Assay mit hohem Durchsatz Eiablage Präferenzen der einzelnen zu untersuchen
24. März 2016
Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Assay zum Testen der Eiablagepräferenzen von Drosophila melanogaster bei Einzeltierauflösung. Dieser Assay bietet eine einfache, effiziente und skalierbare Plattform zur Identifizierung von Genen und Schaltkreiskomponenten, die einen einfachen Entscheidungsprozess steuern.
Das übergeordnete Ziel dieses Hochdurchsatz-Assays besteht darin, eine einfache, effiziente und skalierbare Plattform bereitzustellen, um Gene und Neuronen zu identifizieren, die ein einfaches Entscheidungsverhalten bei Drosophila steuern. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass Sie tatsächlich eine Infektion als Eiablageentscheidung und ein einzelnes Tier auf äußerst geeignete Weise untersuchen können. Beginnen Sie das Experiment, indem Sie acht Weibchen und sechs Männchen in ein schmales Nährmedium-Röhrchen geben, das mit Standardfliegenmedium gefüllt ist.
Verwenden Sie anschließend die aus diesem Gefäß hervorgegangenen weiblichen Nachkommen für die Eiablageexperimente. Zwei bis drei Tage nach dem Schlüpfen der Weibchen bereiten Sie eine frische Hefepaste zu, indem Sie sechs Gramm aktive Hefe mit 10 Millilitern 0,5%iger Propionsäure vermischen. Tragen Sie die Hefepaste mit einem Spatel an die Seitenwand der Nährbodenröhrchen auf.
Als Nächstes geben Sie 30 zuvor gesammelte geschlüpfte Weibchen und 20 Männchen in die Gefäße. Nach vier Tagen überprüfen Sie die Oberfläche des Nährbodens. Wenn die Oberfläche nass ist, weil die Larven aktiv im Nährboden graben, sind die weiblichen Fliegen bereit für Eiablageexperimente.
Fahren Sie mit dem Experiment fort, indem Sie zuvor hergestellte Acryl-Legestationen beschaffen. Stecken Sie Plastikfolien in die Oberseite, um ein Stück der Kammer als Bodenfläche zu laden. Anschließend betäuben Sie die Weibchen auf einem Kohlendioxid-Kissen und bringen Sie einzeln in jede Legestation ein.
Lassen Sie die Fliegen 30 Minuten Zeit, sich vom Kohlendioxid zu erholen und an die neue Umgebung zu gewöhnen. Während sich die Fliegen akklimatisieren, füllen Sie ein Gefäß mit Agarose bis zur 10-Milliliter-Marke und bereiten dann ein 150-Milliliter-Saccharose-Substrat vor, indem Sie 750 Mikroliter einer zwei Molaren Saccharoselösung in das Gefäß geben. Halten Sie eine Flasche geschmolzene 1 %ige Agarose in einem Wasserbad bereit.
Bereiten Sie das reine Substrat auf die gleiche Weise vor, ersetzen Sie jedoch die Saccharoselösung durch destilliertes Wasser. Nehmen Sie danach das Substratstück der Kammer und pipettieren Sie jeweils 1.000 Mikroliter der Agaroselösung in jede Rinne. Stellen Sie das Agarose zur Vollständigen Verfestigung 30 Minuten beiseite.
Sobald die Agarose-Substrate und die Fliegen bereit sind, setzen Sie alle drei Teile der Eiablagekammer zusammen und entfernen Sie anschließend die Plastikfolien. Stellen Sie die Kammern über Nacht in Fliegeninkubatoren. Betäuben Sie die Weibchen, indem Sie Kohlendioxid in die Kammer einleiten.
Zerlegen Sie die Kammer und entsorgen Sie die anästhesierten Fliegen. Nehmen Sie abschließend Bilder der Eier zur Dokumentation auf. Der Präferenzindex (PI) wurde berechnet als die Anzahl der Eier, die weibliche Fliegen ablegten, wenn ihnen die Wahl zwischen einem einfachen Substrat und einem Substrat mit Saccharose geboten wurde.
Weibchen bevorzugten deutlich das einfache Substrat für die Eiablage. Nach diesem Verfahren bieten sich andere Methoden wie die Funkaufzeichnung als Möglichkeit, genetische Untersuchungen durchzuführen, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise wie sich die Fliegen vor der Ablage jedes Eis verhalten.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Assay zur Untersuchung der Eiablagepräferenzen von Drosophila melanogaster mit Einzeltier-Auflösung. Der Assay bietet eine einfache, effiziente und skalierbare Plattform, um Gene und Schaltkreiskomponenten zu identifizieren, die einen einfachen Entscheidungsprozess steuern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Verhaltensbiologie
- Genetik
Hintergrund
- Drosophila melanogaster ist ein Modellorganismus zur Untersuchung der Genetik und des Verhaltens.
- Eiablagepräferenzen sind ein einfaches Wahlverhalten, das analysiert werden kann.
- Das Verständnis der genetischen und neuronalen Grundlagen von Entscheidungsprozessen ist in der Neurowissenschaft von entscheidender Bedeutung.
- Dieser Test ermöglicht eine Hochdurchsatzanalyse auf Ebene einzelner Tiere.
Zweck der Studie
- Identifizierung von Genen, die die Eiablagepräferenzen bei Drosophila beeinflussen.
- Untersuchung der neuronalen Schaltkreise, die an Entscheidungsverhalten beteiligt sind.
- Entwicklung einer skalierbaren Methode für Verhaltensanalysen in genetischen Studien.
Verwendete Methoden
- Platzierung von Drosophila in einer kontrollierten Umgebung zur Beobachtung.
- Zubereitung von Futtergefäßen mit Standardnährlösung für Fliegen zur Eiablage.
- Auftragung von Hefepaste, um das Eiablageverhalten zu stimulieren.
- Beobachtung individueller Eiablagepräferenzen über die Zeit.
Hauptergebnisse
- Der Test identifiziert erfolgreich individuelle Eiablagepräferenzen.
- Genetische Variationen können mit Verhaltensunterschieden in Verbindung gebracht werden.
- Neuronale Komponenten, die an Entscheidungsprozessen beteiligt sind, können kartiert werden.
- Die Methode ist für umfangreichere genetische Studien skalierbar.
Schlussfolgerungen
- Dieser Hochdurchsatz-Assay eignet sich zur Untersuchung des Verhaltens von Drosophila.
- Er liefert Einblicke in die genetischen und neuronalen Grundlagen der Entscheidungsfindung.
- Der Ansatz kann auf verschiedene genetische und verhaltensbezogene Studien angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Dieser Hochdurchsatz-Assay ermöglicht ein systematisches genetisches Screening von Entscheidungsverhalten mit Einzeltier-Auflösung und adressiert so einen zentralen Engpass bei der Zielvalidierung in der Neuropharmakologie. Durch skalierbare, quantitative Messungen von Eiablage-Präferenzen unterstützt er die mechanistische Risikominderung neuronaler Zielstrukturen und verbessert die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase. Die Plattform verbessert die translationale Kontinuität von der Genentdeckung bis zur Schaltkreisfunktion und wirkt sich damit direkt auf die Portfolio-Priorisierung in der CNS-Wirkstoffentwicklung aus.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, die Gene mit einfachen Entscheidungsverhalten in einem genetisch zugänglichen System verknüpfen.
- Operationaler Wert: Unterstützt die Hochdurchsatz-Screening einzelner Fliegen und steigert so die Effizienz bei Target-Entscheidungs-Kampagnen.
- Prädiktiver Wert: Erzeugt Daten zum Präferenzindex (PI), die die Substratwahl mit genetischen oder neuronalen Störungen korrelieren und somit bei der Bewertung der Target-Sicherheit helfen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte Substrate (neutral gegenüber Saccharose), die quantifizierbare Eiablageergebnisse für zuverlässige Wirkstoff- oder Genotyp-Screenings liefern.
- Skalierbarkeit: Die Kammern fassen bis zu dreißig einzelne Fliegen pro Durchlauf und ermöglichen parallele Tests für genetische Bibliotheken.
- Reproduzierbarkeit: Konsistente Ergebnisse über Wiederholungen hinweg unterstützen die Standardisierung des Assays und den Datenaustausch zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert einfache Entscheidungsprozesse, die für Endophänotypen neuropsychiatrischer Erkrankungen relevant sind.
- Mechanistische Entlastung: Ermöglicht die Abbildung neuronaler Schaltkreise, die an Verhaltensweisen beteiligt sind, und verringert die Unsicherheit hinsichtlich des Wirkmechanismus von Zielstrukturen.
- Translationale Kontinuität: Verbindet genetische Befunde mit der Validierung auf Schaltkreisebene und unterstützt so Entscheidungen zum Voranschreiten in präklinischen Entwicklungsstufen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test passt in die Entdeckungskette von der Zielidentifizierung bis zur Leitstruktur-Optimierung, insbesondere für Programme des zentralen Nervensystems, bei denen Verhaltensphänotypen die Zielwahl beeinflussen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem genetische oder neuronale Manipulationen mit messbaren Veränderungen in der Eiablagepräferenz verknüpft werden.
- Screening: Ermöglicht das primäre Screening genetischer Modifikatoren mit quantitativen Präferenzindex-Ausgaben.
- Analytik: Die Berechnung des Präferenzindex (PI) liefert eine normalisierte Metrik zum Vergleich von Bedingungen über Experimente hinweg.
- Translationale Forschung: Verbindet genetische Befunde mit der Funktion neuronaler Schaltkreise und unterstützt die validierung von zielgerichteten Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das Kammern-Design erlaubt die Wiederverwendung über verschiedene Studien hinweg durch Anbauteile für Optogenetik oder Videoaufzeichnung und fördert so die Nachhaltigkeit der Plattform.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert die mechanistische Mehrdeutigkeit bei Entscheidungswegen durch die Auflösung auf Ebene einzelner Tiere.
- Operationaler Wert: Standardisierte Fliegenpräparation und Kammermontage verbessern die Reproduzierbarkeit des Arbeitsablaufs.
- Strategischer Wert: Ermöglicht schnellere Go/No-Go-Entscheidungen bei der Target-Validierung, indem der Durchsatz der Verhaltensphänotypisierung erhöht wird.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Targets auf der Grundlage konvergierender genetischer und verhaltensbezogener Evidenz.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Drosophila, in der Einrichtung von Verhaltensassays und in der einfachen Mikroskopie zur Ei-Quantifizierung.
- Hängt von dem Zugang zu Fertigungswerkzeugen für Acryl-Kammern sowie von Umweltkontrollen für die Inkubation der Fliegen und die Verfestigung von Agarose ab.
- Setzt eine Standardisierung der Hefe-Paste-Herstellung und des Gießens des Substrats voraus, um eine konsistente Eiablage-Motivation über alle Versuchsdurchläufe hinweg sicherzustellen.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind die Art des Substrats (z. B. aversiv vs. appetitiv) sowie Modifikationen der Kammer für die Integration von Optogenetik oder Bildgebung.
- Praktische Einschränkungen bestehen in der Notwendigkeit einer manuellen Ei-Zählung, sofern keine automatisierte Bildanalyse eingesetzt wird, wie im Protokoll durch die auf Bildaufzeichnungen basierende Dokumentation vermerkt.
