Gleichstrom-Stimulation und Multi-Elektroden-Array-Aufnahme von Seizure-ähnliche Aktivität in Mäuse-Gehirn Scheibe Vorbereitung

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, die Anordnung der Elektroden in der Aufnahmekammer für die Gleichstromstimulation eines Hirnschnitts und deren Wirkung auf die anfallsähnliche Aktivität, die mit einem Mehrelektrodenarray aufgezeichnet wurde, zu erschließen. Dies kann besser helfen, Schlüsselfragen zur Gleichstromstimulation zu beantworten, und ein Multi-Elektroden-Array zeichnete anfallsähnliche Aktivität in Maushirnschnitten auf. Ein Vorteil dieser Technik besteht darin, dass die Auswirkungen der Gleichstromstimulation im spezifischen Weg des Maus-Hirnschnitts bewertet werden können.

Hsiang Chin und Wei-Jen Chang, Techniker aus meinem Labor, werden das Verfahren vorführen. Bei diesem Verfahren sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor dem Experiment mit 75%iger Ethanollösung. Legen Sie dann den Schädel des Tieres frei und schneiden Sie den verbleibenden Muskel ab.

Als nächstes schäfst du die dorsale Oberfläche des Schädels mit Rongeuren ab und schneidest die Seiten ab. Schneiden Sie anschließend mit einem Spatel die Riechkolben und Nervenverbindungen entlang der ventralen Oberfläche des Gehirns ab, bevor Sie ihn entfernen. Übertragen Sie das Gehirn schnell in ein Becherglas, das mit eiskaltem, sauerstoffreichem ACSF gefüllt ist.

Um Schnitte zu präparieren, die den MT-ACC-Signalweg enthalten, machen Sie einen sagittalen Schnitt, 2 mm lateral der Mittellinie in jeder Hemisphäre, um die subkortikale Anatomie darzustellen. Machen Sie dann einen abgewinkelten Querschnitt parallel zum sichtbaren Fasertrakt im Striatum. Machen Sie den zweiten abgewinkelten Querschnitt von der Verbindung zwischen dem Kleinhirn und der visuellen Rinde bis zum Mittelpunkt zwischen der vorderen Kommissur und dem Sehtrakt, die ventral und parallel zur Thalamus-Cingulation sind.

Befestigen Sie danach den Hirnblock mit einem Cyanacrylatkleber an einer eckigen Platte. Machen Sie einen Schnitt knapp über dem Wendepunkt des Weges. Falten Sie danach die Platte auf, glätten Sie sie und kleben Sie sie auf die Kammerstufe eines Vibratoms.

Anschließend werden die Gehirnschnitte mit einer Dicke von 500 Mikrometern geschnitten und in eiskaltem, sauerstoffreichem ACSF aufbewahrt. Übertragen Sie eine Scheibe in die Aufnahmekammer bei 32 Grad Celsius und erhalten Sie eine Stunde lang kontinuierlich reichlich sauerstoffhaltiges ACSF. Bestätigen Sie die Platzierung einer MEA-Sonde am Mehrkanalsystem.

Verwenden Sie einen Schlauch, um den ACSF in die MEA-Kammer zu führen, und den anderen Schlauch, um den ACSF aus der Kammer zu führen. Perfundieren Sie das Präparat kontinuierlich mit warmem, sauerstoffreichem ACSF bei 30 Grad Celsius. Übertragen Sie mit einem feuchten Wattestäbchen eine Gehirnscheibe in die MEA.

Bewegen Sie die Gehirnscheibe vorsichtig, um den ACC über den Elektroden auszurichten, und stabilisieren Sie dann die Gehirnscheibe mit einem Schnittanker, um eine gute elektrische Verbindung zwischen der Schicht und den Elektroden zu gewährleisten. Platzieren Sie anschließend die Anodenelektrode proximal zum ACC und die Kathodenelektrode distal zum ACC. Erfassen Sie die Feldstärke anhand der beiden Feldorientierungen von MEA.

Geben Sie dann die elektrischen Ströme mit einem Stimulator ab. Stellen Sie den Abstand zwischen den beiden Silberchlorid-Elektroden auf etwa 1,5 bis 2 cm ein und stellen Sie die Stromstärke des Stimulators so ein, dass der DCS zwischen 0,5 und 2 Milliampere liegt. Platzieren Sie bei diesem Verfahren eine Wolframelektrode in MT und geben Sie Impulse vom Stimulator an den Thalamusbereich der Scheibe ab.

Verwenden Sie als Nächstes verschiedene Stromintensitäten, um den Schwellenwert zu bestimmen, der eine ACC-Antwort auslöst. Bewegen Sie die Wolframelektrode entlang des Thalamus-Cingulationswegs, um das optimale Reaktionsprofil zu erhalten. Zeichnen Sie 1-20 ACC-Reaktionen auf und verwenden Sie die Software, um alle ACC-Antworten, die meine MT-Stimulation hervorgerufen haben, automatisch zu mitteln.

Um eine anfallsähnliche Aktivität zu induzieren, fügen Sie der Perfusionslösung 250 mikromolare 48P und 5 mikromolare Bicuculline hinzu und setzen Sie die Scheibe zwei bis drei Stunden lang fort. Halten Sie die Pumpe auf einer relativ schnellen Perfusionsrate, was dazu beitragen kann, den Aufbau eines pH-Gradienten zu verhindern. Platzieren Sie als Nächstes die Wolframelektrode an der MT und führen Sie eine elektrische Stimulation durch, um ein ACC-Reaktionsprofil zu erhalten.

Zeichnen Sie 10-20 Sweeps auf und mitteln Sie die Antworten. Ersetzen Sie anschließend die Präfusionslösung durch frisches ACSF, um die Medikamente auszuwaschen. Stellen Sie bei diesem Verfahren die Erzeugung gleichmäßiger elektrischer Felder sicher, indem Sie Ströme zwischen zwei parallelen, mit Silberchlorid beschichteten Silberdrähten leiten, die in der MEA-Kammer platziert sind.

Wenn es keine Probleme gibt, sollte der DCS zwischen 0,5 und 2 Milliampere bleiben. Schalten Sie als Nächstes das DCS aus und stimulieren Sie den Thalamus mit einer Wolframelektrode. Um maximale synaptische Reaktionen in ACC zu erhalten, notieren Sie 10-20 Antworten und mitteln Sie dann.

Schalten Sie dann das DCS ein und stimulieren Sie gleichzeitig den Thalamus. Bewerten Sie die Amplitudenänderungen der durch die Thalamusstimulation hervorgerufenen ACC-Reaktion während der DCS. Schalten Sie nun das DCS aus, fügen Sie der Perfusionslösung 250 mikromolare 48P und 5 mikromolare Bicuculline hinzu und warten Sie 2-3 Stunden.

Wenn die Medikamente auf den Hirnschnitt wirken, sollte der Schnitt kortikale Anfallsreaktionen hervorrufen. Sammeln Sie anschließend 10-20 anteriore cinguläre kortikale Reaktionen und messen Sie die Amplitude und Dauer der elektrisch evozierten kortikalen Anfallsreaktionen. Verschachteln, schalten Sie das DCS ein und stimulieren Sie gleichzeitig den Thalamus.

Bewerten Sie die Veränderungen in der Amplitude und Dauer der evozierten kortikalen Anfallsreaktionen während der DCS-Anwendung. Ersetzen Sie danach die Perfusionslösung durch frische ACSF, um die Medikamente auszuwaschen. Diese Abbildung zeigt verschiedene evozierte Reaktionen, zu denen die durch die Thalamusstimulation evozierten Reaktionen bei ACC, die medikamenteninduzierte, anfallsähnliche Aktivität und sowohl die thalamische Stimulation als auch die medikamenteninduzierte anfallsähnliche Aktivität gehören.

Diese Abbildung zeigt den Einfluss verschiedener Orientierungen bei DCS, wie z. B. unterschiedliche Orientierungen im elektrischen Feld, thalamische Stimulationsreaktionen, die mit DCS hervorgerufen werden, und die Wirkung von kathodaler DCS auf die anfallsähnliche Aktivität. Und in dieser Abbildung ist gezeigt, dass 15 Minuten kathodale DCS effektiv langfristige Depressionen und depressive evozierte Reaktionen induziert haben. Die Anfallsdauer war nach 15 Minuten kathodaler DCS im Vergleich zu keiner DCS-Anwendung signifikant verkürzt.

Schneller, dies kann technisch in vier Stunden erledigt werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Themen wie die transkranielle Magnetstimulation durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Bereitstellung nicht-invasiver Ansätze zur Kontrolle von Widerstandsanfällen. Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der nicht-invasiven Therapie, um Anfallsbehandlungen im Tiermodell zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die aktuelle Stimulation verwenden können, um die anfallsähnliche Aktivität in Hirnschnitten zu beurteilen.