En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist der gleichzeitige Nachweis von intrazellulären Stickstoffmonoxid- und Superoxid-Anionen mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffs DAF-2DA und DHE in frisch isolierten intakten Aorten der Maus. Diese Methode kann bei der Wiederherstellung des Falles von Forschern im Bereich der kardiovaskulären Physiologie, wie z. B. der endothelialen Dysfunktion und der eNOS-Entkopplung, hilfreich sein. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, eine einfache und präzise Methode für den ex vivo direkten Nachweis und die gleichzeitige Visualisierung von Stickstoffmonoxid und Superoxid-Anionen in intakten Blutgefäßen bereitzustellen.

Bauen Sie für dieses Protokoll ein Organbadsystem, das auf 37 Grad Celsius erhitzt und mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxidgas aus einem Kohlendioxidtank belüftet werden kann. Bereiten Sie zu Beginn genügend frischen Krebs-Ringer Bicarbonat-Puffer vor, um das gewünschte Gewebe zu baden. In einem Experiment werden beispielsweise 200 Milliliter für Aorten benötigt.

Schalten Sie das Orgelbadsystem ein und stellen Sie die Wärmeregelung auf 37 Grad Celsius ein. Nach dem Waschen der Kammern mit Krebs-Ringer Bicarbonat-Puffer geben Sie fünf Milliliter des Krebs-Ringer Bicarbonat-Puffers in jede Kammer und schalten Sie das Gas ein, um es 30 Minuten lang mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid zu belüften. Halten Sie die Kammern abgedeckt.

Bereiten Sie außerdem eine Flasche eiskalten Krebs-Ringer Bicarbonat-Puffer mit Belüftung vor. Nach der Exkursion der thorakalen Aorta sofort das gesamte Gewebe in eine Schale mit eiskaltem Krebs-Ringer-Puffer tauchen. Entfernen Sie unter einem Präpariermikroskop das Herz und den Aortenbogen, während Sie das thorakale Aortensegment im Puffer belassen.

Präparieren Sie dann die Aorta mit einer chirurgischen Schere und Pinzette frei von anhaftendem perivaskulärem Gewebe. Fassen Sie anschließend mit einer Pinzette den Rand des Gewebes und spülen Sie das Blut vorsichtig aus dem Gefäßlumen mit eiskaltem Krebs-Ringer-Puffer, der aus einer Spritze verabreicht wird. Die Blutgerinnsel im Gefäßlumen müssen weggespült werden, da sie künstliche Signale verursachen und die Fluoreszenzsignale stören können, während gleichzeitig die Spülstärke kontrolliert werden sollte, um die Endothelschicht nicht zu beschädigen.

Schneide nun die gereinigten Aortenringe in drei Millimeter lange Segmente. Nachdem Sie die gereinigten Aortenringe vorbereitet haben, färben Sie sie. Berühren Sie nur die Adventsseite der Aortenringe mit einer Pinzette, ohne die Blutgefäße zu klemmen, und übertragen Sie die gereinigten Aortensegmente in die vorbereiteten Organbadkammern.

Lassen Sie die Arterien 30 Minuten lang im Puffer ausgleichen. Nach einer halben Stunde fügen Sie Acetylcholin zum Organbad hinzu, um eine endgültige Konzentration von einem Mikromolaren zu erhalten, und inkubieren Sie die Arterien 10 Minuten lang mit dem Acetylcholin. In der Zwischenzeit wird in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ein Milliliter Färbelösung mit vorgewärmtem Krebspuffer hergestellt.

Wickeln Sie die Tube dann in Folie ein, um die Lichteinwirkung zu minimieren, und halten Sie sie bei 37 Grad Celsius. Nach der Acetylcholin-Stimulation übertragen Sie die Aortenringe aus dem Organbad in die Tube mit der Färbelösung und lassen Sie sie 30 Minuten lang im Dunkeln unter Belüftung inkubieren. Alle Schritte ab diesem Zeitpunkt sollten mit minimaler Lichteinwirkung durchgeführt werden.

Übertragen Sie anschließend die Aortenringe für eine Minute in ein neues Röhrchen, das mit Krebspuffer gefüllt ist. Führen Sie diesen Waschschritt dreimal durch. Befestigen Sie dann die Aortenringe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem Bad mit 4%iger Paraformaldehydlösung.

Übertragen Sie die Ringe nach dem Fixierungsschritt für drei Minuten bei Raumtemperatur in die DAPI-Lösung, um die Gegenfärbung aufzutragen. Waschen Sie dann die Aortenringe dreimal eine Minute lang pro Waschgang mit PBS. Seien Sie immer empfindlich gegenüber der Zerbrechlichkeit des Endothelgewebes, wenn Sie die Ringe bewegen.

Schneiden Sie unter dem Mikroskop die Aortenringe mit einer mikrochirurgischen Schere auf einem Objektträger in Längsrichtung ab. Entfernen Sie dann überschüssige Flüssigkeit auf der Aorta, während Sie sie feucht halten. Zwingen Sie die zusammengerollten Aorten mit zwei mikrochirurgischen Pinzetten flach gegen einen Objektträger, wobei das Endothel nach unten auf den Objektträger zeigt.

Bewegen Sie dabei die Aorten nicht hin und her. Dieser Schritt ist sehr kritisch, aber nicht einfach zu bedienen. Es ist besser, vor dem formalen Experiment gut zu üben.

Lassen Sie dann das Eindeckmedium auf die Aorta fallen. Decken Sie die Folie ab und versiegeln Sie sie mit Nagellack. Nach dem Trocknen an der Luft im Dunkeln bilden Sie die Objektträger mit der konfokalen Mikroskopie ab.

Verwenden Sie eine Scangeschwindigkeit von 200 Hertz, eine Auflösung von 1024 x 1024 Pixeln und eine Z-Stack-Größe von einem Viertelmikrometer. Um den DAF-2DA zu beobachten, verwenden Sie einen Argon-Laser, stellen Sie die Anregungsfluoreszenz auf 488 Nanometer und die Emissionsdetektion auf 515 Nanometer ein. Um das DHE zu beobachten, stellen Sie die Anregungsfluoreszenz auf 514 Nanometer und die Detektion auf 605 Nanometer ein.

Stellen Sie das Objektiv nach dem Fokussieren mit 10-facher Vergrößerung auf 40-fache Vergrößerung ein. Definieren Sie nun den Bereich der Endothelschicht, indem Sie die z-Position auf dem Bedienfeld anpassen, wobei Sie die DAPI-gefärbten Kerne als Orientierungspunkte verwenden. Scannen Sie dann von der Endothelschicht am Lumenrand durch die gesamte Dicke der Endothelschicht und nehmen Sie die Bilder auf.

Scannen Sie mindestens drei verschiedene Sichtfelder für jede Probe. Junge C57 Black 6 Mäuse wurden fettleibig gemacht, indem sie 14 Wochen lang mit einer fettreichen Diät gefüttert wurden. Die Kontrollen wurden mit einem normalen Chow gefüttert.

Nach 14 Wochen wurden ihre Brustarterien untersucht. Vor der Färbung wurden die Gewebe eine Stunde lang an einem Nanomolar dem eNOS-Inhibitor L-NAME ausgesetzt. Das grün dargestellte Signal von DAF-2T wird von nicht-fluoreszierendem DAF-2 durch Stickstoffmonoxid umgewandelt.

Die Färbung deutet also auf das Vorhandensein von Stickstoffmonoxid in einer Zelle hin. In ähnlicher Weise gibt DHE, wenn es durch Superoxid oxidiert wird, ein rotes Fluoreszenzsignal ab. Die Proben, die mehr rote Farbe zeigen, haben also mehr Superoxid in den Zellen.

Die Quantifizierung der konfokalen Fluoreszenzbilder zeigte eine Abnahme der Stickoxidproduktion und eine Zunahme der L-NAME-empfindlichen Superoxidbildung in der Aortenendothelschicht der Mäuse, die mit der fettreichen Diät gefüttert wurden. Diese Daten stützen die Annahme, dass die eNOS-Entkopplung mit Fettleibigkeit auftritt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Stickstoffmonoxid und die Superoxid-Anionen erkennt und wie Fluoreszenzfarbstoffe in intakten Blutgefäßen

Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Endothelschicht während des gesamten Operationsvorgangs in Takt zu halten. Und tauchen Sie die Blutgefäße immer in Krebs-Ringer-Puffer, um die Endothelzellen vor dem Fixierungsschritt am Leben zu erhalten.

In Kombination mit diesem Verfahren können weitere Messungen, wie z.B. die Analyse der vasomotorischen Reaktionen der Blutgefäße, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die physiologische Funktion der Endothelzellen bei der Regulation des Gefäßtonus zu beantworten.