In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

Das übergeordnete Ziel der biolumineszenten Bildgebung besteht darin, in vivo funktionelles Calcium-Transient, einen Proxy für Aktivität, über längere Zeiträume und in tiefen Hirnstrukturen abzubilden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neurobiologie zu beantworten, etwa wie die basale Aktivität des Fliegengehirns während des Schlafs aussieht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass keine Anregung mit Ihrem Laser erforderlich ist.

Dies ermöglicht es, Kalzium transient tiefer im Gewebe und über einen längeren Zeitraum ohne Photobleiche und Toxizität abzubilden, im Gegensatz zur klassischen Kalziumbildgebung. Diese Methode kann Aufschluss über die basale Hirnaktivität bei Drosophila geben und kann auch mit anderen Modellorganismen, wie z.B. der Maus, angewendet werden. Bereiten Sie zunächst die interessierende Drosophila melanogaster-Linie und die experimentellen Lösungen vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.

Dann betäubt das Eis eine einzelne Drosophila, indem es sie zwei Minuten lang in ein Glasfläschchen auf Eis überträgt. Bringen Sie als Nächstes die Fliege in eine gekühlte Petrischale und verwenden Sie eine Pinzette, um die Fliege vorsichtig in eine 1000-Mikroliter-Pipettenspitze zu stecken, die so getrimmt ist, dass die Spitze in einem Winkel von etwa 35 Grad steht. Schieben Sie mit einer Bürste vorsichtig auf jede Fliege und richten Sie sie so aus, dass der Kopf vollständig über den Rand der Spitze hinausragt und der Rückenbereich teilweise freiliegt.

Tragen Sie dann den vorbereiteten Zahnkleber vom Kopf bis zum Rand der Pipettenspitze auf. Achten Sie besonders darauf, den Scheitel des Kopfes zu vermeiden. Das Verkleben des Kopfes ist von entscheidender Bedeutung, da die Fixierung in der richtigen Position für eine erfolgreiche Dissektion und Bildgebung unerlässlich ist.

Darüber hinaus führt eine schlechte Verklebung zum Auslaufen der Ringerlösung und zum Absterben der Probe vor der Bildgebung. Führen Sie dann die Pipettenspitze mit der daran befestigten Fliege durch das Loch in der Aufnahmekammer und drücken Sie sie vorsichtig an, um sie zu fixieren. Verwenden Sie dann einen vorbereiteten Silikonkleber, um die flache Seite der Kammer an der Stelle, an der sie auf die Pipettenspitze trifft, zu sichern, um ein Auslaufen zu verhindern.

Befestigen Sie ein Stück Gewindebohrer über dem Profusionskanal, der kurzen Kante, und verlängern Sie ihn bis zur Rückseite der Kammer. Legen Sie dann die Kammer mit der Fliege unter das Mikroskop und schalten Sie die Leuchtstofflampe ein. Pipettieren Sie dann einen Milliliter Ringerlösung in die Kammer.

Machen Sie mit einem feinen chirurgischen Messer parallele Schnitte vom Hinterkopf der Fliege bis zur Antenalregion auf beiden Seiten. Schneide dann entlang des Augenrandes und mache einen senkrechten Schnitt über der Antenne, die die vorherigen Schnitte verbindet. Machen Sie einen letzten Schnitt am Hinterkopf und verwenden Sie dann eine feine, scharfe Pinzette, um die Nagelhaut zu entfernen.

Fassen Sie vorsichtig das freiliegende Atemwegsgewebe an und entfernen Sie es, bis das Gehirn und der fluoreszierende Pilzkörper deutlich sichtbar sind. Verwenden Sie als Nächstes eine ultrascharfe Pinzette, um das neuronale Epitheliengewebe, das das Gehirn bedeckt, vorsichtig zu greifen und zu kneifen, um es zu entfernen und die Permeation des Coelenterazins zu ermöglichen. Waschen Sie das Gewebe mit einer Pipette zweimal mit einem Milliliter Ringerlösung, um alle Rückstände von der Dissektion zu entfernen, und geben Sie die Probe dann in eine dunkle Box.

Als nächstes pipettieren Sie einen Milliliter Ringerlösung, die fünf mikromolare Benzyl-Coelenterazin enthält, in die Kammer. Schließen Sie die Box und inkubieren Sie die Probe mindestens zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Beginnen Sie damit, das Mikroskop am Computer einzuschalten.

Kühlen Sie die Kamera außerdem auf minus 80 Grad Celsius ab. Richten Sie als Nächstes das Entwässerungssystem ein und stellen Sie die Umgebungssteuerung auf 20 Grad Celsius ein. Öffnen Sie als Nächstes den Photon Imager, erstellen Sie einen neuen Ordner und benennen Sie die erste Aufnahme.

Richten Sie dann das Profusionssystem ein, indem Sie Kaliumchlorid, Nikotin und Ringerlösung in die jeweiligen Reservoirs geben. Stellen Sie den Durchfluss so ein, dass jede Lösung mit zwei Millilitern pro Minute entleert wird. Legen Sie dann die Probe auf die Montierung unter dem Mikroskop und stellen Sie die Vergrößerung auf 5x ein.

Führen Sie dann den Profusionsschlauch durch die Punktion in den Kanal ein. Stellen Sie das Mikroskop auf den Fluoreszenzmodus ein, zentrieren Sie die Pilzkörper und stellen Sie sie in den Fokus. Sobald die Pilzkörper scharf sind, ändere die Vergrößerung auf 20X.

Zentrieren Sie das Bild neu und passen Sie den Fokus an. Positionieren Sie dann das Entwässerungsgerät über dem Entwässerungsbecken und stellen Sie die Höhe des Entwässerungsshunts so ein, dass sich die Spitze knapp über dem Entwässerungsbecken befindet. Spülen Sie dann die Probe 30 Sekunden lang mit Ringerlösung, um eine ausreichende Drainage zu überprüfen.

Ziehen Sie abschließend die Abschirmung herunter, um das Gerät gegen äußeres Licht abzudichten. Nehmen Sie mit dem automatisierten System des Photonen-Imager-Programms Feineinstellungen am Fokus vor und nehmen Sie ein Referenzfluoreszenzbild der Pilzkörper auf. Stellen Sie die Photonengeschwindigkeit auf die gewünschte Aufnahmegeschwindigkeit ein, die zwischen einem Bild alle 50 Millisekunden und einem Bild pro Sekunde oder mehr liegen sollte.

Wählen Sie dann den Photonenmodus und öffnen Sie den Verschluss. Geben Sie als Nächstes den Genotyp, das Geschlecht, das Alter und die Probennummer in die Protokolleinträge ein. Passen Sie die Position der Felder für den Interessenbereich über dem Kelch, den Zellkörpern und den Mediallappen an, indem Sie auf die Felder klicken und sie bei gedrückter Strg-Taste in die Position ziehen.

Zeichnen Sie nun die Ausgangswerte etwa fünf bis 10 Minuten lang auf. Legen Sie anschließend den Schalter um, um den Nikotinfluss zu starten. Drücken Sie gleichzeitig die Eingabetaste und fügen Sie eine Notiz hinzu, um anzuzeigen, dass der Nikotinfluss begonnen hat.

Stoppen Sie nach einer Minute den Fluss, und machen Sie einen weiteren Vermerk im Protokoll, der angibt, dass der Fluss gestoppt wurde. Waschen Sie dann die Probe fünf Minuten lang mit Ringerlösung. Während sich die Probe erholt, schalten Sie die Wäsche aus, stellen Sie den Timer auf weitere fünf Minuten und bereiten Sie sich darauf vor, den Kaliumchloridfluss zu starten.

Wenn Sie bereit sind zu beginnen, starten Sie den Kaliumchloridfluss und geben Sie 100 millimolare Kaliumchlorid-Startwerte in das Probenprotokoll ein. Nach einer Minute wird der Durchfluss gestoppt und der Begriff "Kaliumchlorid abgeschaltet" in das Probenprotokoll eingetragen. Waschen Sie dann die Probe eine Minute lang mit Ringerlösung und schalten Sie das Mikroskop in den Fluoreszenzmodus.

Nehmen Sie ein letztes Fluoreszenzbild auf, schalten Sie dann die Klingellösung aus und entfernen Sie die Probe. Öffnen Sie im Analyseprogramm die erste Datei, wählen Sie die Registerkarte "Anzeigesteuerung" und klicken Sie auf ROI. Halten Sie dann die Strg-Taste gedrückt, und wählen Sie einen Interessenbereich aus.

Passen Sie als Nächstes die Größe, die Ausrichtung und die Form der ROIs an, um den GFP-beleuchteten Kelch und die Zellkörper sowie die medialen Lappen zu umfassen. Nachdem Sie alle interessierenden Regionen hinzugefügt haben, wählen Sie die Registerkarte "Film", um das Photonenvideo abzuspielen. Passen Sie die zweite Breite und die zweite Stufe wie gewünscht an.

Passen Sie dann die ROI-Platzierung nach Bedarf an, sodass sie innerhalb der aktiven Bereiche im Video bleibt. Wählen Sie einige repräsentative Screenshots der GFP-Fluoreszenz, der Nikotinreaktion und der Kaliumchlorid-Reaktion aus. Schneiden Sie dann die Screenshots zu und fügen Sie die repräsentativen Bilder in eine Präsentationsfolie ein, um sie später zu analysieren und zu vergleichen.

Passen Sie sowohl die zweite Breite als auch den zweiten Schritt in Sekundenschnelle an die Aufnahmegeschwindigkeit an. Wählen Sie außerdem die Länge der Analyse aus, indem Sie die grauen Marker im oberen Bereich vor der Stimulusinitiierung und kurz nach dem Ende der Reaktion in den eingeklammerten Bereich verschieben. Wählen Sie als Nächstes während der Wiedergabe Ansichten anhalten aus, und drücken Sie dann die Zurückspultaste, um die Videowiedergabe auf den Anfang zurückzusetzen, gefolgt von der Wiedergabetaste.

Wählen Sie dann das Tab-Count-Rate-Diagramm aus, um die Einheiten anzupassen und auch die Farbe der interessierenden Bereiche sowie die Linienfarben wie gewünscht anzupassen. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, wählen Sie Zählratendaten exportieren aus. Wählen Sie dann die kombinierten Aufzeichnungen des Kelch- und Zellkörpers sowie die aus den Regionen des Medialappens auf jeder Seite aus und fügen Sie diese Bilder in eine Folie mit den Antwortbildern ein.

Eine der einfachsten Möglichkeiten, die Pilzkörper zu stimulieren, ist die Aktivierung der ionotropen nikotinischen Acetylcholinrezeptoren. Die typische Reaktion auf 25 mikromolares Nikotin, die hier gezeigt wird, beginnt mit der schnellen Aktivierung sowohl des Kelch- und Zellkörpers als auch der medialen Lappen und verwendet das fusionierte GFP-Aequorin-Konstrukt, das an Kalzium bindet und Licht emittiert. Im Allgemeinen dauert die Reaktion im Kelch und in den Zellkörpern länger und zeigt eine stärkere biolumineszierende Reaktion als die Lappen, wie in den sequentiellen Panels der Reaktion gezeigt.

Eine beispielhafte Aufzeichnung der biolumineszenten Reaktion auf die Nikotinaktivierung im Laufe der Zeit wird durch diese Grafik beschrieben, wobei die Anzahl der Photonen in der interessierenden Region, die den Kelch und die Zellkörper enthält, schwarz und die Anzahl der Photonen im Bereich des Medialappens rot dargestellt ist. Aus diesem Diagramm können die Länge der Antwort, der Spitzenwert des Photons während der Reaktion und die Gesamtfläche unter jeder Kurve bestimmt werden. Einmal gemeistert, sollte die Vorbereitungsphase je nach Anzahl der Fliegen nur zwei Stunden vor der Inkubation dauern.

Darüber hinaus kann jede Aufnahme in nur zwanzig Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, das Fliegenmaterial richtig zu altern und aufzubewahren, um die Reproduzierbarkeit der Proben zu gewährleisten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Verhaltenstests durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welchen Einfluss die Aktivität der Struktur auf ein bestimmtes Verhalten hat.

Die Entwicklung dieser Technik hat Forschern auf dem Gebiet der Neurobiologie den Weg geebnet, um die langfristige neuronale Aktivität im Drosophila-Gehirn zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proben für die biolumineszierende Bildgebung im Fliegengehirn vorbereitet. Vergessen Sie nicht, dass Nikotin gesundheitsschädlich sein kann.

Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe sollten bei der Vorbereitung von Lösungen oder bei der Reinigung nach diesem Verfahren getroffen werden.