Gleichstrom-Stimulation und Multi-Elektroden-Array-Aufnahme von Seizure-ähnliche Aktivität in Mäuse-Gehirn Scheibe Vorbereitung

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens besteht darin, die Anordnung der Elektroden in der Ableitungskammer für die Gleichstromstimulation eines Gehirnschnitts zu untersuchen und deren Auswirkungen auf mit einem Multielektrodenarray aufgezeichnete anfallsähnliche Aktivität zu analysieren. Dies kann helfen, zentrale Fragen zur Gleichstromstimulation und zur mit einem Multielektrodenarray erfassten anfallsähnlichen Aktivität im Gehirnschnitt der Maus zu beantworten. Ein Vorteil dieser Methode liegt darin, dass die Wirkungen der Gleichstromstimulation in einem spezifischen Pfad des Gehirnschnitts der Maus bewertet werden können.

Die Durchführung des Verfahrens erfolgt durch Hsiang Chin und Wei-Jen Chang, Techniker aus meinem Labor. Sterilisieren Sie in diesem Verfahren alle chirurgischen Instrumente mit einer 75 %igen Ethanol-Lösung vor dem Experiment. Danach wird der Schädel des Tieres freigelegt und das verbleibende Muskelgewebe entfernt.

Als Nächstes entfernen Sie mit einer Rongeur die dorsale Schädeloberfläche und beschneiden die Seiten. Anschließend schneiden Sie mit einem Spatel die Riechkolben und Nervenverbindungen entlang der ventralen Gehirnoberfläche durch, bevor Sie das Gehirn entfernen. Überführen Sie das Gehirn umgehend in einen Becher, der mit eiskaltem, mit Sauerstoff angereichertem ACSF gefüllt ist.

Um Schnitte mit der MT-ACC-Bahn vorzubereiten, führen Sie einen sagittalen Schnitt 2 mm lateral zur Mittellinie in jeder Hemisphäre durch, um die subkortikale Anatomie sichtbar zu machen. Danach führen Sie einen schrägen Querschnitt parallel zum sichtbaren Fasertrakt im Striatum durch. Führen Sie den zweiten schrägen Querschnitt von der Verbindung zwischen Kleinhirn und visueller Rinde bis zum Mittelpunkt zwischen der vorderen Commissura und dem Nervus opticus durch, der ventral und parallel zur Thalamus-Zingulum-Bahn verläuft.

Danach befestigen Sie den Gehirnblock mit einem Cyanacrylat-Klebstoff an einer Winkelschneide. Führen Sie einen Schnitt direkt oberhalb des Wendepunkts der Bahnung durch. Danach klappen Sie die Schneide auf, glätten sie und kleben sie auf die Kammerplattform eines Vibratoms.

Schneiden Sie die Gehirnschnitte anschließend mit einer Dicke von 500 Mikrometern und bewahren Sie sie in mit Sauerstoff gesättigter, eiskalter ACSF auf. Überführen Sie einen Schnitt in die Ableitungskammer bei 32 Grad Celsius mit kontinuierlicher Spülung durch mit Sauerstoff gesättigte ACSF für eine Stunde. Überprüfen Sie die Positionierung einer MEA-Sonde am Mehrkanalsystem.

Verwenden Sie ein Rohr, um das ACSF in die MEA-Kammer zu leiten, und das andere Rohr, um das ACSF aus der Kammer abzuleiten. Perfundieren Sie das Präparat kontinuierlich mit warmem, mit Sauerstoff angereichertem ACSF bei 30 Grad Celsius. Übertragen Sie mit einem feuchten Wattestäbchen eine Gehirnscheibe auf die MEA.

Verschieben Sie die Gehirnscheibe vorsichtig, sodass der ACC über den Elektroden liegt, und stabilisieren Sie die Gehirnscheibe anschließend mit einem Scheibenhalter, um eine gute elektrische Verbindung zwischen der Scheibe und den Elektroden sicherzustellen. Danach platzieren Sie die Anodenelektrode proximal zum ACC und die Kathodenelektrode distal zum ACC. Nehmen Sie die Feldstärke durch die beiden Feldorientierungen des MEA auf.

Dann liefern Sie elektrische Ströme mithilfe eines Stimulators. Passen Sie den Abstand zwischen den beiden Silberchlorid-Elektroden auf etwa 1,5 bis 2 cm an und stellen Sie die Stromstärke des Stimulators so ein, dass die DCS zwischen 0,5 und 2 Milliampere liegt. Platzieren Sie in diesem Verfahren eine Wolframelektrode im MT und geben Sie Impulse vom Stimulator an den thalamischen Bereich des Schnitts ab.

Verwenden Sie anschließend verschiedene Stromstärken, um die Schwelle zu bestimmen, die eine ACC-Antwort hervorruft. Bewegen Sie die Wolframelektrode entlang der Thalamus-Cingulat-Bahn, um das optimale Antwortprofil zu erzielen. Registrieren Sie 1–20 ACC-Antworten und verwenden Sie die Software, um automatisch alle durch MT-Stimulation hervorgerufenen ACC-Antworten zu mitteln.

Um anfallsähnliche Aktivität hervorzurufen, 250 Mikromolar 48P und 5 Mikromolar Bicucullin zur Perfusionslösung hinzufügen und die Schnitte zwei bis drei Stunden weiterhin durchströmen lassen. Die Pumpe auf einer relativ hohen Perfusionsrate halten, was helfen kann, die Bildung eines pH-Gradienten zu verhindern. Danach die Wolframelektrode am MT positionieren und elektrische Reize anlegen, um ein ACC-Antwortprofil zu erhalten.

Notieren Sie 10–20 Durchläufe und mitteln Sie die Antworten. Danach ersetzen Sie die Vorfusionlösung durch frisches ACSF, um die Wirkstoffe auszuwaschen. Stellen Sie bei diesem Verfahren sicher, dass ein gleichmäßiges elektrisches Feld erzeugt wird, indem Ströme zwischen zwei parallelen, mit Silberchlorid beschichteten Silberdrähten geleitet werden, die im MEA-Kammerinneren platziert sind.

Falls keine Probleme auftreten, sollte der DCS zwischen 0,5 und 2 Milliampere liegen. Schalten Sie als Nächstes den DCS aus und stimulieren Sie den Thalamus mit einer Wolframelektrode. Um maximale synaptische Antworten im ACC zu erhalten, nehmen Sie 10–20 Antworten auf und bilden Sie anschließend den Mittelwert.

Danach schalten Sie die DCS ein und stimulieren gleichzeitig den Thalamus. Bewerten Sie die Amplitudenänderungen der durch die thalamische Stimulation hervorgerufenen ACC-Antwort während der DCS. Schalten Sie nun die DCS aus, geben Sie 250 µM 48P und 5 µM Bicucullin zur Perfusionslösung hinzu und warten Sie 2–3 Stunden.

Wenn die Wirkstoffe den Gehirnschnitt beeinflussen, sollte der Schnitt kortikale Anfallsreaktionen hervorrufen. Sammeln Sie anschließend 10–20 kortikale Reaktionen des vorderen cingulären Cortex und messen Sie Amplitude und Dauer der elektrisch hervorgerufenen kortikalen Anfallsreaktionen. Danach schalten Sie die DCS ein und stimulieren gleichzeitig den Thalamus.

Beurteilen Sie die Änderungen in der Amplitude und Dauer der evozierten kortikalen Anfallsreaktionen während der DCS-Anwendung. Danach ersetzen Sie die Perfusionslösung durch frisches ACSF, um die Wirkstoffe auszuwaschen. Diese Abbildung zeigt verschiedene evozierte Reaktionen, darunter die durch thalamische Stimulation evozierten Reaktionen im ACC, drogeninduzierte anfallsähnliche Aktivität sowie die Kombination aus thalamischer Stimulation und drogeninduzierter anfallsähnlicher Aktivität.

Diese Abbildung zeigt die Auswirkungen unterschiedlicher Ausrichtungen in der DCS, wie beispielsweise verschiedene Ausrichtungen im elektrischen Feld, thalamisch stimulierte evozierte Antworten mit DCS sowie die Wirkung kathodaler DCS auf anfallsähnliche Aktivität. In dieser Abbildung ist dargestellt, dass 15 Minuten kathodale DCS effektiv eine langfristige Depression hervorgerufen und evozierte Antworten vermindert haben. Die Anfallsdauer war nach 15 Minuten kathodaler DCS im Vergleich zur fehlenden Anwendung von DCS signifikant verringert.

schneller, technisch gesehen kann dies in vier Stunden durchgeführt werden, wenn es ordnungsgemäß durchgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Maßnahmen wie die transkranielle Magnetstimulation durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise nichtinvasive Ansätze zur Kontrolle von therapieresistenten Anfällen bereitzustellen. Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der nichtinvasiven Therapie den Weg, Anfallbehandlungen in tierexperimentellen Modellen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Stromstimulation verwendet wird, um an Gehirnschnitten anfallsähnliche Aktivität zu bewerten.