In-situ-Charakterisierung von Hydrated Proteine ​​in Wasser durch SALVI und TOF-SIMS

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Charakterisierung adsorbierter Proteinfilme in wässrigen Lösungen unter Verwendung des Systems for Analysis at the Liquid Vacuum Interface und der Flugzeit-Sekundärionen-Massenspektrometrie. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu Biomolekülen und der Biogrenzfläche zu beantworten. Zum Beispiel die Charakterisierung von adsorbierten Proteinen an einer festen Oberfläche.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Biomoleküle in situ in der flüssigen Umgebung und in Kombination mit molekularem Mapping gestartet werden können. Obwohl diese Methode Einblicke in Biomoleküle an der Fest-Flüssig-Grenzfläche geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, einschließlich der Untersuchung einzelner Krebszellen, Arzneimittelwechselwirkungen und der Anheftung von Biofilmen. In eine Fünf-Milliliter-Spritze werden zwei Milliliter einer 70%igen Ethanollösung aufgezogen.

Schließen Sie die Spritze an das Einlassende des SALVI Geräts an und injizieren Sie langsam einen Milliliter der Flüssigkeit über einen Zeitraum von 10 Minuten. Entfernen Sie am Ende der Injektion die Spritze und verbinden Sie den Einlass und Auslass des SALVI mit einer Polyetherether-Keton-Verbindung. Halten Sie den SAVI-Mikrokanal mit der 70%igen Ethanollösung vier Stunden lang bei Raumtemperatur.

Füllen Sie dann eine zweite Spritze mit sterilem entionisiertem Wasser. Schließen Sie es an den Einlass des SALVI an und injizieren Sie das deionisierte Wasser langsam über einen Zeitraum von 10 Minuten in das Gerät. Entfernen Sie die Spritze und verbinden Sie den Einlass und den Auslass des Geräts wieder miteinander.

Um einen Proteinfilm zu immobilisieren, beginnen Sie damit, zwei Milliliter Fibronektinlösung in eine Spritze aufzuziehen. Schließen Sie die Spritze an den Einlass des SALVI Geräts an und injizieren Sie langsam einen Milliliter der Flüssigkeit über einen Zeitraum von 10 Minuten. Entfernen Sie dann die Spritze und schließen Sie den Einlass und Auslass wieder an.

Inkubieren Sie das Setup in einer sauberen Kulturschale bei Raumtemperatur für 12 Stunden. Injizieren Sie nach der Inkubation langsam einen Milliliter steriles entionisiertes Wasser über einen Zeitraum von 10 Minuten und verbinden Sie dann den Einlass wieder mit dem Auslass. Legen Sie zunächst den ToF-SIMS-Tisch auf eine ebene, saubere Fläche.

Stellen Sie das SLAVI-Gerät mit dem Siliziumwafer und der Siliziumnitridmembran nach oben auf den Tisch. Befestigen Sie das SLAVI-Gerät mit vier Klemmstücken aus Metall auf dem Tisch und schrauben Sie die Metallteile, die die Ecke des Geräts halten, mit vier Schrauben in die Metallplatte. Rollen Sie anschließend den PFTE-Schlauch, der mit dem mikrofluidischen Kanal verbunden ist, vorsichtig auf.

Verwende vier Metallteile und vier Schrauben, um den steifen Teil festzuhalten. Stellen Sie sicher, dass das Gerät im offenen Raum auf dem Tisch positioniert ist, damit es den primären Ionenstrahl während der Analyse nicht stört. Montieren Sie anschließend den Faraday-Becher mit einer Schraube auf der Bühne.

Öffnen Sie dann die ToF-SIMS-Schleusentür und stellen Sie die Bühne horizontal auf die Ladefläche, bevor Sie die Tür schließen. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein und lassen Sie die Schleusenkammer auf etwa 10 bis minus sechs Millibar herunterpumpen. Bewegen Sie das salvi Gerät dann nach etwa 30 Minuten in die Hauptkammer, sobald das Vakuum stabilisiert ist.

Passen Sie den primären Ionenstrahl und den Analysator des ToF-SIMS so an, dass eine räumliche Auflösung von ca. 400 Nanometern erreicht wird, indem Sie dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll folgen. Suchen Sie als Nächstes den mikrofluidischen Kanal mit dem optischen Mikroskop. Verwenden Sie das optische Bildzentrum als Referenz, und richten Sie es so aus, dass es mit dem sekundären Ionenbildzentrum konsistent ist.

Die visuelle Demonstration dieses Schritts ist von entscheidender Bedeutung, da er schwer zu erlernen ist, da die Probe dicker ist als normale feste Proben und es schwierig ist, die Einstellungen anzupassen, um den besten Fokus des Kanals zu finden. Verwenden Sie vor jeder Messung einen Sauerstoffstrahl von einem Kiloelektronenvolt, um das Siliziumnitrid-Fenster etwa 15 Sekunden lang zu scannen, um Oberflächenverunreinigungen zu entfernen. Verwenden Sie außerdem eine Elektronenflutpistole, um die Oberflächenaufladung während aller Messungen zu kompensieren.

Wählen Sie anschließend den positiven oder negativen Modus aus, bevor Sie mit der Datenerfassung beginnen. Verwenden Sie bei allen Messungen den 25 Kiloelektronenvolt großen Wismut three plus als primären Ionenstrahl. Für die Tiefenprofilierung wird der primäre Ionenstrahl auf einer runden Fläche mit einem Durchmesser von etwa zwei Mikrometern mit einer Auflösung von 32 x 32 Pixeln abgetastet.

Um die Zeit zu minimieren, die zum Durchstechen der Siliziumnitridmembran erforderlich ist, verwenden Sie einen Primärionenstrahl mit langer Pulsbreite. Halten Sie nach dem Durchstechen der Siliziumnitridmembran den gleichen Strom für etwa 200 Sekunden, um genügend Daten für zweidimensionale Bildrekonstruktionen zu erhalten. Reduzieren Sie für die Datenerfassung die Pulsbreite auf 80 Nanosekunden, um Spektren mit besserer Massenauflösung zu erfassen.

Setzen Sie diese Erfassung für weitere etwa 200 Sekunden fort. Mit Hilfe der mikrofluidischen Schnittstelle SALVI kann der primäre Ionenstrahl direkt auf den hydratisierten Fibronektinfilm bombardieren. Eine Reihe von Wasserclustern und Aminosäurefragmenten wird durch die ToF-SIMS-Massenspektrometriedaten angezeigt.

Dies ist ein direkter Beweis für die Eigenschaft von Wassermolekülen, die die hydratisierten Proteinmoleküle umgeben und sich im Inneren befinden. Hier sieht man die Tiefenprofil-Zeitreihen des hydratisierten Fibronektinfilms und des deionisierten Wassers. Die Intensitäten ausgewählter zweiter Ionen sind vernachlässigbar, bevor die Siliziumnitrid-Membran durchgestanzt wird.

Ist die Siliziumnitrid-Membran durchstanzt, nehmen die Intensitäten der Sekundärionen deutlich zu. Das Verfahren mit kurzer Pulsbreite wird verwendet, um Daten mit besserer Massenauflösung für Bild- und Spektralrekonstruktionen zu erhalten. Die 2-D-Bilder des hydratisierten Fibronektinfilms und des deionisierten Wassers stellen die Anzahl ausgewählter Sekundärionen aus der Probe dar.

Je heller das Bild, desto höher ist die Anzahl der Sekundärionen. Diese intuitiven Bilder ermöglichen einen klaren Vergleich ausgewählter Sekundärionen zwischen verschiedenen Proben, was bei der Datenanalyse hilfreich ist. Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass ein Mikroreaktor vor dem Einbau in die Vakuumkammer leckagefrei sein muss.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Biologie und Biogrenzflächen den Weg, um die Proteinadsorption, die Biofilmbindung, oberflächenmontierte Monoschichten und viele andere Phänomene zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie verschiedene flüssige Proben mit SALVI und dem flüssigen ToF-SIMS untersuchen können.