Quantifizierung von filamentösen Aktin (F-Aktin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Das übergeordnete Ziel dieser Quantifizierung von filamentöser Aktin-Punta in kultivierten Neuronen ist es, eine nützliche Methode zur Untersuchung der Integrität und Kognitivität synaptischer Strukturen einzuführen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften über Spinogenese, synaptische Plastizität und synaptische Stabilität zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein detailliertes Protokoll für die primäre neuronale Kultur nach der Identifizierung und Quantifizierung von F-Aktin-Puncta liefert.

Wenn das Ziel der Erreichung unbekannt ist, ist es notwendig, die allgemeine Integrität der Fundantric-Strukturen der Ratia zu schätzen. Wir hatten die Idee zu dieser Methode zum ersten Mal, als wir die Neuronenschäden untersuchten, die durch Missbrauchsdrogen wie Kokain und HIV-toxische Proteine wie tat und JP 120 verursacht werden. Zwei Tage vor dem Aufbau der Kulturhülle beschichten Sie 12, 35 Millimeter Glasbodenschalen mit zwei Millilitern Poly-L-Lysin-Arbeitslösung. Und lagern Sie das Geschirr über Nacht in der Haube, um ihre Sterilität zu erhalten.

Entsorgen Sie am nächsten Tag das Überzugsmittel und spülen Sie das Geschirr mit doppelt destilliertem Wasser aus. Lassen Sie das Geschirr eine Stunde unter der Haube trocknen. Füllen Sie dann zwei Milliliter Beschichtungsmedium auf jede Schale.

Und die Gerichte über Nacht bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid inkubieren. Legen Sie am Tag der Kultur das entnommene Gehirn in eine Petrischale, die kaltes HBSS enthält. Befestigen Sie dann ein Gehirn mit einer Pinzette und verwenden Sie die gebogene Pinzette, um die Hemisphären zu trennen und die Hirnhäute zu entfernen.

Isolieren Sie die frontale Kortexe und geben Sie die Stücke in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie zwei Milliliter frisches HBSS und 20 Mikroliter Trypsin-EDTA in das Röhrchen und inkubieren Sie das Nervengewebe 10 bis 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Mit sanftem Schwenken alle paar Minuten.

Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine Glaspipette, um alle alten HBSS zu aspirieren. Und spülen Sie die Kortikale zweimal mit frischem HBSS aus. Tauchen Sie das Gewebe nach dem zweiten Waschen in einen Trypsin-Hemmer.

Gut mischen und die Probe fünf Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen. Waschen Sie dann die Taschentücher zweimal mit frischem HBSS. Verwenden Sie nun eine Glaspipette mit einem Gummikolben, um die Gehirnstücke ganz langsam 10 bis 15 Mal zu zerreiben.

Dann wird die Gewebeaufschlämmung mit einer kalibrierten Pipette, die mit einer sterilen Spitze mit reduziertem Durchmesser ausgestattet ist, sehr langsam wieder zerkleinert. Wenn die Lösung homogen ist, plattieren Sie die Zellen in der entsprechenden Dichte in den vorbeschichteten Kulturschalen für eine Inkubation über Nacht im Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie nach 24 Stunden das Beschichtungsmedium durch ein frisch zubereitetes vollständiges Wachstumsserum-freies schmales Basalmedium.

Und stellen Sie die Zellen für mindestens 12 bis 14 Tage in den Zellkultur-Inkubator zurück. Low Density Platinting ist wichtig, um die einzelnen Neuronen sichtbar zu machen. Und das Neuronen-Basalmedium ist entscheidend für die Minimierung der Perforation von Astrocise in den Zellkulturen.

Um die Zellen für die Immunzytochemie zu markieren, waschen Sie die Zellkulturschale mit Glasboden zunächst zweimal mit PBS. Anschließend fixieren Sie die Zellen mit vier Prozent Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Gefolgt von zwei PBS-Waschungen.

Als nächstes permeablizieren Sie die Zellen fünf Minuten lang mit 0,1 Prozent Triton X 100 in PBS und markieren Sie sie mit einem F-Aktin-spezifischen Farbstoff bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Zellen nach 20 Minuten zweimal mit PBS und blockieren Sie jede unspezifische Färbung der Zelloberfläche mit 10% normalem Ziegenserum. Am Ende der Inkubation markieren Sie die Übernachtzellen bei vier Grad Celsius mit einem polyklonalen Anti-Map-Zwei-Antikörper aus dem Huhn.

Spülen Sie die Zellen am nächsten Morgen zweimal mit PBS und markieren Sie sie mit einem entsprechenden Sekundärantikörper. Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur spülen Sie die Zellen erneut mit PBS und markieren Sie sie drei Minuten lang bei Raumtemperatur mit 10 Mikrolitern Huxs. Waschen Sie dann die Zellen zwei letzte Male mit PBS und konservieren Sie sie mit 100 Mikrolitern Anti-Fade-Reagenz.

Schalten Sie innerhalb von drei Tagen nach dieser Färbung das Fluoreszenzmikroskop ein und wählen Sie das 20-fach-Objektiv aus. Stellen Sie anschließend in der Mikroskopsoftware die Pixelbildgröße auf 1600 x 1200 und die Bildauflösung von 0,17 Mikrometern pro Pixel auf 1-fachen Zoom ein. Übertragen Sie die Schale mit den Zellen auf den Mikroskoptisch.

Und nehmen Sie Bilder der co-markierten F-Aktin-Karte 2-Neuronen unter den grün und rot fluoreszierenden Kanälen auf. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, wählen Sie fünf Bilder von einzelnen Neuronen in den grünen, roten und blauen Kanälen mit klar definierten dendritischen Dornen. Und verwenden Sie die Immunfluoreszenz der kontinuierlichen Karte zwei, um die F-Aktin-reichen Strukturen in den dendritischen Segmenten zweiter Ordnung zu identifizieren.

Drehen Sie den ausgewählten Bildbereich horizontal. Kopieren Sie den Bereich und fügen Sie ihn als neues Bild ein. Subtrahieren Sie dann die Fluoreszenz des Bildhintergrunds und verwenden Sie die Software, um die Anzahl der hellgrünen F-Aktin-Puncta zu zählen.

Verwenden Sie geschulte unabhängige Beobachter, um die Länge der ausgewählten dendritischen Segmente zu messen. Exportieren Sie dann die Punktzahlen und die Daten zur Länge der dendritischen Segmente in eine Tabellenkalkulationsdatei. Achten Sie darauf, dass die Beobachter F-Aktin-Haltungspunktchen mit einer rosa Fluoreszenzintensität von mindestens 50 % über der durchschnittlichen Intensität der Färbung im dendritischen Schaft in jedem ausgewählten Segment einbeziehen.

Berechnen Sie schließlich die Dichte gemäß der Formel, indem Sie die Daten als Anzahl der F-Aktin-Puncta pro zehn Mikrometer Dendrit ausdrücken. Hier zeigen differentielle Interferenzkontrastbilder die morphologischen Veränderungen, die bei der Entwicklung von kortikalen Neuronen von Ratten an den Tagen 4 bis 27 en vitro beobachtet wurden. Beachten Sie die Zunahme der Länge und Anzahl der Dendriten, wenn die primären Neuronen der kultivierten Ratte reifen.

Da die Phalloidin-Markierung von F-Aktin sehr schnell erfolgt, ist es möglich, die Integrität des synapto-dendritischen Netzwerks visuell abzuschätzen, bevor mit der immunzytochemischen Antikörpermarkierung fortgefahren wird. Map2 färbt die intakten Dendriten und bestätigt, dass die F-Aktin-Puncta auf den neuronalen Dendriten lokalisiert sind und nicht in anderen Zellen, wie z.B. Astrozyten, lokalisiert sind. In hochauflösenden Bildern können F-Aktin-reiche Strukturen mit Phi-Filopodien, Spine-Vorsprüngen und F-Aktin-Flecken beobachtet werden.

In diesem Experiment zur Beurteilung, ob HIV 1 eine synapto-dendritische Schädigung induziert, zeigte die Map2-Färbung weniger dendritische Äste und ein verringertes F-Aktin in kortikalen Neuronen der Ratte nach der HIV-1-Tat-Behandlung. In der Tat nimmt die Anzahl der F-Aktin-Puncta als Reaktion auf die experimentelle Behandlung zu oder ab. Zum Beispiel erfuhr in diesem Experiment, als die kultivierten Neuronen mit dem nicht kompetitiven NMDA-Rezeptor-Antagonisten Memantin behandelt wurden, die F-Aktin-positiven Puncta eine signifikante Zunahme der Dichte.

Im Gegensatz dazu führte die Behandlung mit einer Kombination aus Methamphetamin plus HIV1-Tat zu einem signifikanten Verlust des F-Aktin puncta. Nach der Aufnahme hochauflösender Bilder der mit Kohle markierten F-Aktin-Map2-Neuronen denken Sie daran, dass zwei geschulte Beobachter Segmente der Dendriten zweiter Ordnung für die Analyse der Punktdichten auswählen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der neurowissenschaftlichen Forschung.

Nicht nur für die Überwachung der akuten Synaptopathie, sondern auch für die Untersuchung der synaptischen Wiederherstellung und experimenteller neuronaler Wiederherstellungsprozesse. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine zuverlässige Methode zur Messung der synaptischen Integrität des neuronalen dendritischen Netzwerks entwickeln können.