Name: In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-08T15:00:01.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Erfahren Sie biolumineszente Calcium-Imaging in Drosophila für funktionelle Neurobiologie mit GFP-Aequorin. Diese Methode ermöglicht langzeitige Bildgebung tiefer Gehirnstrukturen ohne Photobleaching.

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Wir sind E. Karplus von Sciences Wares, USA, für seine wertvolle und nützliche Hilfe und Ratschläge zu Dank verpflichtet. Wir danken E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier und J. Stinnakre für ihren Beitrag zur Entwicklung und Verbesserung dieser Technik. Wir danken auch B. Pfeiffer und G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, für die Linie pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Chateaubriand Fellowship, Französische Botschaft, Washington, USA an A. Lark, durch die National Science Foundation (IOS 1352882) an T. Kitamoto und durch die französischen ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, und FlyBrainImaging, 2011), den Conseil Régional Ile-De France (NeRF und DIM), das IFR-144, das Physique-Chimie-Biologie Interface Program des CNRS (2009), und vom CNRS, Frankreich an JR Martin.

1. Herstellung der Proben <ol><li> Herstellung von Lösungen und Einrichten <ol><li> Pflegen Sie alle Drosophila melanogaster Linien bei 24 ° C auf Standard-Lebensmittelmedium. Rear und halten sie in geringer Dichte in der Ampulle, standardisierte Größe und das Gewicht von Fliegen zu erzeugen. <ol><li> In 10 jungfräulichen Weibchen mit 10 Männern in einem Fläschchen, lassen Sie sie sich paaren und übertragen Sie alle 2 Tage in ein frisches Röhrchen. Dann wurden 10 Tage später, als die Fliegen beginnen zu schlüpfen, ernten die Fliegen jeden Tag. Halten Sie eine genaue Aufzeichnung der im Alter von den Fliegen und halten sie in gutem Zustand. </li><li> Am Tag 3, trennen Sie die Männchen von den Weibchen und halten die Weibchen 20 Fliegen pro Fläschchen. Nehmen Sie die Fliegen bei 4 oder 5 Tage alt. </li></ol></li><li> Vorbereitung Ringerlösung mit den folgenden Konzentrationen: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM HEPES und 36 mM Saccharose und den pH-Wert der Lösung genau 7.3. Bereiten Perfusionslösungen von 25 μ; M Nikotin und 100 mM KCl in Ringer-Lösung. </li><li> Bereiten 1.000 ul Pipettenspitze: mit einer Rasierklinge Form Spitze bis schräg (ca. 35 ° vom Ende der Spitze), und entfernen Sie überschüssige Base über 1 ½ Zentimeter von der Spitze. </li><li> Vorbereitung Kasten für die Lagerung (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) der Probe während der Inkubation. Legen Sie zwei Schwämme (12 cm x 8 cm x 3 cm) mit Wasser gesättigt in Boden unter einem kleinen Rack Gerät [auf Probe Austrocknung zu verhindern], um die Proben auf ihre Vorbereitung abgeschlossen zu platzieren. </li><li> Bereiten Fliegen Proben, so dass sie mindestens 1 Kopie des UAS-GFP-Aequorin und eine Kopie eines Gal4 Linie Expression von GFP-Aequorin zu fahren. OK107 Gal4 Linie (eine Linie die Expression vor allem in den Pilzkörpern) mit UAS-GFP-Aequorin in dieser Zubereitung gekreuzt. HINWEIS: Das Innere der Box muss wasserfest sein und die Außenseite muss Licht in Box, um den Abbau von Coelenterazin während der Inkubation zu verhindern blockieren. </li></ol></li><li> Preptung von Proben <ol><li> Eis anästhesiert Drosophila indem sie in eine Glasampulle und auf Eis für 2 min zu halten, bevor sie an der gekühlten Petrischale zur Positionierung in der Pipettenspitze bewegt. Bereiten Pipettenspitzen auf leicht angefeuchteten Filterpapier in 100 ml Petrischale auf Eis unter dem Dissektionsmikroskop. </li><li> Vorsichtig mit einer Pinzette Ort fliegen Innenseite Pipettenspitze. </li><li> Mit einem Pinsel vorsichtig schieben und ausrichten fly so dass der Kopf vollständig über den Rand der Spitze und der Rückenbereich ist teilweise durch den Abschnitt während der Spitzenformung (2B) entfernt ausgesetzt. </li><li> Kombinieren eine kleine (ungefähr 3-4 &amp; mgr; l) Abschnitte der beiden Komponenten des Dentalkleber. Tragen Sie den Klebstoff vorsichtig um die vorderen und hinteren Kopf und Hals auf und rund um die Pipettenspitze Kante - die Vermeidung der Krone des Kopfes. Lassen Sie den Kleber trocken für 2 min. </li><li> Platz Pipettenspitze mit geklebten fly durch Loch im Aufnahmeraum (2D) und Gen-tly drücken, um an Ort und Stelle zu sichern. </li><li> Kombinieren Sie die beiden Komponenten der Silikonkleber (ungefähr 3-4 &amp; mgr; l). Leim auf der flachen Seite der Kammer entlang der Kante, wo die Kammer und Pipettenspitze treffen, um Leck von der Ringerlösung zu verhindern. Lassen Sie den Kleber trocken für 2 min. </li></ol></li><li> Präparation <ol><li> Bringen Sie Klebeband über die Perfusionskanal kurzen Kante und sich an der Rückseite der Kammer. </li><li> Zeigen Kammer mit Fliege auf Dissektion Block unter dem Mikroskop wiederum auf Leuchtstofflampe. Pipettieren 1 ml Ringer-Lösung in die Kammer. </li><li> Verwenden Sie feine chirurgische Messer, um Nagelhaut entfernen. Machen parallele Einschnitte von der Rückseite des Kopfes, um anten Region. Dann entlang der Kante des Auges geschnitten dann einen senkrechten Schnitt über Antenne, welche die früheren Inzisionen. Einen endgültigen Schnitt parallel zu der an der Rückseite des Kopfes. Mit den feinen scharfen Pinzette Kutikula (2C) zu entfernen. </li><li> Verwenden Sie feinen scharfen Pinzette vorsichtig greifen eind entfernt ausgesetzt klar abgeschlagen Atemwegsgewebe, bis das Gehirn und [fluoreszierenden] Pilzkörper wird übersichtlich visualisiert. </li><li> Verwenden Sie ultra-scharfen Pinzette vorsichtig greifen und kneifen abdeckt Gehirn, um für die Permeation des Coelenterazin ermöglichen neuroepithelialen Gewebe. HINWEIS: Alternativ Papain kann die Neuroepithels 9 permeabilisiert werden. </li><li> Unter Verwendung einer Pipette, waschen zweimal mit Ringer-Lösung, um alle Fremdkörper aus Präparation und Ort Probe im dunklen Kasten zu entfernen. </li><li> Pipette 1 ml Ringer-Lösung, die 5 uM benzyl-Coelenterazin in die Kammer. Schließen Sie die Box und lassen Inkubation mit Coelenterazin bei RT für ein Minimum von 2 Stunden. </li></ol></li></ol> 2. Imaging <ol><li> Konfiguration <ol><li> Starten Sie die Aufnahme-System: Schalten Sie Mikroskop, Computer, Kamera und Entwässerungssystem und stellen Raum Umweltkontrollen bis 25 ° C. </li><li> Offene Measurement and Automation Explorer-Programm auf dem Computer. Klicke auf &amp;#8220; Geräte und Schnittstellen &quot;, doppelklicken Sie dann auf&quot; NI Motion Devices &quot;und schließlich klicken Sie rechts auf&quot; PCI-7334 &quot;und wählen Sie&quot; Gerät initialisieren &quot;. </li><li> Öffnen Photon Imager. Neuen Ordner anlegen und benennen erste Aufnahmedatei. Kamera darf -80 ° C zu erreichen, bevor System wird funktionieren. </li><li> Richten Sie Perfusionssystem - fügen KCl, Nikotin und Ringer-Lösung zu Lagerstätten und so das jeder Lösung Entladungen bei 2 ml / min einzustellen. Mit Lösung Ringer vor Beginn der Experiments waschen. </li></ol></li><li> Bereiten Probe <ol><li> Platz Bildgebung Montageblock Teller auf dem Berg unter dem Mikroskop zu 5fache Vergrößerung und legen Perfusion Rohr in den Kanal durch Punktion. </li><li> Set Mikroskop Fluoreszenzmodus dann Zentrum und bringen Pilzkörper (MBS) in den Fokus. Passen Sie auf 20X und Wiederzentrum und Fokus. </li><li> Position Drainagevorrichtung über Drainagebecken, Höhe einstellen des Drainage Shunt so dass die Spitze ist nur Above-Pool, und führen Ringer-Lösung für 30 Sekunden, um das Abfließen zu gewährleisten. </li><li> Pull-Down-Schild den Inhalt vor Licht abzudichten Gerät. Unter Verwendung des automatisierten Systems in Photonen-Imager Feineinstellungen, um den Fokus und nehmen Sie ein Referenzfluoreszenzbild der MBs. </li></ol></li><li> Aufnahme <ol><li> Einstellen Photonengeschwindigkeit auf gewünschte Aufnahmegeschwindigkeit (von 50 ms bis zu 1 s oder mehr). Photonen-Modus auswählen und offener Blende. Nehmen Genotyp, Geschlecht, Alter und Probennummer im Log-Einträge. Stellen Sie die Position ROI Boxen über Kelch und Zellkörper (CCB) und mediale Lappen durch Klicken auf die ROI-Boxen und Ziehen bei gedrückter Steuerungs. </li><li> Record Grundlinie für etwa 5 bis 10 min (je nach Wunsch). </li><li> Gelten Nikotin für 1 min. Beachten Sie, Start / Stopp in log. Mit Ringerlösung für 5 min waschen. </li><li> Warten Sie 5 Minuten für die Wiederherstellung und bereiten KCl Protokolleintrag und Timer. </li><li> Gelten KCl für 1 min. Beachten Sie, Start / Stopp in log. Mit Ringerlösung während 1 min waschen. </li><li> SchalterFluoreszenzmodus, nehmen Sie endgültige Fluoreszenzbild und schalten Sie Ringerlösung. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Stop&quot;. Dialogfeld werden Sie gefragt, zum Ausschalten des Systems. Wählen Sie &quot;Nein&quot;, um die Aufnahme fortzusetzen. </li><li> Öffnen Schild, verschieben Drainagesystem, Schaltlinsenobjektiv bis 5X, entfernen Perfusion Rohr. Entfernen Probe / Aufnahme Gericht aus Stufe reinigen 20X Linse durch Spülen und zweimal wischen Sie das Objektiv mit Wasser. </li><li> Drücken Sie die Play-Taste weiß am oberen Rand des Programmfensters, um die nächste Aufzeichnung zu starten. </li></ol></li></ol> 3. Analyse und Video Creation <ol><li> Auszug Photonenwerte <ol><li> Öffnen Sie das Photon-Analyse-Programm (zB Photon Viewer) und offene erste Probentabellendatei. </li><li> Wählen Sie die Display-Steuerung Registerkarte. Wählen Sie die ROI, indem Sie auf die Region bei gedrückter Steuerungs. Passen Sie Größe, Ausrichtung und Form der Bereiche von Interesse, um GFP beleuchtet CCB und mediale Lappen umfassen. </li><li> Fügen Sie einen Zusatzal ROI, indem Sie auf und auf &quot;ROI definieren&quot; und Ziehen auf dem Bildschirm, um die neue ROI erstellen. </li><li> Wählen Sie die &quot;Movie&quot;, um Photonen-Video zu spielen. Stellen Sie &quot;s Breite&quot; und &quot;sec Schritte&quot; nach Wunsch. Nachstellen ROI Platzierung wie nötig. </li><li> Wählen Vertreter Screenshots der GFP-Fluoreszenz, Nikotin Antwort und KCl Antwort. Crop Screenshots und Bild Paste in eine Präsentationsfolie zur späteren Analyse und Vergleich. </li><li> Passen Sie sowohl die &quot;s Breite&quot; und &quot;sec Schritt&quot;, um die Aufnahmegeschwindigkeit in Sekunden. Wählen Sie Länge von Analyse, indem graue Markierungen auf obere Platte an der Halterung Region vor Stimulus Initiierung und unmittelbar nach Ansprechen Ende. </li><li> Wählen Sie &quot;Suspend Blick während des Spielens&quot; Presse &quot;&lt;&lt; REW&quot; und drücken Sie &quot;PLAY&gt;&quot;. Wählen Sie die Registerkarte &quot;Zählrate Chart&quot; und passen Einheiten wie gewünscht und Linienfarben, um ROI Farbe. </li><li> Wenn die Analyse abgeschlossen istDrücken Sie &quot;Export Zählratendaten&quot;. Wählen Sie Screenshots von kombinierten Aufnahmen CCB und mediale Lappen Region von Interesse von jeder Seite. Crop Screenshots und Bild Paste in einem Objektträger mit Reaktions Bilder. Diese Folie wird später in der endgültigen Analyse verwendet werden. </li></ol></li><li> Beispiel Analyse: eine Methode zur Analyse der extrahierten Photonendaten detailliert <ol><li> Öffnen Sie das Tabellenkalkulationsdateien in &quot;Zählrate Exporte&quot; -Ordner. </li><li> Formatieren Sie die Zellen der ersten Spalte mit der Zeit, um die Zeit in Stunden und Minuten angezeigt. </li><li> Verweisen Sie auf das entsprechende Schieber für die Probe. Entfernen Sie alle Werte außer den Spalten für die Zeit und die beiden Vertreter ROIs. </li><li> Bestimmen Sie Nikotin-Stimulation Startzeit - im Protokolleintrag Datei im Haupt Ordner- Zusatzdaten vor der Inbetriebnahme oder Highlight-Wert zu entfernen. </li><li> Finden höchste / Spitzenwert sowohl für CCB und mediale Keule und Zeichen / Highlight. </li><li> Bestimmen Sie Antwort Start- und Endzeit für beideCCB und mediale Lappen durch die Schaffung einer Schätzung unter Verwendung von Zeitpunkt aus entsprechenden grafisch dargestellt Reaktion auf Folie und wählen Sie Ist-Wert von Wertewandel in der Nähe zu diesen Punkten. Streichen den Bereich zwischen diesen Punkten in sowohl der CCB und mediale Lappen. Alternativ können Sie einen Makro-9. </li><li> Kombinieren Sie alle Proben einer Versuchsgruppe auf einem neuen Arbeitsblatt. </li><li> Richten Sie am Gipfel durch die Bestimmung der Zeilenwert ist für jede CCB Spitzenwert. Subtrahieren Sie die unteren Werte von höchsten Zeilenwert um ungefähre Zeilenwert, wo die Probe Daten müssen erneut kopiert werden, zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass alle Spitzenwerte ausgerichtet sind. </li><li> Kopieren Sie das Blatt zweimal und entweder der medialen Lappens Spalten oder die CCB Spalten Erstellen von Seiten von nur CCB oder medialen Lappens Werte zu löschen. </li><li> Daten zu entfernen, nachdem die alle CCB Antworten wurden beendet. Erstellen Sie vier Zeilen markiert Gesamt Photonen, Antwortlänge (Dauer), Peak-Amplitude und Antwortlatenz. Kopiere den wieder unter den Originalen. </li><li>Verwenden Sie die Funktion SUMME, um insgesamt Photonen während der Reaktion zu bestimmen. Verwenden Sie die COUNT-Funktion, um Länge der Antwort zu bestimmen. Kopieren und verbinden höchsten Wert Zelle zu Spitzenamplitudenwert zu bestimmen. Verwenden Sie COUNT-Funktion - vom Beginn der Perfusion von Nikotin zu Beginn der Reaktion zu wählen - den Antwortlatenzzeit zu bestimmen. </li><li> Copy-Werte mit Hilfe der Verknüpfungsfunktion und mehrfach (alle außer Spitzenamplitude) durch Aufzeichnung Geschwindigkeit in Sekunden. </li><li> Bar / box Graphen kann für berechneten Parameter wie Total Photonen, Spitzenamplitude und Antwortlänge erzeugt werden, wenn dies gewünscht wird (Bsp .: 5B, C, D). </li><li> In der Spalte nach der Rohdaten Photonenreaktion, der Mittelwert der Rohdatenpunkte für jeden Zeitpunkt unter Verwendung von Durchschnittsfunktion. Wenn mit einer Säule zur Festlegung der Standardfehler des Mittelwerts (SEM) gewünschten folgen, für jeden der gemittelten Photonenwerte zu einem Zeitpunkt. </li><li> Verwenden Sie die durchschnittliche Spalte, um eine durchschnittliche Antwort profil konstruierene [Graph] für die CCB Probengruppe. Wählen Sie dazu die Spalte die Angabe der Zeit wie die x-Achse Werte und die Spalte des durchschnittlichen Photonenwerte als der y-Achse und schließlich die Streudiagrammerstellung Werkzeug auswählen. </li><li> Wiederholen dieses Analyseverfahren mit den Daten aus den medialen Lappen. </li></ol></li><li> Erstellen von Images für das Video <ol><li> Offene Photonen Betrachter. </li><li> Wählen Sie die Display-Steuerung Registerkarte. Klicken Sie auf ROI bei gedrückter Steuerungs auszuwählen, zu entfernen und / oder zu minimieren, ist es. </li><li> Ändern &quot;sec Breite&quot; (Akkumulationszeit), wie gewünscht, den Inhalt jedes Rahmens zu bestimmen. </li><li> Ändern &quot;sec Schritt&quot;, um die Überlappung der einzelnen Frames zu definieren. </li><li> Wählen Sie &quot;Export Blick während des Spielens&quot; Presse &quot;&lt;&lt; REW&quot; und dann &quot;PLAY&gt;&quot;. Die Bilder für das Video wird an den &quot;Blick Exporte&quot; Ordner als eine Reihe von PNG-Dateien exportiert werden. </li></ol></li><li> Eine Methode für Video c: Verwenden von Virtual Dub Video zu machen,reation detaillierten <ol><li> Erstellen Sie einen neuen Ordner mit dem Namen &quot;resultats&quot; in der Ordneransicht Exporte mit den Bildern. </li><li> Bringen Sie script (renommer.VBS) in den Ordner mit Bildern. </li><li> Klicken Sie doppelt auf renommer.VBS zu laufen. </li><li> Bilder werden automatisch numerisch umbenannt und auf &quot;resultats&quot; Ordner kopiert werden. </li><li> Offene VirtualDub.exe. </li><li> Wählen offenen Video-Datei - wählen Sie zuerst eine Bild (nachfolgenden Bildern wird automatisch geladen). </li><li> Wählen Sie Video - wählen Framerate wie gewünscht einzustellen. </li><li> Wählen Sie Video - wählen Kompression wählen Cinepak Codec von Radius. </li><li> In Datei wählen Sie Speichern als AVI-Video wird automatisch erstellt. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das kürzlich entwickelte Biolumineszenz basierende GFP-Aequorin hier vorgestellte Ansatz ermöglicht in vivo funktionelle Aufnahme von Ca 2+ -Aktivität in verschiedenen Neuronen sowie wenn gewünscht, mit anderen Arten von Zellen, wie zum Beispiel Nierensternzellen nach Cabrero et al. 2013 5. Modifikationen, Fehlersuche, zusätzliche Komponenten und kritischen Schritte Drosophila Halt...

Die grundlegende Strukturierung und Funktion der Aktivitäten innerhalb des Gehirns und seiner diskreten Strukturen sind seit langem ein Gebiet intensiver Studie auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Vielleicht einige der frühesten erfolgreiche Ansätze verwendet werden, um dieses Problem zu beheben waren direkte physiologische Messung der Änderung in der elektrischen Aktivität - aber alternative Methoden, die Live-Darstellung von Spannungsänderungen, pH-Wert oder Calciumkonzentrationen (als Proxy für die Aktivität) zu ermöglichen haben zusätzliche Fähigkeiten gebracht die Untersuchung der neuronalen Aktivität 1. Bildgebungstechniken tragen eine Vielzahl von Vorteilen, wie reduzierte Invasivität und die Fähigkeit, im gesamten Gehirnstrukturen zu überwachen Aktivität. Außerdem bei Tieren mit gefügig Genetik einschließlich der Fruchtfliege Drosophila, die Entwicklung von genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren, wie Cameleon, GCaMPs und andere 1 haben Forscher erlaubt, einzelne Nervenzellen, neuronale Populationen und ganzer Gehirn überwachenStrukturen. Während traditionelle fluoreszierende Kalzium-bildgebenden Verfahren unter Verwendung GCaMPs (GFP an Calmodulin fusioniert) oder FRET (CFP und YFP an Calmodulin abgesichert) haben sich als nützliche Techniken eine gute räumliche und zeitliche Auflösung zu sein, die zugrunde liegende Prozess der Lichtanregung erzeugt einige Einschränkungen auf seine experimentelle Anwendungen. Aufgrund der Natur der Lichtanregung, Autofluoreszenz, Photobleaching und Phototoxizität unvermeidlich erzeugt wird, was folglich begrenzt die Tiefe der Strukturen, die abgebildet werden kann, die Dauer der Aufnahme sowie die Echtzeit-kontinuierliche Aufzeichnung. In anderen Worten muss Aufzeichnungen oft intermittierend durchgeführt werden, um diese unerwünschten Nebenwirkungen zu vermeiden. Wegen dieser Probleme wurden zusätzliche alternative Verfahren der Calcium Bildgebung entwickelt. Einer der vielversprechendsten Methoden ist biolumineszierenden Bildgebung, die auf Licht, das durch eine enzymatische Reaktion nach der Calciumbindung hergestellt beruht. Bioluminescent-Bildgebung erfordert keine Lichtanregung und damit nicht die gleichen Schwierigkeiten wie herkömmliche Calcium Imaging zu erleben. Die Biolumineszenz Reporter Aequorin - von Aequorea victoria isoliert, das gleiche Quallen, von dem GFP wurde auch isolated- bindet Kalzium über seine drei EF-Hand-Strukturen und eine Konformationsänderung, die zur Oxidation von seinem Co-Faktor Coelenterazin und die Freisetzung von blauem Licht (λ = 469 nm) 2,3. Aequorin hat eine sehr niedrige Affinität für Calcium (K d = 10 &amp; mgr; M), was es ideal für die Überwachung Calciumtransienten weil sie erzeugt nur wenig Hintergrundrauschen und nicht mit der intrazellulären Calcium-Puffersystem 4 eingreifen lässt. Obwohl Aequorin bereits verwendet wurde, um den Prozess der neuronalen Induktion im Xenopus-Ei 5 das erzeugte Licht zu überwachen, ist zu schwach, um für eine Echtzeitabbildung der neuronalen Aktivität verwendet werden. In dem Bemühen, diese Herausforderung, Philippe Br &amp; Adresse# 251; lassen und Kollegen am Institut Pasteur erstellt ein genetisches Konstrukt Verschmelzen GFP und Aequorin Genen, imitiert den nativen Zustand in der Quallen 4. Dieses Fusions Genprodukt bindet Calcium wieder über die drei EF-Handstrukturen Aequorin, das eine Konformationsänderung führt zu Oxidation von Coelenterazin, die Energie strahlungslos auf die GFP überläuft. Diese Energieübertragung führt zur Freisetzung von grünem Licht (λ = 509 nm) von GFP anstelle von blauem Licht von Aequorin. Die Fusion von GFP und Aequorin verleiht auch höhere Proteinstabilität hilft das Fusionsprotein produzieren Licht 19-65 mal heller als allein 4 Aequorin. Unter Verwendung eines Biolumineszenz-Ansatz im Gehirn erweitert die aktuelle experimentelle Anwendung von Calcium-Bildgebung sowohl in Bezug auf die Dauer der kontinuierlichen Aufzeichnung und die Anzahl der Strukturen innerhalb des Gehirns, die aufgezeichnet werden können. Im Großen und Ganzen im Rahmen der bisherigen Arbeit es bedeutet, dass sowohl globale als auch eine größereVielzahl von regionalisierten &quot;Aktivität&quot; des Gehirns (über den Proxy von Calciumtransienten) überwacht werden. Noch wichtiger Aktivität kann mehr überwacht werden, in einem Echtzeit und kontinuierlicher Weise, die ohne weiteres eignet sich für die Ausübung der ein vollständiges Verständnis der Basisfunktion im Gehirn. In den letzten Jahren haben unser Labor und andere transgene Fliegen, die das GFP-Aequorin unter der Steuerung des binären Expressionssystem (GAL4 / UAS-GFP-Aequorin) 5,6 exprimieren entwickelt. Wir GFP-Aequorin-Biolumineszenz durch natürliche Reize wie Duft 7,8 sowie suchten Zellkomponenten Modulieren Ca 2+ -Aktivität in den Pilzkörpern folgenden Acetylcholinrezeptorstimulation durch direkte nikotinischen Anwendung 9 erzeugte Datensatz Aktivität verwendet. Darüber hinaus haben wir auch verwendet GFP-Aequorin, um eine Reihe von experimentellen Fragen, die nicht in der Lage gewesen zu bisher angegangen werden, wie Langzeit-AdresseBildgebung der spontanen Calciumtransienten und Visualisierung von tieferen Hirnstrukturen 10. In jüngerer Zeit haben wir die GAL4 / UAS-System verwendet, um die Säuger-ATP-Rezeptor P2X 2 11 einen Kationenkanal, in den Projektionsneuronen (PNs) auszudrücken und verwendet die LexA System GFP-Aequorin in den Pilzkörpern exprimieren (MB247-LexA 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (a freundlicher Genehmigung von B. Pfeiffer, Janelia Bauernhof, USA). Dies ermöglichte es uns, die PNs durch Anwendung von ATP, das wiederum aktiviert den Pilzkörpern (a nachgeschalteten Ziel des PNs) zu aktivieren, die Nachahmung natürlicher Bedingungen, wie als Antwort auf eine Geruchsreiz. Insgesamt ist diese Technik kombiniert P2X 2 und GFP-Aequorin erweitert die experimentellen Möglichkeiten. Im Großen und Ganzen bietet es die Möglichkeit, die Aktivitätsmuster im Gehirn besser zu verstehen, die Einleitung neuer Studien darüber, wie verschiedene Reize und Störungen können die basalen Strukturierung der Aktivitäten zu ändern.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>1023911000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>prolabo</td><td>26 764.298</td><td>normapur</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>prolabo</td><td>25 108.295</td><td>normapur</td></tr><tr><td>saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Nikotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>Adenosin 5&prime;-triphosphat Dinatriumsalzhydrat</td></tr><tr><td>Benzyl-Coelenterazin</td><td>Prolume, Nanolicht&nbsp;</td><td>Katze #301 Coelenterazin h</td><td>http://www.prolume.com/</td></tr> <tr><td>Zahnkleber</td><td>3M ESPE&trade;</td><td>46954</td><td>Protemp IV</td></tr><tr><td>Silikonkleber</td><td>3M BWS&trade;</td><td>36958</td><td>Express 2 Regular Body Quick</td></tr><tr><td>Tape</td><td>3M Scotch</td><td>122s</td><td>3M Scotch Magic Tape</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen</td><td>Corning Incorporated</td><td>4868</td><td>100-1.000 &micro; l Univesal Pipettenspitzenkammer</td></tr><tr><td>und Halter (Tisch)</td><td></td><td></td><td>handgefertigte</td></tr><tr><td>Inkubationsbox</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, handgefertigte Pinzette (Nr. 5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Mikrodisparierzange</td></tr><tr><td>gebogene Pinzette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td>Mikrodisparierzange</td></tr><tr><td>Klebstoffapplikator&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Handgefertigt&nbsp;</td></tr><tr><td>Messer</td><td>Fine Science Tools</td><td>10316-14</td><td>5 mm Tiefe 15&Grad; Stich</td></tr><tr><td>EM-CCD Kamera&nbsp;</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td>iXon (gekühlt auf -80 &Grad; C)</td></tr> <tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Eclipse-E800</td></tr><tr><td>Immersionsobjektiv</td><td>Nikon</td><td></td><td>20X Fluor .5w</td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop mit Fluoreszenz</td><td>Leica MZ Fl III</td><td></td><td>Leica Dissektionsfernrohr und Leuchtstofflampe</td></tr><tr><td>enge dunkle Box</td><td>Science Wares</td><td></td><td>Custom built by Science Wares</td></tr><tr><td>Schlauchpumpe&nbsp;</td><td>Gilson</td><td></td><td>Minipuls 2</td></tr><tr><td>Schlauch</td><td>Fisher Scientific</td><td>abhängig von der Dicke</td><td>Tygon R3603, St-Gobain</td></tr><tr><td>Perfusionssystem</td><td>Warner</td><td>64-0135 &nbsp;( VC-66CS)</td><td>Perfusionsventil-Steuersystem, komplett, mit Quetschventilen,</td>6-Kanal-Perfusionsreglern</tr><tr><td></td><td>Leventon</td><td>201108</td><td>Dosi-flow 3</td></tr><tr><td>Mess- und Automatisierungsexplorer</td><td>Sciences Wares & National Instruments</td><td>N/</td><td>A-Software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td></tr><tr><td>Photonen-Imager&nbsp;</td><td>Wissenschaftliche Waren & National Instruments</td><td>N/A</td><td>Software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td></tr><tr><td>Photonenbetrachter</td><td>Science Wares & National Instruments</td><td>N/A</td><td>Software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>Software https://www.microsoft.com</td></tr><tr><td>Virtual Dub</td><td>Open Access&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Software http://virtualdub.sourceforge.net/</td></tr> <tr><td>UAS-GA2</td><td>Martin et al., 2007, Ref. 1&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Keine Aktien {derzeit} öffentlich verfügbar&nbsp;</td></tr><tr><td>pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP&nbsp; &nbsp;</td><td>B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.&nbsp;</td><td>(BESTAND #1117340)</td><td>pfeifferb@janelia.hhmi.org</td></tr><tr><td>P2X2</td><td>Lima und Misenboeck, Ref. 11&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Keine Aktien {derzeit} öffentlich verfügbar&nbsp;</td></tr><tr><td>OK107</td><td>Bloomington Lager Zentrum</td><td>854</td><td>http://flystocks.bio.indiana.edu/</td></tr></tbody></table>

in vivo functional brain imaging ansatz, der auf bioluminescent calciumindikator gfp-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Funktionelle in-vivo-Bildgebung hat sich zu einem leistungsfähigen Ansatz, um die Funktion und Physiologie von Gehirnzellen und Strukturen von Interesse zu studieren. Vor kurzem wurde ein neues Verfahren zur Ca 2+ -Imaging Verwendung des Biolumineszenz-GFP-Reporter Aequorin (GA) ist entwickelt worden. Diese neue Technik beruht auf der Fusion von GFP und Aequorin Genen, wodurch ein Molekül in der Lage zum Binden von Calcium und - unter Zugabe von dessen Co-Faktor Coelenterazin - emittierende helle Licht, das durch ein Photon Sammler überwacht werden können. Transgene Linien Tragen des GFP-Aequorin-Gens für Mäusen und Drosophila erzeugt. Bei Drosophila wurde die GFP-Aequorin-Gen unter der Kontrolle des GAL4 / UAS Binärausdruck Systems für die gezielte Expression und Imaging im Gehirn platziert. Dieses Verfahren wurde später gezeigt, dass sie erfassen kann sowohl nach innen Ca 2+ -Transienten und Ca 2+ aus inneren speichert -released. Am wichtigsten ist es ermöglicht eine größere Dauer in eine kontinuierliche Aufzeichnung, Imaging in größerer Tiefe innerhalb des Gehirns, und die Aufzeichnung mit hoher zeitlicher Auflösung (bis zu 8,3 ms). Hier präsentieren wir die grundlegende Methode für die Verwendung von Biolumineszenz-Bildgebung zu erfassen und zu analysieren, Ca 2+ -Aktivität in den Pilzkörpern, die eine Struktur von zentraler Bedeutung für Lernen und Gedächtnis im Fliegenhirn.

Die Fusion der GFP zu Aequorin erlaubt uns, unsere Region von Interesse vor der Biolumineszenz-Bildgebung durch Anregung von GFP in Fluoreszenzmodus am Mikroskop (Abbildung 3A, 4A, 6A, 6E) zu visualisieren. Eine der einfachsten Möglichkeiten, um die Pilzkörper zu stimulieren, durch Aktivierung der ionotropen nikotinischen Acetylcholinrezeptoren. Obwohl Acetylcholin ist der endogene Ligand dieses Rezeptors haben wir gefunden, dass Nikotin erzeugt reproduzierbarer Antworten in den Pilzkörpern. Dies ist zu...

Hier präsentieren wir eine neuartige Ca 2+ -Imaging Ansatz unter Verwendung eines Biolumineszenz Reporter. Dieser Ansatz verwendet einen fusionierten Konstrukts GFP-Aequorin, das Ca 2+ bindet und emittiert Licht, wodurch die Notwendigkeit für Lichtanregung. Deutlich Dieses Verfahren ermöglicht lange kontinuierliche Bildgebung, Zugang zu tiefen Hirnstrukturen und hoher zeitlicher Auflösung.

In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Das übergeordnete Ziel der biolumineszenten Bildgebung besteht darin, in vivo funktionelles Calcium-Transient, einen Proxy für Aktivität, über längere Zeiträume und in tiefen Hirnstrukturen abzubilden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neurobiologie zu beantworten, etwa wie die basale Aktivität des Fliegengehirns während des Schlafs aussieht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass keine Anregung mit Ihrem Laser erforderlich ist.Dies ermöglicht es, Kalzium transient tiefer im Gewebe und über einen längeren Zeitraum ohne Photobleiche und Toxizität abzubilden, im Gegensatz zur klassischen Kalziumbildgebung. Diese Methode kann Aufschluss über die basale Hirnaktivität bei Drosophila geben und kann auch mit anderen Modellorganismen, wie z.B. der Maus, angewendet werden. Bereiten Sie zunächst die interessierende Drosophila melanogaster-Linie und die experimentellen Lösungen vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.Dann betäubt das Eis eine einzelne Drosophila, indem es sie zwei Minuten lang in ein Glasfläschchen auf Eis überträgt. Bringen Sie als Nächstes die Fliege in eine gekühlte Petrischale und verwenden Sie eine Pinzette, um die Fliege vorsichtig in eine 1000-Mikroliter-Pipettenspitze zu stecken, die so getrimmt ist, dass die Spitze in einem Winkel von etwa 35 Grad steht. Schieben Sie mit einer Bürste vorsichtig auf jede Fliege und richten Sie sie so aus, dass der Kopf vollständig über den Rand der Spitze hinausragt und der Rückenbereich teilweise freiliegt.Tragen Sie dann den vorbereiteten Zahnkleber vom Kopf bis zum Rand der Pipettenspitze auf. Achten Sie besonders darauf, den Scheitel des Kopfes zu vermeiden. Das Verkleben des Kopfes ist von entscheidender Bedeutung, da die Fixierung in der richtigen Position für eine erfolgreiche Dissektion und Bildgebung unerlässlich ist.Darüber hinaus führt eine schlechte Verklebung zum Auslaufen der Ringerlösung und zum Absterben der Probe vor der Bildgebung. Führen Sie dann die Pipettenspitze mit der daran befestigten Fliege durch das Loch in der Aufnahmekammer und drücken Sie sie vorsichtig an, um sie zu fixieren. Verwenden Sie dann einen vorbereiteten Silikonkleber, um die flache Seite der Kammer an der Stelle, an der sie auf die Pipettenspitze trifft, zu sichern, um ein Auslaufen zu verhindern.Befestigen Sie ein Stück Gewindebohrer über dem Profusionskanal, der kurzen Kante, und verlängern Sie ihn bis zur Rückseite der Kammer. Legen Sie dann die Kammer mit der Fliege unter das Mikroskop und schalten Sie die Leuchtstofflampe ein. Pipettieren Sie dann einen Milliliter Ringerlösung in die Kammer.Machen Sie mit einem feinen chirurgischen Messer parallele Schnitte vom Hinterkopf der Fliege bis zur Antenalregion auf beiden Seiten. Schneide dann entlang des Augenrandes und mache einen senkrechten Schnitt über der Antenne, die die vorherigen Schnitte verbindet. Machen Sie einen letzten Schnitt am Hinterkopf und verwenden Sie dann eine feine, scharfe Pinzette, um die Nagelhaut zu entfernen.Fassen Sie vorsichtig das freiliegende Atemwegsgewebe an und entfernen Sie es, bis das Gehirn und der fluoreszierende Pilzkörper deutlich sichtbar sind. Verwenden Sie als Nächstes eine ultrascharfe Pinzette, um das neuronale Epitheliengewebe, das das Gehirn bedeckt, vorsichtig zu greifen und zu kneifen, um es zu entfernen und die Permeation des Coelenterazins zu ermöglichen. Waschen Sie das Gewebe mit einer Pipette zweimal mit einem Milliliter Ringerlösung, um alle Rückstände von der Dissektion zu entfernen, und geben Sie die Probe dann in eine dunkle Box.Als nächstes pipettieren Sie einen Milliliter Ringerlösung, die fünf mikromolare Benzyl-Coelenterazin enthält, in die Kammer. Schließen Sie die Box und inkubieren Sie die Probe mindestens zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Beginnen Sie damit, das Mikroskop am Computer einzuschalten.Kühlen Sie die Kamera außerdem auf minus 80 Grad Celsius ab. Richten Sie als Nächstes das Entwässerungssystem ein und stellen Sie die Umgebungssteuerung auf 20 Grad Celsius ein. Öffnen Sie als Nächstes den Photon Imager, erstellen Sie einen neuen Ordner und benennen Sie die erste Aufnahme.Richten Sie dann das Profusionssystem ein, indem Sie Kaliumchlorid, Nikotin und Ringerlösung in die jeweiligen Reservoirs geben. Stellen Sie den Durchfluss so ein, dass jede Lösung mit zwei Millilitern pro Minute entleert wird. Legen Sie dann die Probe auf die Montierung unter dem Mikroskop und stellen Sie die Vergrößerung auf 5x ein.Führen Sie dann den Profusionsschlauch durch die Punktion in den Kanal ein. Stellen Sie das Mikroskop auf den Fluoreszenzmodus ein, zentrieren Sie die Pilzkörper und stellen Sie sie in den Fokus. Sobald die Pilzkörper scharf sind, ändere die Vergrößerung auf 20X.Zentrieren Sie das Bild neu und passen Sie den Fokus an. Positionieren Sie dann das Entwässerungsgerät über dem Entwässerungsbecken und stellen Sie die Höhe des Entwässerungsshunts so ein, dass sich die Spitze knapp über dem Entwässerungsbecken befindet. Spülen Sie dann die Probe 30 Sekunden lang mit Ringerlösung, um eine ausreichende Drainage zu überprüfen.Ziehen Sie abschließend die Abschirmung herunter, um das Gerät gegen äußeres Licht abzudichten. Nehmen Sie mit dem automatisierten System des Photonen-Imager-Programms Feineinstellungen am Fokus vor und nehmen Sie ein Referenzfluoreszenzbild der Pilzkörper auf. Stellen Sie die Photonengeschwindigkeit auf die gewünschte Aufnahmegeschwindigkeit ein, die zwischen einem Bild alle 50 Millisekunden und einem Bild pro Sekunde oder mehr liegen sollte.Wählen Sie dann den Photonenmodus und öffnen Sie den Verschluss. Geben Sie als Nächstes den Genotyp, das Geschlecht, das Alter und die Probennummer in die Protokolleinträge ein. Passen Sie die Position der Felder für den Interessenbereich über dem Kelch, den Zellkörpern und den Mediallappen an, indem Sie auf die Felder klicken und sie bei gedrückter Strg-Taste in die Position ziehen.Zeichnen Sie nun die Ausgangswerte etwa fünf bis 10 Minuten lang auf. Legen Sie anschließend den Schalter um, um den Nikotinfluss zu starten. Drücken Sie gleichzeitig die Eingabetaste und fügen Sie eine Notiz hinzu, um anzuzeigen, dass der Nikotinfluss begonnen hat.Stoppen Sie nach einer Minute den Fluss, und machen Sie einen weiteren Vermerk im Protokoll, der angibt, dass der Fluss gestoppt wurde. Waschen Sie dann die Probe fünf Minuten lang mit Ringerlösung. Während sich die Probe erholt, schalten Sie die Wäsche aus, stellen Sie den Timer auf weitere fünf Minuten und bereiten Sie sich darauf vor, den Kaliumchloridfluss zu starten.Wenn Sie bereit sind zu beginnen, starten Sie den Kaliumchloridfluss und geben Sie 100 millimolare Kaliumchlorid-Startwerte in das Probenprotokoll ein. Nach einer Minute wird der Durchfluss gestoppt und der Begriff "Kaliumchlorid abgeschaltet" in das Probenprotokoll eingetragen. Waschen Sie dann die Probe eine Minute lang mit Ringerlösung und schalten Sie das Mikroskop in den Fluoreszenzmodus.Nehmen Sie ein letztes Fluoreszenzbild auf, schalten Sie dann die Klingellösung aus und entfernen Sie die Probe. Öffnen Sie im Analyseprogramm die erste Datei, wählen Sie die Registerkarte "Anzeigesteuerung" und klicken Sie auf ROI. Halten Sie dann die Strg-Taste gedrückt, und wählen Sie einen Interessenbereich aus.Passen Sie als Nächstes die Größe, die Ausrichtung und die Form der ROIs an, um den GFP-beleuchteten Kelch und die Zellkörper sowie die medialen Lappen zu umfassen. Nachdem Sie alle interessierenden Regionen hinzugefügt haben, wählen Sie die Registerkarte "Film", um das Photonenvideo abzuspielen. Passen Sie die zweite Breite und die zweite Stufe wie gewünscht an.Passen Sie dann die ROI-Platzierung nach Bedarf an, sodass sie innerhalb der aktiven Bereiche im Video bleibt. Wählen Sie einige repräsentative Screenshots der GFP-Fluoreszenz, der Nikotinreaktion und der Kaliumchlorid-Reaktion aus. Schneiden Sie dann die Screenshots zu und fügen Sie die repräsentativen Bilder in eine Präsentationsfolie ein, um sie später zu analysieren und zu vergleichen.Passen Sie sowohl die zweite Breite als auch den zweiten Schritt in Sekundenschnelle an die Aufnahmegeschwindigkeit an. Wählen Sie außerdem die Länge der Analyse aus, indem Sie die grauen Marker im oberen Bereich vor der Stimulusinitiierung und kurz nach dem Ende der Reaktion in den eingeklammerten Bereich verschieben. Wählen Sie als Nächstes während der Wiedergabe Ansichten anhalten aus, und drücken Sie dann die Zurückspultaste, um die Videowiedergabe auf den Anfang zurückzusetzen, gefolgt von der Wiedergabetaste.Wählen Sie dann das Tab-Count-Rate-Diagramm aus, um die Einheiten anzupassen und auch die Farbe der interessierenden Bereiche sowie die Linienfarben wie gewünscht anzupassen. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, wählen Sie Zählratendaten exportieren aus. Wählen Sie dann die kombinierten Aufzeichnungen des Kelch- und Zellkörpers sowie die aus den Regionen des Medialappens auf jeder Seite aus und fügen Sie diese Bilder in eine Folie mit den Antwortbildern ein.Eine der einfachsten Möglichkeiten, die Pilzkörper zu stimulieren, ist die Aktivierung der ionotropen nikotinischen Acetylcholinrezeptoren. Die typische Reaktion auf 25 mikromolares Nikotin, die hier gezeigt wird, beginnt mit der schnellen Aktivierung sowohl des Kelch- und Zellkörpers als auch der medialen Lappen und verwendet das fusionierte GFP-Aequorin-Konstrukt, das an Kalzium bindet und Licht emittiert. Im Allgemeinen dauert die Reaktion im Kelch und in den Zellkörpern länger und zeigt eine stärkere biolumineszierende Reaktion als die Lappen, wie in den sequentiellen Panels der Reaktion gezeigt.Eine beispielhafte Aufzeichnung der biolumineszenten Reaktion auf die Nikotinaktivierung im Laufe der Zeit wird durch diese Grafik beschrieben, wobei die Anzahl der Photonen in der interessierenden Region, die den Kelch und die Zellkörper enthält, schwarz und die Anzahl der Photonen im Bereich des Medialappens rot dargestellt ist. Aus diesem Diagramm können die Länge der Antwort, der Spitzenwert des Photons während der Reaktion und die Gesamtfläche unter jeder Kurve bestimmt werden. Einmal gemeistert, sollte die Vorbereitungsphase je nach Anzahl der Fliegen nur zwei Stunden vor der Inkubation dauern.Darüber hinaus kann jede Aufnahme in nur zwanzig Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das Fliegenmaterial richtig zu altern und aufzubewahren, um die Reproduzierbarkeit der Proben zu gewährleisten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Verhaltenstests durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welchen Einfluss die Aktivität der Struktur auf ein bestimmtes Verhalten hat.Die Entwicklung dieser Technik hat Forschern auf dem Gebiet der Neurobiologie den Weg geebnet, um die langfristige neuronale Aktivität im Drosophila-Gehirn zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proben für die biolumineszierende Bildgebung im Fliegengehirn vorbereitet. Vergessen Sie nicht, dass Nikotin gesundheitsschädlich sein kann.Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe sollten bei der Vorbereitung von Lösungen oder bei der Reinigung nach diesem Verfahren getroffen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Spontane Aktivitäten zu entwickeln neuronalen Netzen kann mit Hilfe AM-Ester Formen von Calcium-sensitiven Indikator Farbstoffe werden. Änderungen der intrazellulären Calcium, was darauf hinweist neuronale Aktivierung, werden als vorübergehende Veränderungen in Indikator Fluoreszenz mit ein-oder Zwei-Photonen-Imaging nachgewiesen werden. Dieses Protokoll kann für eine Reihe von entwicklungs-abhängige neuronale Netze angepasst...

Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

In diesem Protokoll, aktualisieren wir die jüngsten Fortschritte in der Bildgebung...

Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten

Quelle: Lark, A. R., et. al., In-vivo-Ansatz zur funktionellen Bildgebung des Gehirns basierend auf dem biolumineszierenden Calciumindikator GFP-Aequorin. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Echtzeit-Bildgebung der Kalziumdynamik mit Green fluoreszierende Protein-Aequorin-Biolumineszenz in den tiefen Hirnstrukturen von Drosophila.

Biolumineszenz-Bildgebung zur Untersuchung von Kalziumtransienten in Drosophila-Gehirnstrukturen

Mit seinem kleinen transparenten Körper, gut dokumentierte Neuroanatomie und einer Vielzahl von zugänglicher genetischen Techniken und...

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

Intrazellulärer Ca2+-Umbau im Alter kann zu Exzitotoxizität und Neuronenschäden beitragen, Prozesse, die durch Ca2+-Überlastung vermittelt werden. Unser Ziel war es, den Ca2+-Umbau im alternden Gehirn mit Hilfe von Fluoreszenz- und Biolumineszenzbildgebung von zytosolischem und mitochondrialem Ca2+ in Langzeitkulturen von Hippocampus-Neuronen der Ratte, einem Modell der neuronalen Alterung, zu untersuchen.

Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Im Alter von Neuronen im Hippocampus

Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für die ex-Vivo Calcium Bildgebung des Gehirns Drosophila . Bei dieser Methode können der Puffer, testen Sie ihre Fähigkeit, bestimmte Nervenzellen im Gehirn zu aktivieren natürliche oder synthetische Verbindungen zugewiesen werden.

Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bild Kalzium signalisieren in den Populationen der einzelnen Zelltypen bei der murinen neuromuskulären Synapse.

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

In diesem Protokoll wird erläutert, wie Multifaserphotometrieaufzeichnungen implementiert und durchgeführt werden, wie Kalzium-unabhängige Artefakte korrigiert werden und wie wichtige Überlegungen für die duale Photometrie-Bildgebung berücksichtigt werden.

Multi-Fiber Photometrie zur Aufzeichnung neuronaler Aktivität bei frei beweglichen Tieren

Dieses Protokoll enthält Schritte zur Erfassung und Analyse fluoreszierender Kalziumbilder von Gehirnummantelungsperizyten und Blutflussdaten aus nahe gelegenen Blutgefäßen bei anästhesierten Mäusen. Diese Techniken sind nützlich für Studien der Wandzellphysiologie und können angepasst werden, um Kalziumtransienten in jedem Zelltyp zu untersuchen.

Gehirn Perizyten-Kalzium und hämodynamische Bildgebung bei transgenen Mäusen in Vivo

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, um die neuronale Aktivität in Gehirnregionen transgener Zebrafische, die GCaMP-Kalziumindikatoren exprimieren, mittels konfokaler Mikroskopie zu untersuchen.

Im lebenden Organismus Konfokale Fluoreszenzbildgebung der durch sensorische Stimulation induzierten neuronalen Aktivität bei teilweise gefesselten Zebrafischlarven

Erfahren Sie biolumineszente Calcium-Imaging in Drosophila für funktionelle Neurobiologie mit GFP-Aequorin. Diese Methode ermöglicht langzeitige Bildgebung tiefer Gehirnstrukturen ohne Photobleaching.

In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

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