Name: Quantifizierung von filamentösen Aktin (F-Aktin) Puncta in Rat Cortical Neurons (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Lernen Sie die Quantifizierung von F-Aktin-Puncta in primären Rattenkortikalneuronen mittels Immunzytochemie und Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Bewertung synaptischer Integrität und Plastizität.

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Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse DA013137, DA031604 und HD043680 finanziert. Teilweise unterstützt wurde dies durch ein NIH T32-Ausbildungsstipendium in Biomedizin-Verhaltenswissenschaften.

Alle Tierprotokolle wurden überprüft und durch die Animal Care und Use Committee an der University of South Carolina (Sicherung Nummer: A3049-01) zugelassen. 1. Low-Density-embryonale neuronale Kultur <ol><li> Vorbereitung für die primäre kortikale Neuronen Kultur <ol><li> Lösungen: <ol><li> Bereiten Poly-L-Lysin-Stammlösung durch Auflösen von 5 mg Poly-L-Lysin in 10 ml Boratpuffer. </li><li> Bereiten Arbeitslösung durch Verdünnen von 1 ml Poly-L-Lysin-Lager auf 49 ml Boratpuffer. </li><li> Bereiten Boratpuffer, pH 8,4, indem sie mit 395 ml dH 2 O beginnt und dann Zugabe aller Bestandteile (1,24 g Borsäure + 1,9 g Borax). Der pH-Wert auf 8,4 bis 1 M NaOH. Passen zu 400 ml und Filter mit 0,2 um Nylonmembranfilter unter der Motorhaube. </li><li> Bereiten HBSS-Lösung, pH 7,2, indem sie mit 445 ml dH 2 O beginnt und das Hinzufügen alle anderen Zutaten (50 ml 10X HBSS Auf + 1,2 g HEPES). Der pH-Wert auf 7,2 mit 1 N HCl, bring bis 500 ml und Filter mit 0,2 um Nylonmembranfilter unter der Motorhaube. </li><li> Bereiten Plattenmedium: DMEM / F12 mit 10% fötalem Rinderserum. Filter mit 0,2 um Nylonmembranfilter unter der Motorhaube. </li><li> Bereiten komplette Wachstumsmedium: Zu 50 ml Neurobasalmedium, fügen Sie die Ergänzungsmittel (500 ul GlutaMAX (100X) + 500 ul Glucose + 1 ml B-27 (50x) + 500 ul Antibiotika-Antimykotika-Lösung (100X) + 100 ul 7,5% Natriumbicarbonat. Filter mit 0,2 um Nylonmembranfilter unter der Motorhaube. </li></ol></li><li> Zwei Tage vor Kultur: <ol><li> Mantel zwölf 35 mm Glasbodenschalen mit 2 ml Poly-L-Lysin-Arbeitslösung, und halten unter der Haube O / N. </li></ol></li><li> Einen Tag vor Kultur: <ol><li> Leere Beschichtungsmittel aus den Schalen und spülen mit ddH 2 O. Lassen Gerichte für eine Stunde unter der Motorhaube zu trocknen. </li><li> Bereiten Plattenmedium (DMEM / F12 mit 10% fötalem Rinderserum (10% der Gesamtlösung). Pipette 2 ml Medium injedes Gericht, und O / N bei 37 ° C, 5% CO 2 inkubiert. Hinweis: Es ist wichtig, Kunststoff-Kulturschalen zu vermeiden, wenn die Kultivierung. Die Verwendung von Glasbodenschalen (für inverse Mikroskope) oder Deckgläser (für aufrechte Mikroskope) liefert scharfe und klare Bilder. Im Vergleich zu einem Kunststoff-Bodenschale, die Glasbodenschale verhindert unerwünschte Farbtöne oder Blendung während der Fluoreszenzmikroskopie. </li></ol></li></ol></li><li> Zellkultur-Protokoll: <ol><li> Put gekühlt HBSS Puffer (100-150 ml), 100 mm-Petrischalen, Pinzetten, Scheren, 50 ml-Röhrchen und 15-ml-Röhrchen unter UV-Licht in der Haube. </li><li> Euthanize trächtigen Ratten mit tödlichen Einatmen von 5% Sevofluran unter der Haube außerhalb von Kulturraum. </li><li> Sterilisieren mit 70% EtOH, Zelt der Haut der Unterleib einer Pinzette, während aus dem Schwanz Zerschneiden in der Mitte der Bauch cavity.Open die Gebärmutter einer Schere, die Plazenta zu belichten. </li><li> Entfernen 8-10 E18 Föten. Place 8-10 Föten in Petrischalen mit HBSS-Lösung. </li><li> Halten Sie die Rückseite des Kopfes des Fötus mit einer Pinzette, dann mit einer Schere den Kopf vom Körper zu trennen. Legen Sie sie in eine andere Petrischale gefüllt mit 7.5 ml HBSS. Übertragen Gericht Kapuze. </li><li> Füllen Sie zwei weitere 100-mm-Petrischale mit kaltem HBSS. </li><li> Peel beiseite Schädel, und Schaufel Gehirn in eine neue Petrischale mit HBSS gefüllt. </li><li> Scharfe gebogenen Pinzette, separater Kleinhirn und Hirnstamm aus Gehirn, dann übertragen Gehirn auf eine neue Petrischale mit kaltem HBSS darin. </li><li> Verwenden einer Pinzette zu sichern, trennen Sie die Halbkugeln mit einer gebogenen Pinzette. Entfernen Hirnhaut; isolieren frontalen Kortex und Transfer Stücke in markierte 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Füllen Sie die 15-ml-Röhrchen mit frischem 2 ml HBSS und fügen Sie 20 ul Trypsin-EDTA (10x konzentrierte Mischung mit 0,5% Trypsin und 5,3 mM EDTA.) Zu jedem 15-ml-Tube. </li><li> Inkubieren 10-15 Minuten bei Raumtemperatur. Sanft Rohr alle paar Minuten wirbeln, erlauben nicht nieder. </li><li> After 10-15 min, Pipette Verwendung Glas alt HBSS und spülen Sie zweimal mit neuen HBSS zu entfernen. </li><li> Tauchen Sie ein in Trypsin-Inhibitor (1 mg / ml, 2 mg Trypsin-Hemmstoff in 2 ml HBSS), gut mischen und lassen Sie es 5 Minuten sitzen. Zweimal waschen mit frischem HBSS. </li><li> Mit Glaspipette mit Gummiball, verreiben Gehirn Stücke 10-15 mal sehr langsam, so dass bubbles.Triturate wieder mit einem kalibrierten Pipette und eine sterile Spitze mit einer reduzierten Spitzendurchmesser sehr langsam, bis sie homogen zu vermeiden. </li><li> Transfer dissoziierten Zellen auf gewünschte Dichte vorzunehmen vorbereitet beschichteten Kulturschalen (50 Zellen / mm 2). O / N bei 37 ° C, 5% CO2 inkubiert. </li><li> Nach 24 Stunden DMEM / F12-Medium mit frisch zubereiteten kompletten Wachstum Serum-freien Neurobasalmedium ersetzen. </li><li> Pflegen der Zellen zu allen Zeiten in einem 5% CO 2/95% Raumluft befeuchteten Inkubator für mindestens 12-14 Tage vor dem Experiment. Ergänzen Sie die Zellen alle 5-6 Tage mit frischem Neurobasalmedium etwa 50% der alten Medium zu ersetzen. </li></ol></li></ol> 2. Fluoreszenzmarkierung und Immunzytochemie Hinweis: Die Immunfluoreszenz-Markierung von primären kortikalen Zellkulturen wurden in Glasboden 35 mm Zellkulturschalen mit einem Arbeitsvolumen von 1 ml durchgeführt. <ol><li> Waschen Sie die Glasbodenschale zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 (PBS). </li><li> Fix Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 15 min bei RT. </li><li> Wasche die Zellen zweimal mit PBS und permeabilisieren mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 5 min. </li><li> Behandlung von Zellen für 20 min bei RT mit einem F-Actin-spezifischen Farbstoffs, AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40 25 ul Phalloidin in 1 ml PBS). </li><li> Spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS und Blockieren mit 10% normalem Ziegenserum bei RT für 1-2 Std. </li><li> Verdünnen Sie das Huhn polyklonalen anti-MAP2 Antikörper (1: 2500) in PBS mit 2% normalem Ziegenserum und Inkubation O / N bei 4 o C </li><li> Nach der Inkubation spülen zweimal in PBS. </li><li> Verdünnen Sie die Sekundär-Antikörper (Alexa Red 594-konjugiertem Ziege-anti-Huhn-IgG (1: 500) mit 2% normalem Ziegenserum und 2 h bei RT inkubiert. </li><li> Spülen mit PBS und fügen Sie 10 ul / Schale von Hoechst-Farbstoff. </li><li> Inkubieren 3 min bei RT und waschen mit PBS zweimal. Hinweis: Die jetzt markierten Zellen bereit für Schritt 3 (F-Actin puncta Zählung). </li><li> Preserve Zellprobe mit 100 ul Antifade-Reagenz als Eindeckmittel und halten bei 4 ° C im Dunkeln für langfristige Lagerung. Anmerkung: Phalloidin ist relativ stabil in PBS bei +4 ° C im Dunkeln für bis zu 1 Woche und Fluoreszenz kann mit Antifade Eindecken Reagenzien konserviert werden. Allerdings sind optimale Bilder von 1-3 Tagen nach der Färbung erhalten seit Phalloidin kann mit längerer Lagerung zu diffundieren beginnen. </li></ol> 3. F-Aktin Puncta Zählen <ol><li> Schalten Sie Fluoreszenzmikroskop und wechseln Sie in 20 × Ziel. Offene Mikroskop-Software und Programm bei 1280 × 960 Pixel Bildgröße einrichten und 0,17 um / Pixel Bildauflösung bei 1-facher Zoom. </li><li> Erwerben Sie Bilder von Co-markierten F-Actin / MAP2 Neuronen unter Grün (495 nm) / Rot (613 nm) Fluoreszenz-Kanäle. </li><li> Wählen Sie 5 Green (F-Actin) / Rot (MAP2) immun / Blue (Hoechst) Fluoreszenzbilder der einzelnen Neuron mit klar definierten dendritischen Dornen. </li><li> Identifizieren Sie die F-Actin reichen Strukturen in zweiter Ordnung dendritischen Segment (Längenbereich von 25 bis 75 &amp; mgr; m) mit kontinuierlicher MAP2 Immunfluoreszenz. </li><li> Drehen Sie den ausgewählten Bereich der Bilder auf einer horizontalen Ebene. Kopieren und Einfügen als neues Bild. </li><li> Ziehen Sie den Hintergrund der Bilder, eine konsistente Einstellungen für jedes Gericht verwenden. </li><li> Zählen Sie die hellgrüne F-Actin puncta und Spuren die Länge der ausgewählten dendritischen Segment manuell durch geschultes unabhängige Beobachter. Exportieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsdatei. </li><li> Berechnen der Dichte durch Dividieren Gesamt F-Aktin gekennzeichnet puncta (N) durch die Länge (L) der MAP2 Dendriten bezeichnet. Express-Daten als Anzahl von F-acZinn puncta pro 10 &amp; mgr; m von Dendriten Anmerkung: Puncta (Größe ≤1.5 um) von F-Actin-Fluoreszenz mit einer Spitzenintensität von mindestens 50% über dem durchschnittlichen Intensität der Färbung in den dendritischen Welle wurden in jedem ausgewählten dendritischen Segment enthalten. </li></ol>

<ol><li>Heller, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+anatomy+of+cortical+inhibitory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses.</a> PLoS One. 7, e39572(2012).</li>
<li>Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+clustering+of+glutamate+and+gamma-aminobutyric+acid+receptors+opposite+terminals+releasing+the+corresponding+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).</li>
<li>Johnson, O. L., Ouimet, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+actin+in+dendritic+spine+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation.</a> Brain Res. 1113, 1-9 (2006).</li>
<li>Rao, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+between+the+actin+cytoskeleton+and+the+postsynaptic+density+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines.</a> Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).</li>
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<li>Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+cytoskeleton+in+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis.</a> Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).</li>
<li>Zhang, W., Benson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+synapse+development+defined+by+dependence+on+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stages of synapse development defined by dependence on F-actin.</a> J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).</li>
<li>Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Tat+protein+variants%3A+Critical+role+for+the+cysteine+region+in+synaptodendritic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury.</a> Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptodendritic+recovery+following+HIV+Tat+exposure%3A+neurorestoration+by+phytoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens.</a> J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).</li>
<li>Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+filopodia+by+direct+local+elevation+of+intracellular+calcium+ion+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration.</a> J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).</li>
</ol>

Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte zu deklarieren.

In diesem Protokoll beschreiben Züchten wir Ratte kortikalen Neuronen bei geringer Dichte in 35 mm Glasboden-Gerichte, die uns Dendriten von einzelnen Neuronen zu identifizieren. Als nächstes benutzen wir Phalloidin und MAP2 Färbung zu dendritischen Änderungen erkennen. Dann haben wir spezialisierte Software-Änderungen in F-Actin puncta zu quantifizieren. Um Änderungen in F-Aktin puncta bestimmen, muss das gesamte neuronale Netzwerk eines einzelnen Neurons deutlich sichtbar, ermöglicht diese...

Das primäre Ziel dieser Studie ist es, eine zuverlässige Methode zur Messung (Schätzung) der synaptischen Integrität der neuronalen dendritischen Netzwerk zu entwickeln. Hier beschreiben wir die Quantifizierung von F-Actin puncta in primären Ratten kultivierten Neuronen eine Kombination von Phalloidin-Färbung verwendet und immunzytochemische (ICC) Erkennung von Dendriten mit anschließender Analyse mit speziellen (NIS-Elements) Software. Markierten Phallotoxine haben ähnliche Affinität für sowohl große als auch kleine Filamente (F-Actin), aber binden nicht an monomeren globulären Actin (G-Actin), im Gegensatz zu einigen Aktin Antikörper 1. Die unspezifische Bindung von Phalloidin vernachlässigbar ist, so minimal Hintergrund während der zellulären Bildgebung bietet. Phalloidin ist viel kleiner als Antikörper, die normalerweise verwendet werden würde zelluläre Proteine ​​für Fluoreszenzmikroskopie zu kennzeichnen, die durch Phalloidin für viel intensiver Markierung von F-Aktin ermöglicht. So detaillierte Bilder von F-Actin-Lokalisierung in Neuronen seindurch die Verwendung von markiertem Phalloidin erhalten. Phalloidin (F-Actin) Färbung der neuronalen Dendriten erzeugt diskrete &quot;Hot Spots&quot; oder hell &quot;puncta&quot;, die eine Vielzahl von dendritischen Strukturen darstellen, einschließlich reifen Stacheln, nicht stachelig Synapsen 2 und unreif Stacheln. Unreife Stacheln sind dünn Filopodien und einige Formen von Patch-Morphologie und kann die Einleitung spinogenesis 3 darstellen. Unreife Stacheln und nicht stachelig Patches fehlen PSD95 4. Veränderungen in der Produktion von F-Aktin führen zu Änderungen in nachfolgenden nicht nur Stacheln sondern auch zusätzliche dendritischen Strukturen, wodurch Phalloidin ein wichtiges Werkzeug für synaptodendritic Integrität 5-7 untersucht. In der Regel Zahlen von Phalloidin-positive (F-Actin) puncta reflektieren ein Gleichgewicht unter den aktiven Synapsen (erregenden und hemmenden), Aktindynamik und Synapse Stabilität 8. Zwar ist es wichtig, spezifische t zu studierenypen von Synapsen (dh exzitatorischen Stacheln), wenn das Ziel der Behandlung ist es notwendig, nicht bekannt ist, zuerst die allgemeine Integrität einer Vielzahl von dendritischen Strukturen schätzen. Da F-Aktin ist eine Hauptkomponente von dendritischen Dornen und anderen Strukturen, einschließlich hemmende Synapsen, einer veränderten Anzahl von F-Aktin puncta eine Synaptopathie hinweisen. Diese Synaptopathie kann dann weiter für mehr spezifische Veränderungen untersucht werden. Unsere Quantifizierungsmethode mehrere synaptischen Arten / Strukturen zum Nachweis ergibt eine Gesamtschätzung von dendritischen synaptischen Veränderungen (Zunahmen und Abnahmen) nach verschiedenen experimentellen Behandlungen.

<table><tbody><tr><td>35 mm Glasbodenschalen Nr. 1,5 Deckglas</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Borax</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>100X</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td>10X</td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Ergänzung</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>50X</td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotisch Lösung</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Life Technologies</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Schere</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Iris Schere</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Iris Pinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Pinzette</td><td>Welt Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Normales Pferdeserum</td><td>Life Technologies</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>Polyklonales Huhn Anti-MAP2</td><td>abcam</td><td>Ab92434</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Red 594-konjugiertes Ziegen-Anti-Huhn</td><td>IgG Life Technologies</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Lebendzellfärbung ReadyProbes Reagenz Hoescht 33342</td><td>Life Technologies</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Softwarepaket</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-E inverses computergesteuertes Fluoreszenzmikroskop&nbsp;</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; m Nalgene Nylon-Membranfilter</td><td>Fishersci</td><td>151-4020</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifizierung von filamentösen aktin (f-aktin) puncta in rat cortical neurons

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentösen Aktin-Protein (F-Actin) spielt eine wichtige Rolle in spinogenesis, synaptischer Plastizität und synaptischen Stabilität. Änderungen in dendritischen F-Actin-reichen Strukturen deuten darauf hin, Veränderungen der synaptischen Integrität und Konnektivität. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Kultivierung von primären Ratten-kortikalen Neuronen, Phalloidin-Färbung für F-Actin puncta und anschließende Quantifizierung Techniken. Zuerst werden die frontalen Kortex von E18-Rattenembryos dissoziiert in Low-Density-Zellkultur, dann die Nervenzellen in vitro gezüchtet mindestens 12-14 Tage. Folgenden experimentellen Behandlung werden die kortikalen Neuronen gefärbt mit AlexaFluor 488 Phalloidin (die dendritische F-Aktin puncta zu markieren) und Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2; die neuronalen Zellen und dendritischen Integrität zu validieren). Schließlich wird spezielle Software zu analysieren und zu quantifizieren zufällig ausgewählten neuronalen Dendriten verwendet. F-Actin reichen Strukturen sind auf zweiter Ordnung dendritischen Verzweigungen (Längenbereich 25-75 identifiziert &amp;# 181; m) mit kontinuierlicher MAP2 Immunfluoreszenz. Das Protokoll hier vorgestellt wird eine nützliche Methode zur Untersuchung von Veränderungen in dendritische Synapse Strukturen im Anschluss an experimentellen Behandlungen.

In den vorliegenden Verfahren haben wir zunächst Kultur Ratte kortikalen Neuronen bei geringer Dichte in 35 mm Glasboden-Gerichte, die uns die Dendriten der einzelnen Neuronen zu identifizieren. In 1 zeigt das Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Bilder, um die morphologischen Veränderungen an den Tagen fötalen Ratte kortikalen Neuronen Entwicklungs 4, 6, 10, 14, 21 und 27 in vitro. Beachten Sie, dass die Länge und Anzahl der Dendriten erhöhen mit der Reifung...

Filamentöses Aktin (F-Aktin) spielt eine wichtige Rolle bei der Spinogenese, der synaptischen Plastizität und der synaptischen Stabilität. Die Quantifizierung von F-Aktin puncta ist daher ein nützliches Werkzeug, um die Integrität synaptischer Strukturen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Quantifizierung von mit Phalloidin markierten F-Aktin-Puncta in primären kortikalen neuronalen Kulturen mit geringer Dichte.

Quantifizierung von filamentösen Aktin (F-Aktin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Das übergeordnete Ziel dieser Quantifizierung von filamentösem Aktin-Punkten in kultivierten Neuronen besteht darin, eine nützliche Methode zur Untersuchung der Integrität und Kognitivität synaptischer Strukturen einzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften bezüglich der Spinogenese, synaptischen Plastizität und synaptischen Stabilität zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein detailliertes Protokoll für die primäre Neuronenkultur sowie die Identifizierung und Quantifizierung von F-Aktin-Punkten bereitstellt.Wenn das Ziel der Untersuchung unbekannt ist, ist es notwendig, die allgemeine Integrität der retinalen Fundamentstrukturen abzuschätzen. Wir hatten die Idee zu dieser Methode erstmals, als wir die durch Suchtstoffe wie Kokain sowie durch toxische HIV-Proteine wie tat und JP 120 verursachten Neuronenschäden untersuchten. Zwei Tage vor dem Aufbau der Kultur beschichten Sie 12, 35-Millimeter-Glasbodenkulturschalen mit zwei Millilitern Poly-L-Lysin-Arbeitslösung und lagern die Schalen über Nacht im Sicherheitswerkbank, um deren Sterilität aufrechtzuerhalten.Am nächsten Tag das Beschichtungsmedium verwerfen und die Schalen mit doppelt destilliertem Wasser spülen. Die Schalen eine Stunde lang unter dem Abzug trocknen lassen. Anschließend zwei Milliliter Plattenmedium in jede Schale geben.Und inkubieren Sie die Petrischalen über Nacht bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Am Tag der Kultur geben Sie das geerntete Gehirn in eine Petrischale mit kaltem HBSS. Befestigen Sie dann das Gehirn mit einer Pinzette und verwenden Sie die gebogene Pinzette, um die Hemisphären zu trennen und die Hirnhäute zu entfernen.Isolieren Sie die frontalen Kortizes und überführen Sie die Gewebestücke in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie zwei Milliliter frisches HBSS und 20 Mikroliter Trypsin-EDTA in das Röhrchen und inkubieren Sie das neuronale Gewebe 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur, wobei alle paar Minuten vorsichtig geschwenkt wird.Am Ende der Inkubation alle alte HBSS mit einer Glaspipette absaugen. Die Kortizes zweimal mit frischer HBSS spülen. Nach der zweiten Wäsche das Gewebe in Trypsininhibitor eintauchen.Gut mischen und die Probe fünf Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen. Anschließend die Gewebe zwei Mal mit frischem HBSS waschen. Nun die Gehirnstücke mit einer Glaspipette und Gummiball langsam 10 bis 15 Mal auf- und abpipettieren.Danach das Gewebepulver mit einer kalibrierten Pipette, die mit einer sterilen Spitze mit reduziertem Durchmesser ausgestattet ist, erneut sehr langsam auf- und abpipettieren. Sobald die Lösung homogen ist, die Zellen in der geeigneten Dichte auf die vorbeschichteten Kulturschalen ausplattieren und über Nacht im Zellkultur-Inkubator inkubieren. Nach 24 Stunden das Ausplattiermedium durch frisch zubereitetes, vollständiges, serumfreies, eng begrenztes Basalmedium ersetzen.Und inkubieren Sie die Zellen für mindestens 12 bis 14 Tage im Zellkulturinkubator. Die Plattenung mit geringer Dichte ist wichtig, um einzelne Neuronen sichtbar zu machen. Und das neuronale Basalmedium ist entscheidend, um die Perforation von Astrozellen in den Zellkulturen zu minimieren.Um die Zellen für die Immunzytochemie zu markieren, spülen Sie die Zellkulturschale mit Glasboden zunächst zwei Mal mit PBS. Danach fixieren Sie die Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur mit vierprozentigem Paraformaldehyd, gefolgt von zwei weiteren PBS-Spülgängen.Anschließend permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1 Prozent Triton X-100 in PBS für fünf Minuten und färben sie bei Raumtemperatur mit einem F-Aktin-spezifischen Farbstoff. Nach 20 Minuten spülen Sie die Zellen zwei Mal mit PBS ab und blockieren jegliche unspezifische Zelloberflächenfärbung mit 10 % normalem Ziegenserum. Am Ende der Inkubation färben Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius mit einem polyklonalen Hühner-Antikörper gegen MAP2.Am nächsten Morgen die Zellen zwei Mal mit PBS spülen und mit dem entsprechenden sekundären Antikörper markieren. Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur die Zellen erneut mit PBS spülen und für drei Minuten bei Raumtemperatur mit 10 Mikrolitern huxs markieren. Anschließend die Zellen abschließend zwei Mal mit PBS waschen und mit 100 Mikrolitern Anti-Fade-Reagenz konservieren.Innerhalb von drei Tagen nach dieser Färbung das Fluoreszenzmikroskop einschalten und das 20×-Objektiv auswählen. Anschließend im Mikroskop-Software die Pixel-Bildgröße auf 1600 × 1200 und die Bildauflösung von 0,17 Mikrometern pro Pixel auf 1×-Zoom einstellen. Die Zellkultur-Schale auf den Mikroskoptisch übertragen.Und gewinnen Sie Bilder der co-markierten F-Aktin-Map-2-Neurone in den grünen und roten fluoreszierenden Kanälen. Sobald alle Bilder erhalten wurden, wählen Sie fünf Bilder einzelner Neurone in den grünen, roten und blauen Kanälen mit klar definierten dendritischen Bäumen aus und verwenden Sie die kontinuierliche Map-2-Immunfluoreszenz, um die F-Aktin-reichen Strukturen in den dendritischen Segmenten zweiter Ordnung zu identifizieren.Drehen Sie den ausgewählten Bildbereich horizontal und kopieren Sie diesen Bereich als neues Bild. Anschließend subtrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenz des Bildes und zählen mithilfe der Software die Anzahl der hellgrünen F-Aktin-Punkte.Verwenden Sie geschulte unabhängige Beobachter, um die Länge der ausgewählten dendritischen Segmente zu messen. Anschließend exportieren Sie die Anzahl der Pünktchen sowie die Daten zur Länge der dendritischen Segmente in eine Tabellenkalkulationsdatei. Stellen Sie sicher, dass die Beobachter F-Aktin-Postur-Pünktchen mit einer rosa Fluoreszenzintensität von mindestens 50 % über der durchschnittlichen Intensität der Färbung im dendritischen Schaft in jedem ausgewählten Segment einbeziehen.Berechnen Sie abschließend die Dichte gemäß der Formel und geben Sie die Daten als Anzahl der F-Aktin-Punkte pro zehn Mikrometer Dendrit an. Hier zeigen Differenzinterferenzkontrast-Aufnahmen die morphologischen Veränderungen, die in sich entwickelnden kortikalen Fetalneuronen von Ratten im Kulturzeitraum von Tag 4 bis 27 beobachtet wurden. Beachten Sie die Zunahme von Länge und Anzahl der Dendriten, während sich die kultivierten primären Rattenneuronen weiterentwickeln.Da die Phalloidin-Färbung von F-Aktin sehr schnell ist, kann die Integrität des synapto-dendritischen Netzwerks visuell beurteilt werden, bevor mit der immunzytochemischen Antikörper-Färbung fortgefahren wird. Map2 färbt intakte Dendriten und bestätigt so, dass die F-Aktin-Punkte auf neuronalen Dendriten liegen und nicht in anderen Zellen wie Astrozyten lokalisiert sind. In hochauflösenden Bildern können F-Aktin-reiche Strukturen, die Phi-Filopodien, Dornfortsätze und F-Aktin-Flecken enthalten, beobachtet werden.In diesem Experiment zur Beurteilung der von HIV-1-Tat induzierten synapto-dendritischen Schädigung zeigte die Map2-Färbung weniger dendritische Fortsätze und eine verminderte F-Aktin-Ausprägung in kortikalen Rattenneuronen nach Behandlung mit HIV-1-Tat. Tatsächlich nimmt die Anzahl der F-Aktin-Punkte je nach experimenteller Behandlung zu oder ab. Beispielsweise stieg in diesem Experiment die Dichte der F-Aktin-positiven Punkte signifikant an, als die kultivierten Neuronen mit dem unkopetitiven NMDA-Rezeptorantagonisten Memantin behandelt wurden.Im Gegensatz dazu führte die Behandlung mit einer Kombination aus Methamphetamin und HIV1-tat zu einem signifikanten Verlust der F-Aktin-Punkte. Nach der Aufnahme von hochauflösenden Bildern der mit Kohle markierten F-Aktin-Map2-Neuronen sollten zwei geschulte Beobachter Segmente der dendritischen Fortsätze zweiter Ordnung zur Analyse der Punkt-Dichten auswählen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der Neurowissenschaftenforschung.Nicht nur zur Überwachung akuter Synaptopathien, sondern auch zur Untersuchung der synaptischen Erholung und experimenteller neuraler Wiederherstellungsprozesse. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine zuverlässige Methode zur Messung der synaptischen Integrität des neuronalen dendritischen Netzwerks entwickelt.

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Neurowissenschaften

Dieses Protokoll beschreibt, wie zu Synapse Anzahl sowohl in dissoziierten neuronalen Kultur und in Hirnschnitten mittels Immunzytochemie quantifizieren. Mit Fach-spezifische Antikörper, label wir präsynaptischen Terminals sowie Standorte der postsynaptischen Spezialisierung. Wir definieren Synapsen als Punkte der Kolokalisation zwischen den Signalen, die von dieser Marker erzeugt.

Die Quantifizierung der Synapsen: eine Immunzytochemie-basierten Assay zur Synapse Anzahl Quantify

Eine Methode zur Visualisierung und Quantifizierung von F-Aktin Stacheldraht endet in neuronale Wachstum Kegel beschrieben. Nach Kultivierung Neuronen auf Deckgläschen werden die Zellen mit einer Saponin-haltigen Lösung permeabilisiert. Dann enthält eine kurze Inkubation mit dem Saponin-Puffer mit Rhodamin-Aktin fluoreszierende Aktin auf freien Aktin Stacheldraht endet.

Labeling F-Aktin Barbed Endet mit Rhodamin-Aktin in permeabilisierten Neuronale Growth Cones

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur fluoreszierenden Färbung von kortikalen Neuronen von Ratten für die Mikroskopie. Es zielt auf F-Aktin und dendritische Proteine ab, um die strukturelle Integrität zu analysieren und die F-Aktin-Dichte zu berechnen, die für die Untersuchung der neuronalen Funktion und Gesundheit entscheidend ist.

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Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Frühen Endosom Funktionen hängen F-Aktin-Polymerisation. Hier beschreiben wir einen Mikroskopie-basierte in-vitro- Assay, der Keimbildung und Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomal Membranen in den Reagenzgläsern, wiederherstellt wodurch dieser komplexen Abfolge von Reaktionen zu biochemischen und genetischen Manipulationen.

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Modifizierte Roller Schlauch Methode genau lokalisierte und sich wiederholende intermittierende Bildgebung während langfristige Kultur Gehirnscheiben im geschlossenen System

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Ein zeiteffizienter Fluoreszenzspektroskopie-basierter Assay zur Bewertung des Actin-Polymerisationsstatus in Nagetier- und menschlichem Hirngewebe

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

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DetectSyn ist ein unvoreingenommener, schneller fluoreszierender Assay, der Veränderungen der relativen Synapsenzahl (prä- und postsynaptisches Engagement) über Behandlungen oder Krankheitszustände hinweg misst. Diese Technik verwendet eine Proximity-Ligationstechnik, die sowohl in kultivierten Neuronen als auch in festem Gewebe eingesetzt werden kann.

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Quantifizierung von filamentösen Aktin (F-Aktin) Puncta in Rat Cortical Neurons

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