Name: In-situ-Charakterisierung von Hydrated Proteine in Wasser durch SALVI und TOF-SIMS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Lernen Sie die Charakterisierung adsorbierter Proteinfilme in wässrigen Lösungen durch SALVI und Flugzeit-Sekundärionenmassenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die In-situ-Analyse von Biomolekülen an Feststoff-Flüssigkeits-Grenzflächen.

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Wir danken dem Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) und Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD Fund für die Unterstützung. Der instrumentelle Zugang wurde durch einen Science Themed Proposal des W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) ermöglicht. EMSL ist eine nationale wissenschaftliche Nutzereinrichtung, die vom Büro für Biologische und Umweltforschung (BER) am PNNL gefördert wird. Die Autoren danken Herrn Xiao Sui, Herrn Yuanzhao Ding und Frau Juan Yao für das Korrekturlesen des Manuskripts und das nützliche Feedback. PNNL wird von Battelle für das DOE unter dem Vertrag DE-AC05-76RL01830 betrieben.

1. Reinigung und Sterilisation des SALVI Microchannel <ol><li> Sterilisation des Mikrokanals in SALVI <ol><li> Unentschieden 2 ml 70% Ethanol wässrigen Lösung in eine Spritze, verbinden Sie die Spritze mit dem Einlassende von SALVI, und spritzen langsam 1 ml der Flüssigkeit in 10 Minuten. Entfernen Sie die Spritze am Ende der Injektion. Als nächstes den Einlass und Auslass von SALVI ein Polyetheretherketon (PEEK) Vereinigung anschließen werden. Alternativ können Sie eine Spritzenpumpe die gleiche Prozedur durchzuführen. Sie können beispielsweise die Strömungsgeschwindigkeit bei 100 &amp; mgr; l / min. </li><li> Halten Sie die SALVI Mikrokanal gefüllt mit 70% Ethanol-Lösung bei Raumtemperatur für 4 Stunden. </li></ol></li><li> Einführung Entionisiertes (DI) Wasser in SALVI <ol><li> Unentschieden 2 ml sterilisiertem VE-Wasser in eine Spritze, verbinden Sie die Spritze mit dem Einlass von SALVI, und spritzen langsam 1 ml der Flüssigkeit in 10 Minuten. Entfernen Sie die Spritze, und verbinden Sie den Eingang und Ausgang von SALVI einer PEEK-Vereinigung mit. Alternativ können Sie eine Spritzenpumpe wie erwähnt inSchritt 1.1.1. </li></ol></li></ol> 2. Immobilisierung des Proteins Film in SALVI <ol><li> Immobilisierung der Proteinfilm in SALVI <ol><li> Unentschieden 2 ml Fibronektin (10 ug / ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, PBS) Lösung in eine Spritze, verbinden Sie die Spritze mit dem Einlass von SALVI, spritzen langsam 1 ml der Flüssigkeit in 10 Minuten, entfernen Sie die Spritze, und verbinden Sie den Einlass und Ausgang des SALVI mit einer PEEK-Vereinigung. </li><li> Inkubation des SALVI mit der Fibronektin-Lösung in einem sauberen Kulturschale gefüllt, für 12 Stunden das Gericht in die Haube bei Raumtemperatur halten. </li><li> Unentschieden 2 ml sterilisiertem VE-Wasser in eine Spritze und verbinden Sie die Spritze mit dem Einlass von SALVI. spritzen langsam 1 ml Wasser in 10 Minuten, entfernen Sie die Spritze, und verbinden Sie den Eingang und Ausgang von SALVI. Hinweis: Wenn mit einem Lichtmikroskop ausgestattet, unter dem Mikroskop die SALVI überprüfen, um sicherzustellen, dass der SiN-Membran vor ToF-SIMS-Analyse intakt ist. Nun ist die SALVI Gerät ist bereit für TOF-SIMS einalysis. </li></ol></li></ol> 3. Installieren SALVI in der TOF-SIMS Schleusenkammer Hinweis: Schutzhandschuhe sollten jederzeit getragen werden, wenn das Gerät SALVI Handhabung und auf die TOF-SIMS Phase der Installation von potentiellen Verunreinigungen während der Oberflächenanalyse zu vermeiden. <ol><li> Berg SALVI auf die Bühne <ol><li> Legen Sie die TOF-SIMS Bühne auf eine ebene und saubere Fläche. Setzen Sie den SALVI Gerät auf die Bühne mit der Silizium-Wafer und SiN-Membran nach oben. Befestigen Sie die SALVI mit vier Metallklemmstücke und schrauben Sie die Metallteile der Ecke des Geräts in die Metallplatte mit vier Schrauben halten. </li><li> aufrollen vorsichtig die PTFE-Schlauch an den mikrofluidischen Kanal verbunden. Verwenden Sie vier Metallstücke und vier Schrauben, die das steife Teil zu halten. Stellen Sie sicher, dass das Gerät in dem freien Platz auf dem SIMS Stufe so positioniert ist, dass es nicht mit dem primären Ionenstrahl während der Analyse nicht stört. Zusätzliche Bild und Darstellung der SALVI fabricatIon und Installation sind in früheren Veröffentlichungen zur Verfügung. 8,9,11 </li></ol></li><li> Montieren Sie den Faraday-Cup auf die Bühne <ol><li> Befestigen Sie den Faraday-Cup auf der Bühne mit einer Schraube. </li></ol></li><li> Laden Sie die Bühne in die TOF-SIMS Schleusenkammer <ol><li> Öffnen Sie die TOF-SIMS Schleusen, halten und die Bühne horizontal auf der Ladefläche, und schließen Sie die Schleusentür. </li></ol></li></ol> 4. TOF-SIMS Datenerfassung <ol><li> Einschalten der Vakuumpumpe und sicherzustellen geeignetes Vakuum (beispielsweise in der Größenordnung von 10 -6 mbar oder Torr) in der Ladeschleusenkammer erreicht. </li><li> Bewegen Sie den SALVI in die Hauptkammer, sobald das Vakuum nach etwa 30 min stabilisiert. Hinweis: Das Vakuum sollte niedriger sein als 5 x 10 -6 mbar Vakuum in der Hauptkammer während der Datenerfassung. Ansonsten ist höheres Vakuum eines Lecks in dem System SALVI indikativ. </li><li> Stellen Sie den Primärionenstrahl und Analysator von TOF-SIMS mit einräumliche Auflösung von etwa 400 nm gemäß den Herstellerempfehlungen. Der Strom des Primärstrahls ist 1.200 pA, während die Zykluszeit von 30 Mikrosekunden unter DC-Modus befindet. Hinweis: Dieser Vorgang weitgehend folgt Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Finden Sie den mikrofluidischen Kanal des optischen Mikroskop. Verwenden Sie die optische Bildmitte als Referenz und richten Sie sie an der Sekundärionen-Bildmitte, konsequent zu sein. </li><li> Vor jeder Messung verwenden, um eine 1 keV O 2 + Strahl (~ 40 nA) auf dem SiN-Fenster mit einem 500 x 500 &amp; mgr; m 2 Fläche zu scannen für ~ 15 sec Oberflächenverunreinigungen zu entfernen. Verwenden Sie außerdem eine Elektronenflutkanone Oberfläche Aufladung bei allen Messungen zu kompensieren. Verwenden Sie die automatische Funktion des Hochwasserpistole in den Standardmodus für diesen Schritt. </li><li> Wählen positiven oder negativen Modus, bevor die Datenerfassung. Verwenden Sie die 25 keV Bi 3 + Strahl als primäre Ionenstrahl in alle Messungen. Hinweis: Die Schritte sind ähnlich foder positive und negative Datenerfassungen. Für das Interesse der Raum wird die positive Modus im Detail beschrieben. <ol><li> Tiefenprofilierung <ol><li> Scannen Sie den Bi 3 + Strahl auf eine runde Fläche mit einem Durchmesser von ca. 2 &amp; mgr; m mit 32 Pixeln mal 32 Pixeln Auflösung. </li><li> Um die Zeit zu minimieren, die erforderlich zum Durchgriff der SiN-Membran, mit einem langen Impulsbreite (dh 180 nsec, Strahlstrom ~ 1,0 Pa bei einer Zykluszeit von 100 &amp; mgr; s) Bi 3 + Strahl. Die Intensitäten von sekundären Ionen repräsentativ von der Flüssigkeitsoberfläche erhöhen, wenn Durchgriff erreicht wird. Die Punch-Through Zeit variiert von 300 sec bis 500 sec, je nach Charge des SiN-Membran. Anmerkung: Dieser Unterschied in den Ansatz von SiN Membranen verwandt zu sein scheint erworben nach unseren Erfahrungen. Allerdings ist die Punch-Through-Zeit nicht wirklich die Datenanalyse beeinflussen. </li><li> Nach dem SiN Membrandurchgriff, halten Sie das gleiche für etwa 200 sec Strom zugenügend Daten für 2D-Bildrekonstruktionen erhalten. </li><li> Reduzieren Sie die Impulsbreite auf 80 ns für Sammlungsdaten Spektren mit einer besseren Massenauflösung zu erwerben. Setzen Sie diese Akquisition noch etwa 200 Sekunden. Die Spektraldaten in 1 gezeigt werden aus diesem Bereich erhalten. </li></ol></li><li> 2D-Imaging und Massenspektren <ol><li> Sammeln Sie die 2D-Bildgebung und Massenspektren Daten zur gleichen Zeit, als die Tiefenprofilmessdaten. Die TOF-SIMS Gerät speichert alle Daten von jedem Punkt während des Experiments. (- Spectra, FPanel - FPanel Profile und FPanel - Bilder separat) Die Daten werden in verschiedenen Fenstern angezeigt des digitalen Steuerungssoftware. Prüfen Sie Daten in jedem Feld umsichtig bei der Datenerfassung. </li></ol></li></ol></li></ol> 5. TOF-SIMS Datenanalyse Hinweis: Die Datenanalyse zunächst ausgeführt, um die IonToF TOF-SIMS instrumental Software. <ol><li> Öffnen Sie die einealysis Software von SIMS (Messung Explorer) und klicken Sie dann auf die &quot;Profile&quot;, &quot;Spektrum&quot; und &quot;Bild&quot; Tasten bzw. Tiefenprofil, m / z-Spektrum, und Bilddaten zu verarbeiten. </li><li> Öffnen Sie die Dateien, die die Erweiterung &quot;.ita&quot; haben. </li><li> Wählen Sie Spitzen von Interesse, geben Sie den Artnamen in &quot;Ion&quot; ein, und beschriften Sie sie mit verschiedenen Farben in den Spektren. Verwenden Sie das Mausrad auf der x-Achse zu ziehen. Mit Strg und Scroll-Rad-Spitze Höhen und Breiten anzupassen. Buchstabe &quot;L&quot; wird zwischen Linear- und Log-Modi auf der y-Achse. </li><li> Führen Datenrekonstruktion vor Massenkalibrierung. Ansonsten ist es schwierig, den Abstand zwischen den Peaks im Massenkalibrierungsschritt zu wählen. <ol><li> Wählen Sie die Tiefenprofildaten von Interesse und rekonstruieren die Spektren nach dem Tiefenprofil Zeitreihe. </li><li> Klicken Sie auf die Rekonstruktion Taste. In der &quot;Start Wiederaufbau&quot; -Fenster, geben Sie einen Scanbereich von interest. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;, um die Tiefenprofil Daten rekonstruieren. </li></ol></li><li> Führen Sie eine Massenkalibrierung. Drücken Sie &quot;F3&quot;, um den &quot;Massenkalibrierung&quot; -Fenster. Wählen Sie Spitzen für die Kalibrierung auf der Basis der spezifischen Probe. 21 In dieser Arbeit, die folgenden Spitzen CH 3 + (m / z 15), H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71), 11 H O 5 + (m / z 99) und H 13 O 6 + (m / z 109) für die positive Betriebsart. Verwenden Sie die folgenden Peaks CH - (m / z 13), O - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), und C 4 H - (m / z 49) für die negative Betriebsart. <ol><li> Wählen Sie eine Spitze,stellen Sie sicher, dass der Pfeil nach unten ist auf dem Höhepunkt in der linken unteren Ecke des Fensters zeigte. Klicken Sie auf diesen Höhepunkt und geben Sie den Spitzennamen in der &quot;Massenkalibrierung&quot; Fenster, klicken Sie auf &quot;Hinzufügen&quot;, und das Ion von Interesse ist in der Massenkalibrierung enthalten. </li><li> Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche &quot;Recalibrate&quot;. Überprüfen Sie, ob die Flächen der Peaks in den richtigen Stellen sind nach ihrem Masse-Ladungs-Verhältnissen. In der &quot;Spectrum&quot; -Menü und klicken Sie auf &quot;Übernehmen Massenkalibrierung&quot; auf &quot;All Spectra&quot; oder &quot;Ausgewählte Spektren&quot;, auf die spezifische Analyse je durchgeführt. </li></ol></li><li> Als Höhepunkt Auswahl für die Probenanalyse erforderlich ist, der Literatur oder anderen bisherigen Erkenntnissen nach charakteristischen Peaks der Probe bestimmen. Vergleichen Sie die Intensität der Peaks von Interesse in der m / z-Spektren. Falls erforderlich, neue Spitzen oder löschen nutzlos Spitzen in der Peak-Liste. <ol><li> In Spitzen. Klicken Sie auf eine Spitze, die roten Linien in der linken unteren Fenster finden. Hold die &quot;Strg&quot; -Taste, bewegen Maus horizontal Peakbreite zu definieren, die automatisch einen Peak, der dem Peak-Liste hinzufügt. Eine weitere Möglichkeit, einen Höhepunkt hinzuzufügen, ist ein Höhepunkt in der Haupt Spektrum Fenster auszuwählen, und dann auf &quot;Hinzufügen peak&quot; zu klicken über dem Fenster. Wenn es viele Spitzen an, in der &quot;Spectrum&quot; Menü sind, wählen Sie &quot;Suche Spitzen&quot;, überprüfen bezogenen Spezifikationen in dem sich öffnenden Fenster, dann Spitzen nach Bedarf hinzufügen. </li><li> Um eine Peak-Liste exportieren, in der &quot;Peak-Liste&quot; Menü wählen Sie &quot;Speichern unter ...&quot;, um die Peak-Liste im &quot;itmil&quot; -Format. Verwenden Sie die Strg-Taste und linke Taste auf dem Spektrum zu ziehen. In den Spektren Fenster, wählen Sie einen Höchststand von Interesse und ziehen Sie die beiden gestrichelten Linien, um wünschenswerte Positionen. </li><li> Um eine Peak-Liste zu importieren, in der &quot;Mass Intervall-Liste&quot; Wählen Sie im Menü &quot;Import ...&quot;, suchen Sie eine bestehende Spitzenlistendatei mit der Dateiendung &quot;.ITPL&quot;. Klicken Sie auf &quot;Öffnen&quot;. </li><li> eine &quot;itmil&quot; Peak-Liste zu verwenden,die &quot;Mass Intervall List&quot; Menü klicken Sie auf &quot;Öffnen ...&quot;, um die Datei zu finden, dann auf &quot;Öffnen&quot; klicken. </li></ol></li><li> Tragen Sie eine Peak-Liste zur weiteren Daten zu analysieren. Am linken unteren Teil &quot;Spectra&quot; -Fenster, gibt es ein Fenster &quot;Mass Interval Liste&quot; genannt. Das importierte Spitzen Liste ist hier aufgetaucht. <ol><li> Rechtsklick auf die Peak-Liste-Datei verwendet werden soll, wenden sie auf die &quot;aktive Spektrum&quot; oder &quot;alle Spektren&quot;. </li></ol></li><li> Sehen Sie sich die Datenprofile. Im &quot;Profil&quot; Fenster, Nutzung Buchstaben &quot;M&quot; auf Fenster (Vollbereich) und der Buchstabe &quot;N&quot; zu passen zu der y-Achse zu passen. Mit Strg und Scrollrad das Profil Breite anzupassen. Oder nutzen Sie &quot;/&quot; und &quot;*&quot; auf der Tastatur die Y-Achsenbereich und Höhe zu ändern. </li><li> Datenexport für die weiter nach der ersten Analyse mit anderen Grafik-Software plant. <ol><li> Um ein Tiefenprofil, in dem &quot;Profil&quot; Fenster exportieren, klicken Sie auf das Menü &quot;Datei&quot; und dann &quot;Export &amp; #34 ;, und wählen Sie dann &quot;Speichern unter&quot; einem &quot;.txt&quot; -Datei. </li><li> So exportieren einen m / z-Spektrum-Datei, in der &quot;Spectra&quot; Fenster, klicken Sie auf das Menü &quot;Datei&quot; und dann &quot;Export&quot; und wählen Sie &quot;Speichern unter&quot; einem &quot;.txt&quot; -Datei. </li><li> eine Bilddatei, in der &quot;Bild&quot; Fenster, Print Screen und speichern wie die Bilddatei zu exportieren. </li></ol></li></ol> 6. TOF-SIMS Daten Plotten und Präsentation Hinweis: Verwenden Sie eine grafische Werkzeug, um die Daten zu zeichnen, nachdem die SIMS Daten verarbeitet werden, die instrumental-Software. <ol><li> Verwenden Sie ein Grafik-Tool die Daten zu importieren. </li><li> Machen Sie einen Plan mit dem m / z als der x-Achse und Spitzenintensität als der y-Achse des rekonstruierten Spektrums zu zeigen. Ein Beispiel ist in Abbildung 1 wiedergegeben. </li><li> Machen Sie einen Plan mit der Sputter-Zeit wie die x-Achse und Spitzenintensität als der y-Achse des rekonstruierten Tiefenprofil zeitliche Serie zu zeigen. Ein Beispiel ist gegeben in FiguRE 2. </li><li> Kombinieren Sie rekonstruierten 2D-Bilder von verschiedenen m / z und bilden eine Matrix, die die Ionen-Mapping zu zeigen. Ein Beispiel ist in Abbildung 2 wiedergegeben. </li></ol>

<ol><li>Tompa, K., Bokor, M., Verebelyi, T., Tompa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+rotation+barriers+on+protein+molecular+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Water rotation barriers on protein molecular surfaces.</a> Chem. Phys. 448, 15-25 (2015).</li>
<li>Maruyama, Y., Harano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+water+drive+protein+folding%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Does water drive protein folding?</a> Chem. Phys. Lett. 581, 85-90 (2013).</li>
<li>Chaplin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion+-+Do+we+underestimate+the+importance+of+water+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Opinion - Do we underestimate the importance of water in cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 (11), 861-866 (2006).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+hydration+dynamics+around+a+protein+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mapping hydration dynamics around a protein surface.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (47), 18461-18466 (2007).</li>
<li>Xia, N., May, C. J., McArthur, S. L., Castner, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry+analysis+of+conformational+changes+in+adsorbed+protein+films%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of conformational changes in adsorbed protein films.</a> Langmuir. 18 (10), 4090-4097 (2002).</li>
<li>Gray, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+proteins+with+solid+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The interaction of proteins with solid surfaces.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (1), 110-115 (2004).</li>
<li>Wagner, M. S., Horbett, T. A., Castner, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+structure+of+binary+and+ternary+adsorbed+protein+films+using+electron+spectroscopy+for+chemical+analysis%2C+time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry%2C+and+radiolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterization of the structure of binary and ternary adsorbed protein films using electron spectroscopy for chemical analysis, time-of-flight secondary ion mass spectrometry, and radiolabeling.</a> Langmuir. 19 (5), 1708-1715 (2003).</li>
<li>Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z., Iedema, M. J., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+liquid+surfaces+under+vacuum+using+SEM+and+and+ToF-SIMS%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and and ToF-SIMS.</a> Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).</li>
<li>Yang, L., Yu, X. -Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+hybrid+microfluidic+platform+compatible+for+in+situ+imaging+by+vacuum-based+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vac.+Sci.+Technol.+A%22%5BJournal%5D)">Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques.</a> J. Vac. Sci. Technol. A. 29 (6), 061101(2011).</li>
<li>Yu, X. -Y., Yang, L., Zhu, Z. H., Cowin, J. P., Iedema, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+aqueous+surfaces+by+ToF-SIMS%5BTitle%5D)+AND+%22LC+GC+N.+Am%22%5BJournal%5D)">Probing aqueous surfaces by ToF-SIMS.</a> LC GC N. Am. (Oct), 34-38 (2011).</li>
<li>Yu, X. -Y., Yang, L., Cowin, J., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US patent. , 8,555,710 B2 (2013).</li>
<li>Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US patent. , 20,140,038,224 A1 (2014).</li>
<li>Yang, L., Zhu, Z., Yu, X. -Y., Thevuthasan, S., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+microfluidic+device+for+in+situ+ToF-SIMS+analysis+of+selected+organic+molecules+at+aqueous+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Methods%22%5BJournal%5D)">Performance of a microfluidic device for in situ ToF-SIMS analysis of selected organic molecules at aqueous surfaces.</a> Anal. Methods. 5 (10), 2515-2522 (2013).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+SEM+and+ToF-SIMS+analysis+of+IgG+conjugated+gold+nanoparticles+at+aqueous+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Interface+Anal%22%5BJournal%5D)">In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces.</a> Surf. Interface Anal. 46 (4), 224-228 (2014).</li>
<li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+molecular+imaging+of+hydrated+biofilm+in+a+microfluidic+reactor+by+ToF-SIMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">In situ molecular imaging of hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS.</a> Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).</li>
<li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+and+three-dimensional+dynamic+imaging+of+live+biofilms+in+a+microchannel+by+time-of-flight+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional and three-dimensional dynamic imaging of live biofilms in a microchannel by time-of-flight secondary ion mass spectrometry.</a> Biomicrofluidics. 9 (3), 031101(2015).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+chemical+probing+of+the+electrode-electrolyte+interface+by+ToF-SIMS%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS.</a> Lab Chip. 14 (5), 855-859 (2014).</li>
<li>Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fibronectin at a glance.</a> J. Cell Sci. 115 (20), 3861-3863 (2002).</li>
<li>Pierschbacher, M. D., Hayman, E. G., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+the+cell-attachment+site+in+fibronectin+with+monoclonal+antibodies+and+proteolytic+fragments+of+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Location of the cell-attachment site in fibronectin with monoclonal antibodies and proteolytic fragments of the molecule.</a> Cell. 26 (2), 259-267 (1981).</li>
<li>Engvall, E., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+soluble+form+of+fibroblast+surface+protein%2C+fibronectin%2C+to+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Binding of soluble form of fibroblast surface protein, fibronectin, to collagen.</a> Int. J. Cancer. 20 (1), 1-5 (1977).</li>
<li>Green, F. M., Gilmore, I. S., Seah, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOF-SIMS%3A+Accurate+mass+scale+calibration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">TOF-SIMS: Accurate mass scale calibration.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17 (4), 514-523 (2006).</li>
<li>Yu, X. -Y., Liu, B., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+liquids+using+microfluidic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Imaging liquids using microfluidic cells.</a> Microfluid. Nanofluid. 15 (6), 725-744 (2013).</li>
<li>Shi, H., Lercher, J. A., Yu, X. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sailing+into+uncharted+waters%3A+recent+advances+in+the+in+situ+monitoring+of+catalytic+processes+in+aqueous+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Catal.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Sailing into uncharted waters: recent advances in the in situ monitoring of catalytic processes in aqueous environments.</a> Catal. Sci. Technol. 5 (6), 3035-3060 (2015).</li>
<li>Deleu, M., Crowet, J. M., Nasir, M. N., Lins, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+biophysical+tools+to+investigate+lipid+specificity+in+the+interaction+between+bioactive+molecules+and+the+plasma+membrane%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta-Biomembr%22%5BJournal%5D)">Complementary biophysical tools to investigate lipid specificity in the interaction between bioactive molecules and the plasma membrane: A review.</a> Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1838 (12), 3171-3190 (2014).</li>
<li>Kraft, M. L., Klitzing, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+lipids+with+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+Mol.+Cell+Biol.+Lipids%22%5BJournal%5D)">Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry.</a> Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Biol. Lipids. 1841 (8), 1108-1119 (2014).</li>
<li>Gilmore, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMS+of+organics-Advances+in+2D+and+3D+imaging+and+future+outlook%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vac.+Sci.+Technol.+A%22%5BJournal%5D)">SIMS of organics-Advances in 2D and 3D imaging and future outlook.</a> J. Vac. Sci. Technol. A. 31 (5), 050819(2013).</li>
<li>Muramoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToF-SIMS+Analysis+of+Adsorbed+Proteins%3A+Principal+Component+Analysis+of+the+Primary+Ion+Species+Effect+on+the+Protein+Fragmentation+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">ToF-SIMS Analysis of Adsorbed Proteins: Principal Component Analysis of the Primary Ion Species Effect on the Protein Fragmentation Patterns.</a> J. Phys. Chem. C. 115 (49), 24247-24255 (2011).</li>
<li>Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+interpretation+of+ToF-SIMS+measurements+on+adsorbed+proteins+using+PCA%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Interface+Anal%22%5BJournal%5D)">Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA.</a> Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).</li>
<li>Gustavsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modifications+of+silicon+nitride+for+cellular+biosensor+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.-Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications.</a> J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).</li>
<li>Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+plasma+proteins+and+fibronectin+on+poly%28hydroxylethyl+methacrylate%29+brushes+of+different+thickness+and+their+relationship+with+adhesion+and+migration+of+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Biomater%22%5BJournal%5D)">Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells.</a> Regen Biomater. , 17-25 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

SALVI ist ein Mikrofluidik-Schnittstelle, die durch Vakuumbasierte Instrumente, wie TOF-SIMS und Rasterelektronenmikroskopie (SEM) dynamische Flüssigkeitsoberfläche und Flüssig-Fest-Schnittstellenanalyse ermöglicht. Durch die Verwendung von kleinen Öffnungen Flüssigkeit auszusetzen direkt im Vakuum, ist SALVI für viele fein fokussierten Spektroskopie und bildgebenden Verfahren ohne Änderungen; 22 die Portabilität und Flexibilität der Mikrofluidik es eine echte multimodale Bildgebungsplattform machen. Besonder...

Hydratation ist entscheidend für die Struktur, Konformation 1, 2 und 3 der biologischen Aktivität von Proteinen. Proteine ​​ohne Wassermoleküle um sie herum wäre nicht lebensfähig biologischen Aktivitäten haben. Genauer gesagt, interagieren Wassermoleküle mit der Oberfläche und die innere Struktur von Proteinen und verschiedenen Hydratationszustände von Proteinen machen solche Wechselwirkungen deutlich. 4 Die Wechselwirkung von Proteinen mit festen Oberflächen ist ein grundlegendes Phänomen mit Auswirkungen im Bereich der Nanotechnologie, Biomaterialien und Prozesse Tissue Engineering. Studien haben darauf hingewiesen, dass lange Konformationsänderungen eintreten können als ein Protein mit einer Oberfläche trifft. ToF-SIMS wurde als ein Verfahren, vorgesehen, dass das Potenzial, die Protein-fest-Grenzfläche zu untersuchen hat. 5-7 ist es wichtig, die Hydratation von Proteinen auf festen Oberflächen zu verstehen, die möglicherweise ein grundlegendes Verständnis des Mechanismus ihrer Struktur liefert, Konformation und biologischeal Aktivität. Allerdings sind große Oberflächenanalysetechniken meistens vakuumbasierten und direkte Anwendungen für flüchtige Flüssigkeit Studien sind schwierig aufgrund der raschen Verdampfung der flüchtigen Flüssigkeit unter der Vakuumumgebung. Wir entwickelten ein Vakuum kompatibel mikrofluidische Schnittstelle, System zur Analyse auf dem Liquid Vacuum Interface (SALVI), direkte Beobachtungen von Flüssigkeitsoberflächen und Flüssig-Fest-Interaktionen zu ermöglichen mit Time-of-Flight-Sekundärionenmassenspektrometrie (TOF-SIMS). 8- 11 die einzigartigen Aspekte schließen die folgenden ein: 1) das Detektionsfenster eine Öffnung von 2-3 um im Durchmesser direkte Abbildung der Flüssigkeitsoberfläche ermöglicht, 2) Oberflächenspannung wird die Flüssigkeit in der Öffnung zu halten, und 3) ist SALVI tragbaren zwischen mehreren Analyseplattformen. 11,12 SALVI besteht aus einem Siliziumnitrid (SiN) Membran als dem Erfassungsbereich und einem Mikrokanal aus Polydimethylsiloxan (PDMS). Es ist fabrcated im Reinraum, und die Herstellung und die wichtigsten Designfaktoren wurden in früheren Veröffentlichungen und Patenten ausführlich dargestellt. 8-12 Die Anwendungen der TOF-SIMS als analytisches Werkzeug wurden gezeigt, eine Vielzahl von wässrigen Lösungen und komplexen Flüssigkeitsmischungen verwenden, einige der die Nanopartikel enthalten. 13-17 Insbesondere SALVI Flüssigkeit TOF-SIMS ermöglicht der flüssig-Fest-Grenzfläche von lebenden biologischen Systemen Rammsondierung (dh Biofilme), Einzelzellen und Festelektrolyt-Schnittstelle, für neue Möglichkeiten öffnen in situ kondensierten Phase Studien einschließlich Flüssigkeiten TOF-SIMS verwenden. Allerdings ist der aktuelle Entwurf noch nicht Gas-Flüssigkeits-Interaktionen ermöglichen. Dies ist eine Richtung für die zukünftige Entwicklung. SALVI wurde verwendet, um den hydratisierten Proteinfilm in dieser Arbeit zum ersten Mal zu studieren. Fibronectin ist ein häufig verwendetes Protein-Dimer, bestehend aus zwei nahezu identischen Monomeren durch ein Paar Disulfidbindungen verbunden sind, 18, ​​die is für seine Fähigkeit, bekannte Zellen zu binden. 19,20 Sie als Modellsystem ausgewählt wurde zu veranschaulichen, dass die hydrierten Proteinfilm dynamisch die SALVI Flüssigkeit mit TOF-SIMS Ansatz untersucht werden konnte. Die Proteinlösung wurde in den Mikrokanal eingeführt. Nach Inkubation für 12 Stunden, ein hydratisiertes Proteinfilm auf der Rückseite des SiN-Membran gebildet. Deionisiertes Wasser (DI) wurde verwendet, um den Kanal nach der Protein Einführung abzuspülen. Die Informationen wurden in der SALVI Mikrokanal mit dynamischen TOF-SIMS aus hydrierten Fibronektin Proteinmolekülen gesammelt. DI-Wasser wurde ebenfalls als Kontrolle untersucht mit den Ergebnissen aus hydrierten Fibronektin Dünnschicht erhalten zu vergleichen. Deutliche Unterschiede zwischen dem hydratisierten Proteinfilm und DI-Wasser beobachtet. Diese Arbeit zeigt, dass die Proteinadsorption an der Oberfläche in der flüssigen Umgebung können mit dem neuartigen SALVI und Flüssigkeit TOF-SIMS Ansatz untersucht werden. Die Video-Protokoll ist für den Menschen eine technische Anleitung zur Verfügung zu stellen, die daran interessiert sindin diese neue Analysewerkzeug für vielfältige Anwendungen von SALVI mit TOF-SIMS zu nutzen und unnötige Fehler in Liquid Handling sowie TOF-SIMS Datenerfassung und -analyse zu reduzieren.

<table><tbody><tr><td>ToF-SIMS</td><td>IONTOF</td><td>TOF. SIMS 5</td><td>Auflösung: >10.000 m/&Delta; m für Massenauflösung; >4.000 m/&Delta; m für hohe räumliche Auflösung&nbsp;</td></tr><tr><td>System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)</td><td>Pacific Northwest National Laboratory</td><td>N/A</td><td>SALVI ist ein einzigartiges, in sich geschlossenes, tragbares Analysegerät, das es zum ersten Mal ermöglicht, vakuumbasierte wissenschaftliche Instrumente wie die Flugzeit-Sekundärionen-Massenspektrometrie (ToF-SIMS) zu analysieren, um Flüssigkeitsoberflächen in ihrem natürlichen Zustand auf molekularer Ebene zu analysieren.</td></tr><tr><td>PEEK Union</td><td>Valco</td><td>ZU1TPK</td><td>zum Verbinden des Einlasses und Auslasses von SALVI</td></tr><tr><td>5 Achsen Probentisch</td><td>IONTOF</td><td>N/A</td><td>Tisch ist selbstgebaut für die Montage SALVI in ToF-SIMS</td></tr><tr><td>Barnstead Nanopure Water Pur Water Purification System</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific D11921</td><td>ROpure LP Umkehrosmose Filtrationsmodul (D2716)</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-377-821</td><td>Bereich: 100 bis 1.000 ml</td></tr><tr><td>Pipettenspitze</td><td>Neptune</td><td>2112.96.BS</td><td>1.000 & Mikro; l</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S25310A</td><td>95% vergällt</td></tr><tr><td>Gibco PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>pH 7,4</td></tr></tbody></table>

in-situ-charakterisierung von hydrated proteine ​​in wasser durch salvi und tof-sims

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

Diese Arbeit zeigt, in-situ-Charakterisierung von Protein Biomolekülen in der wässrigen Lösung in dem Liquid Vacuum-Schnittstelle des Systems für die Analyse unter Verwendung von (SALVI) und Time-of-Flight-Sekundärionenmassenspektrometrie (TOF-SIMS). Die Fibronektin Proteinfilm wurde auf dem Siliziumnitrid (SiN), die die Membran immobilisiert SALVI Erfassungsbereich bildet. Während ToF-SIMS-Analyse wurden drei Arten der Analyse durchgeführt, einschließlich hoher räumlicher Auflösung Massenspektrometrie, zweidimensionale (2D) Bildgebung und Tiefenprofilierung. Massenspektren wurden im positiven und negativen Modus erworben. Entionisiertes Wasser wurde als Referenzprobe analysiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Fibronektin Film in Wasser hat deutlicher und stärker Spitzen Wassercluster zu Wasser allein verglichen. Charakteristische Peaks von Aminosäure-Fragmente sind ebenfalls zu beobachten in der hydratisierten Protein TOF-SIMS-Spektren. Diese Ergebnisse zeigen, dass Proteinmolekül Adsorption an einer Oberfläche dynamica sucht werden könnenlly Verwendung SALVI und ToF-SIMS in der flüssigen Umgebung zum ersten Mal.

Einige repräsentative Ergebnisse sind die Vorteile des vorgeschlagenen Protokolls zu demonstrieren. Durch die Verwendung der Mikrofluid-SALVI Schnittstelle der Primärionenstrahl (Bi 3 +) auf dem hydratisierten Film Fibronektin in DI Wasser direkt bombardieren. So ist die molekulare chemische Kartierung der Flüssigkeitsoberfläche erfolgreich erworben werden kann. 1a und 1b...

Diese Arbeit stellt ein Protokoll für die Flüssigkeitshandhabung und Probenaufgabe zu einem Mikrokanal zur in situ-Time-of-Flight-Sekundärionen-Massenspektrometrie-Analyse von Protein Biomolekülen in einer wässrigen Lösung.

In-situ-Charakterisierung von Hydrated Proteine ​​in Wasser durch SALVI und TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, adsorbierte Proteinfilme in wässrigen Lösungen mittels des Systems zur Analyse an der Flüssigkeits-Vakuum-Grenzfläche und der Flugzeit-Sekundärionen-Massenspektrometrie zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu Biomolekülen und der Biogrenzfläche zu beantworten. Zum Beispiel die Charakterisierung adsorbierter Proteine an einer festen Oberfläche.Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass die Biomoleküle direkt in situ in der flüssigen Umgebung und in Kombination mit molekularer Kartierung gestartet werden können. Obwohl diese Methode Einblicke in Biomoleküle an der Fest-Flüssig-Grenzfläche ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, einschließlich der Untersuchung einzelner Krebszellen, von Arzneimittelwechselwirkungen und der Anheftung von Biofilmen. Ziehen Sie mit einer Fünf-Milliliter-Spritze zwei Milliliter einer 70 %igen Ethanol-Lösung auf.Schließen Sie die Spritze an das Einlassende des SALVI-Geräts an und injizieren Sie langsam einen Milliliter der Flüssigkeit über einen Zeitraum von 10 Minuten. Entfernen Sie am Ende der Injektion die Spritze und verbinden Sie Einlass und Auslass des SALVI mithilfe einer Polyether-Ether-Keton-Verbindung. Lassen Sie den SALVI-Mikrokanal vier Stunden lang bei Raumtemperatur mit der 70 %igen Ethanol-Lösung gefüllt.Füllen Sie anschließend eine zweite Spritze mit steriler entionisierter Wasser. Schließen Sie sie an den Eingang des SALVI an und injizieren Sie langsam das entionisierte Wasser über einen Zeitraum von 10 Minuten in das Gerät. Entfernen Sie die Spritze und verbinden Sie den Eingang und den Ausgang des Geräts erneut miteinander.Um einen Proteinfilm zu immobilisieren, ziehen Sie zunächst zwei Milliliter Fibronectin-Lösung in eine Spritze auf. Schließen Sie die Spritze an den Eingang des SALVI-Geräts an und injizieren Sie langsam einen Milliliter der Flüssigkeit über einen Zeitraum von 10 Minuten. Entfernen Sie danach die Spritze und verbinden Sie erneut Ein- und Ausgang miteinander.Die Anordnung 12 Stunden lang in einer sauberen Kulturschale bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation langsam über einen Zeitraum von 10 Minuten ein Milliliter sterilem, deionisiertem Wasser zugeben und anschließend den Inlet erneut mit dem Outlet verbinden. Zunächst wird die ToF-SIMS-Probenhalterung auf eine flache, saubere Oberfläche gelegt.Platzieren Sie das SALVI-Gerät mit der nach oben zeigenden Siliziumwafer- und Siliziumnitridmembran auf dem Objektträger. Befestigen Sie das SALVI-Gerät mit vier metallenen Klemmstücken am Objektträger, und schrauben Sie die Metallstücke, die an den Ecken des Geräts befestigt sind, mit vier Schrauben an der Metallplatte fest. Rollen Sie anschließend vorsichtig die mit dem mikrofluidischen Kanal verbundene PTFE-Schlauchleitung auf.Verwenden Sie vier Metallteile und vier Schrauben, um den starren Teil festzuhalten. Stellen Sie sicher, dass das Gerät im freien Bereich des Stages positioniert ist, sodass es während der Analyse nicht mit dem primären Ionenstrahl interferiert. Befestigen Sie anschließend die Faradaycup mit einer Schraube am Stage.Öffnen Sie dann die Lastverschlusskammer (Loadlock) des ToF-SIMS und stellen Sie den Probenträger horizontal auf die Ladeplattform, bevor Sie die Kammer schließen. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein und lassen Sie das Vakuum im Loadlock auf etwa 10 hoch minus sechs Millibar absinken. Bewegen Sie das SALVI-Gerät nach etwa 30 Minuten, sobald sich das Vakuum stabilisiert hat, in die Hauptkammer.Stellen Sie den primären Ionenstrahl und den Analysator des ToF-SIMS gemäß der vom Hersteller empfohlenen Anleitung so ein, dass eine räumliche Auflösung von etwa 400 Nanometern erreicht wird. Suchen Sie anschließend den mikrofluidischen Kanal mit dem optischen Mikroskop. Verwenden Sie das Zentrum des optischen Bildes als Referenz und richten Sie es so aus, dass es mit dem Zentrum des Sekundärionen-Bildes übereinstimmt.Die visuelle Demonstration dieses Schritts ist entscheidend, da er schwer zu erlernen ist, weil die Probe dicker ist als normale feste Proben, und es schwierig ist, die Einstellungen so anzupassen, dass die optimale Fokussierung des Kanals erreicht wird. Vor jeder Messung ein ein Kiloelektronvolt starkes Sauerstoffstrahl auf das Siliziumnitrid-Fenster für etwa 15 Sekunden richten, um Oberflächenkontaminationen zu entfernen. Verwenden Sie außerdem eine Elektronen-Überflutungspistole, um während aller Messungen eine Oberflächenaufladung auszugleichen.Wählen Sie als Nächstes den positiven oder negativen Modus aus, bevor Sie mit der Datenaufnahme beginnen. Verwenden Sie in allen Messungen den primären Ionenstrahl aus 25 Kiloelektronenvolt-Bismut drei plus. Für die Tiefenprofilierung scannen Sie den primären Ionenstrahl über eine kreisförmige Fläche mit einem Durchmesser von etwa zwei Mikrometern bei einer Auflösung von 32 Pixel mal 32 Pixel.Um die Zeit für das Durchschlagen der Siliziumnitridmembran zu minimieren, verwenden Sie einen primären Ionenstrahl mit langer Impulsbreite. Nach dem Durchschlagen der Siliziumnitridmembran dieselbe Stromstärke etwa 200 Sekunden lang beibehalten, um ausreichende Daten für zweidimensionale Bildrekonstruktionen zu erhalten. Zur Datensammlung die Impulsbreite auf 80 Nanosekunden verringern, um Spektren mit besserer Massenauflösung zu erfassen.Setzen Sie diese Erfassung für etwa weitere 200 Sekunden fort. Mithilfe der SALVI-Mikrofluidik-Schnittstelle kann der primäre Ionenstrahl direkt auf den hydratisierten Fibronectin-Film treffen. Eine Reihe von Wasserclustern und Aminosäurefragmenten wird durch die ToF-SIMS-Massenspektrometriedaten angezeigt.Dies liefert einen direkten Nachweis für die Eigenschaft von Wassermolekülen, die sich sowohl außerhalb als auch innerhalb der hydratisierten Proteine befinden. Hier ist die Tiefenprofil-Zeitreihe des hydratisierten Fibronectin-Films sowie von entionisiertem Wasser zu sehen. Die Intensitäten ausgewählter Sekundärionen sind vernachlässigbar, bevor die Siliziumnitrid-Membran durchstoßen wird.Sobald die Siliziumnitrid-Membran durchstoßen ist, nehmen die Intensitäten der sekundären Ionen deutlich zu. Das Verfahren mit kurzer Impulsdauer wird verwendet, um Daten mit besserer Massenauflösung für die Bild- und Spektrumrekonstruktion zu erhalten. Die 2-D-Bilder aus dem hydratisierten Fibronectin-Film und entionisiertem Wasser stellen die Anzahl der ausgewählten sekundären Ionen aus der Probe dar.Je heller das Bild, desto höher ist die Anzahl der Sekundärionen. Diese intuitiven Bilder ermöglichen einen klaren Vergleich ausgewählter Sekundärionen zwischen verschiedenen Proben, was bei der Datenanalyse hilfreich ist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass ein Mikroreaktor vor der Installation in der Vakuumkammer dicht sein muss.Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Biologie und Biointerfaces, um die Proteinadsorption, Biofilmanheftung, oberflächenassoziierte Monolagen sowie zahlreiche andere Phänomene zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie verschiedene flüssige Proben mittels SALVI und der flüssigen ToF-SIMS untersucht werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Das Ziel dieses Experiments ist es, zu bestimmen und steuern die Größe, Form und Stabilität des self-assembled diskotischen Amphiphile in Wasser. Für wässriger Basis supramolekularer Polymere wie Maß an Kontrolle ist sehr schwierig. Wir wenden eine Strategie sowohl mit abstoßenden und anziehenden Wechselwirkungen. Die experimentellen Techniken angewandt, um dieses System charakterisieren, sind breit anwendbar.

Steuern der Größe, Form und Stabilität der supramolekularen Polymeren in Wasser

Mehr als die Hälfte der Proteine ​​sind kleine Proteine ​​(Molekularmasse &lt;200 kDa), die herausfordernd sind sowohl für Elektronenmikroskop Bildgebung und dreidimensionale Rekonstruktionen. Optimierte negative Färbung ist eine robuste und Hochdurchsatz-Protokoll, um einen hohen Kontrast und eine relativ hohe Auflösung (~ 1 nm) Bilder von kleinen asymmetrische Proteine ​​oder Komplexe unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu erhalten.

Optimierte negative Färbung: ein Hochdurchsatz-Protokoll für die Prüfung kleiner und asymmetrische Proteinstruktur durch Elektronenmikroskopie

Weiche Landung der massenselektierten Ionen auf Oberflächen ist ein leistungsfähiges Konzept für die hoch-gesteuerte Herstellung von neuen Materialien. Mit der Analyse von in-situ-Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS) und Infrarot-Reflexions-Absorptions-Spektroskopie (IRRAS) gekoppelt ist, bietet weiche Landung beispiellose Einblicke in die Wechselwirkungen von gut definierten Arten mit Oberflächen.

In-situ-SIMS und IR-Spektroskopie von gut definierten Oberflächen durch weiche Landung der Messe-Ionen ausgewählt Vorbereitet

Schlüsselschritte der Proteinfunktion, insbesondere Änderungen der Stützknochenkonformation und Protonentransferreaktionen, finden oft auf der Zeitskala von Mikrosekunden bis Millisekunden statt. Diese dynamischen Prozesse können mit der zeitaufgelösten Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie untersucht werden, insbesondere für Proteine, deren Funktion durch Licht ausgelöst wird.

Protonen-Transfer und Protein-Zustände Dynamics in Lichtempfindliche Proteine, die durch zeitaufgelöste Step-Scan Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie

Sedimentationsgleichgewicht (SE) kann verwendet werden, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in einer physiologischen Umgebung zu untersuchen. Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung dieser Technik, um die Wirkung des pH-Werts auf die Stabilität eines Homo-Pentamers zu bestimmen, das aus dem kleinen hydrophoben (SH) Protein gebildet wird, das vom humanen Synzytial-Respiratorischen Virus (hRSV) kodiert wird.

Sedimentationsgleichgewicht eines Klein Oligomer bildenden Membrane Protein: Wirkung von Histidin Protonierung auf pentamere Stabilität

Hier präsentieren wir detaillierte Protokolle für die Festkörper-Amid-Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (ssHDX-MS) und die Festkörper-Photolytische Markierungs-Massenspektrometrie (ssPL-MS) für Proteine in festen Pulvern. Die Methoden liefern hochauflösende Informationen über die Proteinkonformation und -wechselwirkungen im amorphen Festkörper, die für das Formulierungsdesign nützlich sein können.

Massenspektrometrische Ansätze zur Proteinstruktur und Wechselwirkungen zu untersuchen in lyophilisierte Pulver

Dieser Artikel stellt eine Methode für den Anbau eines Biofilms für in Situ Time-of-Flight secondary Ion Massenspektrometrie für chemische Zuordnung im hydratisierten Zustand durch einen mikrofluidischen Reaktor, System zur Analyse an der flüssigen Vakuum-Schnittstelle aktiviert. Die Shewanella Oneidensis MR-1 mit grünen Fluoreszenz-Protein wurde als Modell verwendet.

In Situ Charakterisierung von Shewanella Oneidensis MR1 Biofilmen von SALVI und ToF-SIMS

Wir präsentieren ein Verfahren zur Echtzeit-Bildverarbeitung und Analyse der Elementzusammensetzung Böhmit Partikel in entionisiertem Wasser durch in Situ Flüssigkeit Scanning Electron Microscopy.

In Situ Charakterisierung von Böhmit Teilchen im Wasser mit flüssigem SEM

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Struktur und Dynamik der Grenzflächen Wasser auf atomarer Skala, in Bezug auf die submolekulare Auflösung, Molekulare Manipulation und einzelne Bindung Schwingungs-Spektroskopie untersuchen.

Erforschung der Struktur und Dynamik von Grenzflächen Wasser mit Scanning Tunneling-Mikroskopie und Spektroskopie

Dieses Protokoll beschreibt einen Kalibrierung-freie Ansatz zur Quantifizierung der Protein Homo-Oligomerisierung in Vitro basierend auf Fluoreszenzspektroskopie Fluktuation mit kommerziellen Licht Rasterelektronenmikroskopie. Die richtige Übernahme Einstellungen und Analysemethoden werden angezeigt.

Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software

Die Neutronenrückstreuspektroskopie bietet einen zerstörungsfreien und markierungsfreien Zugang zur ps-ns-Dynamik von Proteinen und deren Hydratationswasser. Der Workflow wird anhand von zwei Studien zu Amyloid-Proteinen vorgestellt: zur zeitaufgelösten Dynamik von Lysozym während der Aggregation und zur Hydratationswasserdynamik von Tau bei der Faserbildung.

Hochauflösende Neutronenspektroskopie zur Untersuchung der Pikosekunden-Nanosekunden-Dynamik von Proteinen und Hydratationswasser

Lernen Sie die Charakterisierung adsorbierter Proteinfilme in wässrigen Lösungen durch SALVI und Flugzeit-Sekundärionenmassenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die In-situ-Analyse von Biomolekülen an Feststoff-Flüssigkeits-Grenzflächen.

In-situ-Charakterisierung von Hydrated Proteine ​​in Wasser durch SALVI und TOF-SIMS

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