschließend die Injektionspipette in einen motorisierten Mikromanipulator.

Stellen Sie dann den Injektor auf Impulsbolzen von etwa 10 Pikolitern ein. Für die Mikroinjektion sichern Sie die Embryonen mit Unterdruck aus der Haltepipette. Schieben Sie dann vor und platzieren Sie die Spitze der Injektionspipette neben der Zellmembran direkt über einem der Vorkerne.

Dann spießen Sie die Zellmembran auf, schieben Sie weiter in den Vorkern und machen Sie die Injektion von 10 Pikolitern. Entnehmen Sie nach der Mikroinjektion die injizierten Embryonen und waschen Sie sie dreimal mit frischem M16-Medium. Jede Wäsche kann weniger als eine Minute dauern.

Fahren Sie dann mit der Kultivierung der Embryonen fort, indem Sie das M16-Medium mit einem Tropfen Mineralöl bedecken, um zu verhindern, dass es verdunstet, und jeden Embryo auf eine Plastikkulturschale auf einen Tropfen M16-Medium legen. Beobachten Sie die Embryonen alle 24 Stunden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit 488 Nanometer oder 555 Nanometer DIC-Optik bei 200-facher Vergrößerung. Neogenin wird in den frühen Entwicklungsstadien der Präimplantation vorübergehend exprimiert.

Sie tritt bereits im 2-Zell-Stadium auf und dauert bis zum frühen Morula-Stadium. Seine Expression ist hauptsächlich räumlich auf das Äußere von Zellen beschränkt. Die Neogenin-Expressionsniveaus wurden durch Mikroinjektion von 2-PN-Zygoten mit Neogenin-cDNA-Vektoren oder Vektoren, die kurze Haarnadel-RNA gegen Neogenin enthalten, manipuliert.

RFP und GFP wurden als Indikatoren koexprimiert. Das resultierende Neogenin-Expressionsniveau wurde sowohl durch Immunfluoreszenz als auch durch Immunblotting bestätigt. Es gab keine groben morphologischen Unterschiede weder bei den Neogeninverlust- noch bei den Neogeningewinn-Embryonen, noch entwickelten sie sich unterschiedlich bis zum Blastozystenstadium

Die ICM-Entwicklung war jedoch bei Neogenin-Verlust-Embryonen weniger ausgeprägt, wie positive ICM-Zellen am dritten und vierten Oktober zeigten. Außerdem gab es mehr positive ICM-Zellen pro Blastozyste am dritten und vierten Oktober in den Neogenin-Gewinnembryonen. Diese Beobachtung wurde durch die rtPCR-Analyse weiter bestätigt.

In Neogenin-Gewinnembryonen waren die Expressionen von Oct drei und four, SOX2 und Nanog dramatisch erhöht, im Gegensatz zu einer vernachlässigbaren Expressionsänderung von Cdx2 und Tead4. Sobald dieser Mikroinjektionsteil dieses Protokolls gemeistert ist, kann er in etwa einer Stunde abgeschlossen werden. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, denken Sie daran, dass die 2-PN-Embryonen durch Gefrierschränke mit optimierter Isolierung und Mikroinjektion des Embryos kultiviert werden, um den Schaden zu minimieren.

Ergänzend zu dieser prozeduralen Methode, wie z.B. Medikamentenstudien, können durchgeführt werden, um uralte Fragen über den Signalweg zu beantworten und so weiter.