Name: En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Lernen Sie die simultane Detektion von Stickstoffmonoxid und Superoxid in intakten Mäuseaorten mit den Fluoreszenzfarbstoffen DAF-2DA und DHE. Diese Methode ermöglicht die direkte Visualisierung oxidativer Stressmarker in Endothelzellen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt vom Schweizerischen Nationalfonds (310030_141070/1), der Schweizerischen Herzstiftung und dem Nationalen Forschungsschwerpunkt (NCCR-Kidney.CH) Schweiz. Yu Yi wird vom Chinese Scholarship Council unterstützt.

Tier Arbeit wurde von der Ethikkommission der Veterinäramt Fribourg, Schweiz genehmigt. Das Protokoll folgt den Richtlinien für die Tierpflege und Experimentieren an unserer Hochschule. 1. Herstellung eines Set-up für die Inkubation von isolierten Arterien <ol><li> Konstrukt ein Organbad System , das auf 37 ° C erhitzt werden kann und belüftet mit 95% O 2 und 5% CO 2 aus einem Kohlenstoffgastank. </li><li> Bereiten so viel Krebs-Ringer - Bicarbonat - Puffer , wie mit der Konzentration der folgenden Zusammensetzung benötigt: (118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3, 0,026 mM EDTA und 11,1 mM D-glucose). </li><li> Halten Sie die Lager - Puffer auf Eis und belüften den Puffer mit 95% O 2 und 5% CO 2. </li><li> Schalten Sie das Organbad System, stellen Sie die Temperatur bei 37 ° C, 5 ml der ready-to-use-Puffer zu jeder Kammerund halten Sie den Puffer mit 95% O 2 und 5% CO 2 Belüften. </li><li> Waschen Sie die Kammern einmal mit Krebs-Ringer-Puffer für 30 min. </li><li> 5 ml Krebs-Ringer-Puffer in jeder Kammer und die Abdeckung die Kammer Verdampfung zu vermeiden. </li></ol> 2. Isolierung von Maus-Aorten <ol><li> Injizieren Pentobarbital, die in 0,9% NaCl intraperitoneal in einer Konzentration von 150 mg / kg, gelöst wird, um die Mäuse zu opfern. </li><li> Legen Sie die Maus supinely auf einem OP-Brett. </li><li> Besprühen das Fell des Brustbereich mit 70% Ethanol für die Zwecke der Hygienisierung und Feuchtigkeit. </li><li> Offenen Brusthöhle um die Rippe durch Schneiden des Herzens und der Lunge, zu belichten und die Lungen zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie die Blut in den Brustraum leicht mit einem Papiertuch. </li><li> Fassen Sie das Herz vorsichtig mit einer Zange und entfernen Sie die thorakalen Aorta durch die perivaskulären Fettgewebe zwischen der Aorta und der Wirbelsäule mit einer chirurgischen Schere schneiden. </li><li> Tauchen Sie sofort die whole Gewebe in eiskaltem (4 ° C) Krebs-Ringer-Puffer. </li><li> Entfernen Sie das Herz und Aortenbogen unter einem Präpariermikroskop und halten den thorakalen Aorta-Segment im Puffer. </li><li> Präparieren Sie die Aorta frei von anhaftenden perivaskulären Gewebe unter dem Mikroskop mit einer chirurgischen Schere und Pinzette. </li><li> Fassen Sie die Stirnkante der Aorta mit einer Zange, und spülen das Blut in das Gefäßlumen entfernt durch sanftes Spülen Krebs-Ringer-Puffer mit einem 26 G × 1 / 2&quot; Spritze. </li><li> Schneiden Sie die gereinigten Aorten-Ringe in 3 mm lange Segmente. Hinweis: Achten Sie bei diesem Schritt nicht Endothelschicht zu beschädigen. </li></ol> 3. DHE und DAF-2DA Anfärben <ol><li> Übertragen die gereinigten Aorten - Segmente mit einer Pinzette in das Organbad Kammern gefüllt mit Krebs-Ringer - Puffer bei 37 ° C belüftet mit 95% O 2 und 5% CO 2. Hinweis: Berühren Sie nur die adventitiellen Seite der Aorten-Ringe mit einer Pinzette und sie klemmen nicht blood Gefäße. </li><li> Äquilibrieren die Arterien im Organbad Kammer für 30 min. </li><li> Hinzufügen Acetylcholin (ACh) in das Organbad auf die Endkonzentration 1 uM, und inkubiere die Arterien für 10 min. </li><li> Bereiten Sie 1 ml DHE / DAF-2DA-Lösung (5 &amp; mgr; M jedes Farbstoffs, von 1000 × Lager verdünnt) mit vorgewärmten Krebs-Ringer-Puffer in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wickeln Sie das Reaktionsgefäß mit einer Aluminiumfolie gegen Licht zu vermeiden. </li><li> Nach der Stimulation übertragen die Aortenringen von Organbad zur DHE / DAF-2DA Lösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei 37 ° C belüftet mit 95% O 2 und 5% CO 2 und der Aortenringen für 30 min inkubieren. Hinweis: Von diesem Schritt halten die Aorten immer in Dunkelheit. </li><li> Übertragen Sie die Aorten-Ringe auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit Krebs-Ringer-Puffer zum Waschen und wiederholen Sie die Wäsche dreimal innerhalb von 1 min. </li><li> Übertragen Sie die Aorten-Ringe auf 4% Paraformaldehydlösung zur Fixierung für 30Minute </li><li> Vorbereitung 1 ml 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) -Lösung (300 nM, von 1000 × Vorrat verdünnt) mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) -Puffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Gegenfärbung der Aorten 3 min. </li><li> Übertragen Sie die Aorten auf neue Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS-Puffer zum Waschen für 1 min. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal. Hinweis: Achten Sie darauf, nicht die Aorten-Ringe zu klemmen oder die endotheliale Schicht beschädigt werden. </li></ol> 4. En Face Montage <ol><li> Fügen Sie einen Tropfen Medium auf den Schlitten der Montage. </li><li> Schneiden Sie die Aorten - Ringe in Längsrichtung mit mikro Schere unter dem Mikroskop, machen die zusammengerollten Aorten flach und montieren es en face auf dem Eindeckmedium mit dem Endothel auf dem Glasträger nach unten zeigt . Sie nicht die Aorten hin und her bewegen. </li><li> Decken Sie die Folie mit Deckglas und versiegeln Sie die Folie mit Nagellack. </li><li> Nach dem Trocknen an der Luft unter Lichtschutz, verwenden Sie die Folien für dire Abbildenctly innerhalb von Stunden oder lagern Sie sie bei -20 ° C für den nächsten paar Tage. </li></ol> 5. Konfokalmikroskopische Imaging <ol><li> Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop die Fluoreszenzsignale zu erkennen. Schalten Sie die Maschine und optimieren die Abbildungseinstellungen wie Vergrößerung, Scangeschwindigkeit, Auflösung, Z-Stack. <ol><li> Für dieses Protokoll verwenden, um eine 200 Hz Scangeschwindigkeit, Auflösung von 1.024 × 1.024 Pixeln und Z-Schrittgröße von 0,25 um. Excite Fluoreszenz von DAF-2DA mit 488 nm Argonlaser und erfassen bei 515 nm, während erregen Fluoreszenz von DHE bei 514 nm und erfassen bei 605 nm Emission. </li></ol></li><li> Verwenden 10x Vergrößerungen auf die Probe zu konzentrieren, bis das DAPI-Signal mit ultravioletten Strahlen klar ist, und stellen Sie dann das Ziel zu 40X Vergrößerung. </li><li> Definieren Sie den Bereich der endothelialen Schicht durch Einstellen der Z-Position auf dem Bedienfeld. Die Signale von DAPI-gefärbten Kerne sind oval oder rund Punkten in der Endothelschicht. </li><li> Scannen von oben(Endothelschicht auf der Lumen Grenze) der Probe durch die gesamte Dicke der endothelialen Signal und Aufzeichnen von Bildern. Wählen mindestens 3 verschiedene Felder für jede Probe abtastet. </li></ol> 6. Analyse der Bilder <ol><li> Verwenden Sie Software, um die Daten zu öffnen, durch konfokale Mikroskop gescannt. Wählen Sie drei aufeinander folgende Bilder pro Feld für die Analyse und Bewertung von mindestens 3 verschiedenen Feldern pro Probe. Exportieren Sie die ausgewählten Bilder und speichern Sie sie als JPEG-Dateien. </li><li> Quantifizieren Sie die Bilder von DAF-2DA, DHE und DAPI Färbung mit Bildverarbeitungs-Software. Für das Bild von DAPI-Färbung, wählen Sie &quot;Plugins&quot; → &quot;Analysieren&quot; → &quot;Zellzähler&quot; die Anzahl der DAPI positiven Kern zu zählen. <ol><li> Für die Bilder von DAF-2DA und DHE-Färbung, wählen Sie &quot;Analysieren&quot; → &quot;Maßnahme&quot; die Intensität der Signale zu analysieren, und nehmen Sie die &quot;mittlere&quot; Wert als die relative Signalintensität. Vorhanden dann die Ergebnisse als Verhältnis von DAF-2DA zuDAPI positiven Kerne oder das Verhältnis von DHE zu DAPI. Für jede Probe nehmen Sie den Mittelwert von jedem Bild und Feld. </li></ol></li><li> Teilen Sie das Ergebnis jeder Probe durch den Mittelwert der Kontrollgruppe die Falte Änderung zu erhalten. Die statistische Analyse wurde mit ungepaarten Student t-Test oder ANOVA mit Dunnett oder Bonferroni post-Test durchgeführt. Geben Daten als Mittelwert ± SEM. Betrachten wir Unterschiede in der Mittelwerte als signifikant bei p &lt;0,05 14. </li></ol>

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Der Nachweis von NO oder O 2 .- mit Fluoreszenzfarbstoffen wurde in vielen Studien in kultivierten Endothelzellen und auch in Gewebe Kryoabschnitte 23 häufig verwendet. Hier erweiterten wir diese Methode , um intakte lebende Blutgefäße, dh en Gesichtserkennung von NO und O 2 .- Ebenen in der Endothelschicht mit DAF-2DA und DHE verbunden, die wirksam ist, relativ einfach und intuitiv. Im Vergleich mit dem Verfahren in vaskulären Kryoschnitte zeigt d...

Die vaskulären Endothelzellen halten Gefäß funktionelle und strukturelle Integrität von vasoaktiven Faktoren 1 freigibt . Unter diesen Faktoren Endothelium derived Stickstoffmonoxid (NO) , hergestellt aus L-Arginin durch endotheliale NO-Synthase (eNOS) ist das wichtigste und am besten charakterisierte Faktor in kardiovaskulären Physiologie 2. NO verursacht Entspannung der glatten Muskulatur und hemmt die Zellproliferation hemmt die Thrombozytenaggregation und entzündliche Zelladhäsion und Infiltration in den subendothelialen Raum, also Gefäßerkrankung Entwicklung 3 zum Schutz vor. Unter vielen physiologischen und pathologischen Bedingungen, einschließlich der alternden Gesellschaft, Hypertonie, Diabetes, Hyperlipidämie, usw., verringert dadurch die endotheliale Dysfunktion durch NO Bioverfügbarkeit und erhöhte O 2 .- Produktion vorhanden ist , und fördert die Pathogenese der Atherosklerose 2. Studien aus den letzten Jahren zeigen, dass Entkopplung von eNOS ist einwichtiger Mechanismus für die endotheliale Dysfunktion, in dem das eNOS - Enzym erzeugt O 2 .- anstelle von NO, unter den verschiedenen zuvor erwähnten Bedingungen 1,4. Daher Analyse der Endothelfunktion, insbesondere endotheliale NO - Produktion und 2 O .- Generation ist von zentraler Bedeutung für die experimentelle Forschung auf Herz - Kreislauf- Erkrankungen und Komplikationen. Es gibt zahlreiche methodische Ansätze, die NO-Produktion zu analysieren und zu messen in biologischen Proben entwickelt wurden. Aufgrund der extrem labile Art von NO zu NO , das leicht oxidiert wird 2 - und NO 3 - mit einer Halbwertszeit von 3 bis 6 sec, ist es schwierig , NO direkt zu messen. Daher Bestimmung der NO 2 - / NO 3 - in den Flüssigkeitsproben wurde als ein Index von NO aus Zellen oder Geweben freigesetzt 5 verwendet. Obwohl das Verfahren relativ einfach ist, ist das Verfahren jedoch easily durch hohe Hintergrund des stabilen NO betroffen 2 - / NO 3 - in der Lösung enthalten ist . Da NO löslichen Guanylatcyclase stimuliert zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) 6, die zellulären cGMP - Spiegels zu erzeugen , hat sich auch die NO - Freisetzung zu schätzen 7 bestimmt ist. Auch dies ist eine indirekte Schätzung und nicht spezifisch sein kann, da auch die Aktivierung cGMP - Spiegel durch von cyclase partikulären Guanylat verbessern könnten einige Endothel-abgeleitete Faktoren, wie C-Typ natriuretischen Peptid (CNP) 8. NO wird aus L-Arginin mit der Erzeugung von L-Citrullin als einem Nebenprodukt 9 Messung von L-Citrullin Produktion produziert daher auch als indirekte Verfahren verwendet wird , die NO - Produktion zu schätzen. Die Hauptnachteile dieses Verfahrens sind , dass es radioaktiv ist und es nicht bioaktiven NO Ebenen messen, da NO rasch freigesetzt durch O 2 .- inaktiviert werden könnten; Darüber hinaus kann L-Citrullin recycelt werden, um L-Arginin 10. Andere chemische Methoden wie Chemolumineszenznachweise 11, Elektronenspinresonanz - 12, oder elektro Porphyrin - NO - Sensor 13 werden von mehreren Forschern verwendet. Diese Methoden sind in der Regel nicht einfach in Betrieb, Erkennung Verfahren und erfordern spezielle Ausrüstung. Es ist auch zu erwähnen, dass viele Studien Organbad Experimente mit isolierten Blutgefäße mit oder ohne Endothelium anwenden Endothelfunktion zu bewerten und indirekt Endothelium derived NO vermittelten vaskulären Relaxationen messen. Dieses Verfahren ist jedoch, obwohl sie meist in der Nähe der physiologischen Situation ist, aber streng zu sagen, nicht messen keine Funktion, er bewertet, eher Endothel-vermittelte vasomotorischen Reaktionen im Allgemeinen, die Nettoeffekte der eNOS Funktion widerspiegeln, die Produktion von anderen Endothel-derived relaxing Faktoren und Endothel-abgeleiteten Auftraggeber Faktoren, die Produktion von O 2 .-, und auch die Reaktionen von glatten Muskelzellenzu diesen Faktoren. Eine spezifische Analyse der eNOS - Funktion oder die NO - Produktion ist in der Regel 3 erforderlich. Viele Forschungsgruppen einschließlich der unsrigen haben in den letzten Jahren die Fluoreszenzfarbstoff - Methode verwendet , um die intrazelluläre Produktion von NO 14-19 erkennen. Bei diesem Verfahren wurde die zellpermeabel Fluoreszenzindikator Diaminofluorescein-2 - diacetat (DAF-2DA) verwendet , um freie NO und NOS - Funktion in lebenden Zellen und Geweben in vitro oder ex vivo zu messen. Das Prinzip ist, dass in den lebenden Zellen, DAF-2DA wird durch intrazelluläre Esterase zu nicht fluoreszierenden 4,5-Diaminofluorescein (DAF-2) deacetyliert die dann umgewandelt DAF-2 Triazol fluoreszierend (DAF-2T), indem Sie mit NO reagieren . Die Fluoreszenz von DAF-2T können unter einem Fluoreszenzmikroskop oder einem Fluoreszenz konfokalen Mikroskop 14 beobachtet werden. Die intrazelluläre Fluoreszenzintensität spiegelt daher die intrazelluläre NO-Produktion in den Zellen oder das Endothel eines in intakten Blut vessel. In Kombination mit einem spezifischen Fluoreszenzfarbstoff wie Dihydroethidium (DHE), kann man gleichzeitig intrazellulären NO und O 2 .- Erzeugung in den Zellen oder in Blutgefäßen 14 beurteilen. In ähnlicher Weise ist auch eine DHE zellpermeablen Verbindung , die durch 2 O oxidiert wird .- innerhalb der Zellen, und das Oxidationsprodukt dann interkaliert mit Nukleinsäuren durch Fluoreszenz - Mikroskop oder Fluoreszenz konfokalen Mikroskop eine leuchtend rote Farbe nachweisbar quantitativ zu emittieren. DHE ist ein sehr spezifischer Farbstoff zum Nachweis von O 2 .- aus biologischen Proben, wie sie im wesentlichen Superoxidradikalen erkennt, zurückgehalten wird und durch die Zellen, und sogar leichte Fixierung 20 tolerieren kann. Einer der Vorteile dieses Fluoreszenzfarbstoffes Verfahrens ist , dass es erkennt und visualisiert NO und / oder O 2 .- en face direkt auf der intakten Endothelschicht eines lebenden Blutgefßes. In diesem Papier,Wir beschreiben diese Methode Fluoreszenzfarbstoff NO und O 2 zu erkennen .- , die wir für en Gesichtserkennung von NO und O 2 angepasst .- in intakten Aorten von einer Adipositas - Maus - Modell von hohem Fettgehalt-Diät (HFD) Fütterung induziert. Wir zeigen , dass diese Methode erfolgreich konnte und zuverlässig messen NO und O 2 .- Ebenen und eNOS (dys) -Funktion in der Endothelschicht frisch isolierten intakten Maus Aorten in Fettleibigkeit zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>Dihydroethidium (DHE)</td><td>Invitrogen</td><td>D 1168</td><td>löst sich mit DMSO zu 5&nbsp; mmol/L als 1.000x Lagerbestand, gelagert bei -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Diaminofluorescein-2-Diacetat (DAF-2DA)</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td>mit DMSO auf 5&nbsp; mmol/L als 1.000x Lagerbestand, gelagert bei -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D 1306</td><td>lösen sich mit Wasser auf 300&nbsp; &Mikro; mol/L als 1.000x Lagerbestand, gelagert bei 4&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Einbettmedium</td><td>Vektor Arbeit. (Reactorolab)</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>N&#969; -Nitro-L-Argininmethylesterhydrochlorid (L-NAME)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3636</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Myograph System&nbsp;</td><td>Dänisches Myo Technology A/S</td><td>Modell 610M</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td>DM6000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bildverarbeitungssoftware</td><td>National Institute of Health (NIH)</td><td>Image J&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere&nbsp;</td><td>S& T AG</td><td>SDC-11</td><td></td></tr><tr><td>Mikrochirurgische Schere&nbsp;</td><td>F.S.T</td><td>15000-01</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>S& T AG</td><td>JF-5</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas rund Durchmesser 15&nbsp; mm</td><td>VWR</td><td>631-1579</td><td></td></tr><tr><td>Spitzen 1 ml</td><td>VWR</td><td>RFL-1200c&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tipps 200 &#956; l</td><td>VWR</td><td>613.0659</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Röhrchen 1,5 ml</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>30120086</tr><tr><td>Acetylcholinchlorid</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A-6625</td><td></td></tr></tbody></table>

en gesichtserkennung von stickstoffmonoxid und superoxid in endothelschicht intact arterien

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived Stickstoffmonoxid (NO) aus endothelialen NO-Synthase (eNOS) ist einer der wichtigsten vasoprotektiven Moleküle in kardiovaskulären Physiologie. Dysfunktionalen eNOS wie Entkopplung von eNOS führt in NO Bioverfügbarkeit und Erhöhung Superoxidanion (O 2 .-) Produktion und fördert wiederum kardiovaskulären Erkrankungen zu verringern. Daher sind entsprechende Messung von NO und O 2 .- Ebenen in den Endothelzellen entscheidende für die Erforschung von Herz - Kreislauf- Erkrankungen und Komplikationen. Aufgrund der extrem labile Natur von NO und O 2 .-, ist es schwierig zu messen , NO und O 2 .- direkt in ein Blutgefäß. Es wurden zahlreiche Verfahren NO zu messen entwickelt und O 2 .- Produktion. Es ist jedoch entweder insensitive oder unspezifisch, oder technisch anspruchsvoll und erfordert eine spezielle Ausrüstung. Hier beschreiben wir eine Anpassungdes Fluoreszenzfarbstoffs Verfahren für en face simultane Detektion und Visualisierung von intrazellulären NO und O 2 .- Die zellpermeabel Diaminofluorescein-2 - diacetat (DAF-2DA) und Dihydroethidium (DHE) mit jeweils in intakten Aorten von einer Adipositas - Mausmodell induziert von hohem Fettgehalt-Diät Fütterung. Wir zeigen , könnten intrazellulären NO verringert und eine verbesserte O 2 .- Ebenen in den frisch isolierten intakten Aorten von Maus Fettleibigkeit zur Kontroll lean Maus verglichen. Wir zeigen , dass diese Methode ist eine einfache Technik für die direkte Erfassung und Visualisierung von NO und O 2 .- in den intakten Blutgefäßen und kann in weiten Bereichen für die Untersuchung der endothelialen (dys) Funktion unter (Physio) pathologischen Bedingungen angewendet werden.

Adipositas ist ein wichtiger Risikofaktor für ischämische koronare Herzkrankheit und ist assoziiert mit einer verminderten NO - Bioverfügbarkeit Endothelzellen, ein Markenzeichen von atherosklerotischen Gefäßerkrankung 21. eNOS-Entkopplung wurde gezeigt , einen wichtigen Mechanismus der endothelialen Dysfunktion bei zahlreichen physiologischen und pathologischen Zuständen zu sein , einschließlich der Alterungs 22, Atherosklerose und Adipositas 14. Daher h...

In diesem Artikel beschreiben wir eine angepasste relativ einfache Methode der Fluoreszenzfarbstoff Diaminofluorescein-2 - diacetat (DAF-2DA) und Dihydroethidium (DHE) für en face simultane Detektion und Visualisierung von intrazellulären Stickstoffmonoxid (NO) und Superoxid - Anion mit (O 2 .- ) jeweils in frisch intakten Aorten von einer Adipositas-Maus-Modell isoliert.

En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, intrazelluläres Stickstoffmonoxid und Superoxidanionen gleichzeitig mithilfe der Fluoreszenzfarbstoffe DAF-2DA und DHE in frisch isolierten, intakten Maus-Aorten nachzuweisen. Diese Methode kann im Labor dabei helfen, Forschungsfälle im Bereich der kardiovaskulären Physiologie wie endotheliale Dysfunktion und eNOS-Entkopplung zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, eine einfache und präzise Methode zur ex vivo-Direktdetektion und -Visualisierung von Stickstoffmonoxid und Superoxidanion gleichzeitig in intakten Blutgefäßen bereitzustellen.Für dieses Protokoll wird ein Organkolbensystem konstruiert, das auf 37 Grad Celsius erhitzt und mit einem Gasgemisch aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid aus einem Kohlendioxid-Gasbehälter belüftet werden kann. Zunächst wird ausreichend frischer Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffer in der benötigten Menge hergestellt, um die interessierenden Gewebe zu umspülen. Beispielsweise werden 200 Milliliter für Aorten in einem Experiment benötigt.Schalten Sie das Organgefäß-System ein und stellen Sie die Heizregelung auf 37 Grad Celsius ein. Nachdem die Kammern mit Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffer gespült wurden, geben Sie fünf Milliliter des Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffers in jede Kammer und schalten Sie das Gas ein, um sie 30 Minuten lang mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid zu belüften. Halten Sie die Kammern bedeckt.Bereiten Sie außerdem eine Flasche eiskaltes Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffer mit Aeration vor. Nach der Entnahme der thorakalen Aorta tauchen Sie das gesamte Gewebe sofort in eine Schale mit eiskaltem Krebs-Ringer-Puffer. Entfernen Sie unter einem Dissektionsmikroskop das Herz und den Aortenbogen, wobei Sie das thorakale Aortensegment im Puffer belassen.Anschließend dissezieren Sie die Aorta vorsichtig vom anhaftenden perivaskulären Gewebe mit einer Schere und Pinzette frei. Danach fassen Sie mit der Pinzette den Rand des Gewebes und spülen vorsichtig das Blut aus dem vaskulären Lumen mit eiskaltem Krebs-Ringer-Puffer, der aus einer Spritze appliziert wird. Die im vaskulären Lumen befindlichen Blutgerinnsel müssen vollständig ausgespült werden, da sie sonst künstliche Signale verursachen und die Fluoreszenzsignale stören könnten; gleichzeitig sollte die Spülstärke jedoch kontrolliert werden, um die endotheliale Schicht nicht zu beschädigen.Schneiden Sie die gereinigten Aortaringe nun in drei Millimeter lange Segmente. Nachdem die gereinigten Aortaringe vorbereitet wurden, färben Sie diese. Überführen Sie die gereinigten Aortasegmente unter Verwendung von Pinzetten, wobei ausschließlich die adventitielle Seite der Aortaringe berührt wird, ohne die Blutgefäße zu klemmen, in die vorbereiteten Organbadkammern.Lassen Sie die Arterien 30 Minuten lang in dem Puffer äquilibrieren. Nach einer halben Stunde fügen Sie Acetylcholin in das Organgefäß ein, um eine Endkonzentration von einem Mikromolar zu erreichen, und inkubieren Sie die Arterien 10 Minuten lang mit dem Acetylcholin. In der Zwischenzeit bereiten Sie in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ein Milliliter Färbungslösung mit vorgewärmtem Krebs-Puffer vor.Als Nächstes den Schlauch mit Aluminiumfolie umwickeln, um eine Lichteinwirkung zu minimieren, und bei 37 Grad Celsius aufbewahren. Nach der Acetylcholin-Stimulation die Aortenringe aus dem Organbad in den Schlauch mit der Färbungslösung überführen und 30 Minuten im Dunkeln unter Belüftung inkubieren. Alle ab diesem Punkt folgenden Schritte sollten mit möglichst geringer Lichteinwirkung durchgeführt werden.Überführen Sie die Aortaringe anschließend für eine Minute in ein neues Gefäß, das mit Krebs-Puffer gefüllt ist. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Danach fixieren Sie die Aortaringe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem Bad mit einer 4 %igen Paraformaldehydlösung.Nach dem Fixierungsschritt die Ringe zur Gegenfärbung drei Minuten lang bei Raumtemperatur in die DAPI-Lösung überführen. Anschließend die Aortenringe dreimal für jeweils eine Minute mit PBS waschen. Bei der Handhabung der Ringe stets schonend mit dem empfindlichen endothelialen Gewebe umgehen.Unter dem Mikroskop die Aortaringe mit einer mikrochirurgischen Schere längs auf einem Objektträger schneiden. Anschließend überschüssige Flüssigkeit von der Aorta entfernen, wobei diese feucht gehalten wird. Mit zwei mikrochirurgischen Pinzetten die aufgerollten Aortenstücke flach auf den Objektträger drücken, sodass das Endothel nach unten zur Glasoberfläche weist.Bei diesem Vorgang die Aorten nicht hin und her bewegen. Dieser Schritt ist sehr kritisch, aber nicht leicht durchzuführen. Es ist ratsam, vor dem eigentlichen Experiment gut zu üben.Tragen Sie dann das Einbettungsmedium auf die Aorta auf. Decken Sie den Objektträger ab und versiegeln Sie ihn mit Nagellack. Nach dem Trocknen an der Luft im Dunkeln untersuchen Sie die Objektträger mittels konfokaler Mikroskopie.Verwenden Sie eine Abtastrate von 200 Hertz, eine Auflösung von 1024 × 1024 Pixeln und eine Z-Stapel-Größe von einem Viertel Mikrometer. Um DAF-2DA zu beobachten, verwenden Sie einen Argonlaser, stellen Sie die Anregungsfluoreszenz auf 488 Nanometer ein und die Emissionsdetektion auf 515 Nanometer. Um DHE zu beobachten, stellen Sie die Anregungsfluoreszenz auf 514 Nanometer ein und die Detektion auf 605 Nanometer.Nachdem Sie mit einer 10fachen Vergrößerung fokussiert haben, stellen Sie das Objektiv auf eine 40fache Vergrößerung um. Definieren Sie nun den Bereich der endothelialen Schicht, indem Sie die z-Position am Bedienfeld unter Verwendung der mit DAPI gefärbten Kerne als Orientierungspunkte anpassen. Scannen Sie anschließend ausgehend von der endothelialen Schicht an der Lumengrenze durch die gesamte Dicke der endothelialen Schicht und nehmen Sie die Bilder auf.Untersuchen Sie mindestens drei verschiedene Gesichtsfelder pro Probe. Junge C57 black 6 Mäuse wurden durch eine 14-wöchige fettreiche Ernährung fettleibig gemacht. Die Kontrollen erhielten normales Futter.Nach 14 Wochen wurden ihre thorakalen Arterien untersucht. Vor der Färbung wurden die Gewebe eine Stunde lang einem eNOS-Hemmer L-NAME in einer Konzentration von einem Nanomolar ausgesetzt. Das Signal von DAF-2T, das grün erscheint, entsteht durch Umwandlung des nicht fluoreszierenden DAF-2 durch Stickstoffmonoxid.Die Färbung deutet also auf das Vorhandensein von Stickstoffmonoxid in einer Zelle hin. Ebenso gibt DHE, wenn es durch Superoxid oxidiert wird, ein rotes fluoreszierendes Signal ab. Somit enthalten die Proben, die eine intensivere rote Färbung zeigen, mehr Superoxid in den Zellen.Die Quantifizierung der konfokalen Fluoreszenzbilder zeigte eine Abnahme der Stickstoffmonoxid-Produktion und eine Zunahme der L-NAME-sensitiven Superoxid-Generierung in der aortalen Endothelschicht der mit fettreicher Nahrung gefütterten Mäuse. Diese Daten stützen die Annahme, dass eine eNOS-Entkopplung bei Adipositas auftritt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Stickstoffmonoxid und Superoxid-Anionen nachweist sowie fluoreszierende Farbstoffe in intakten Blutgefäßen verwendet.Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von sechs Stunden durchgeführt werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass die endotheliale Schicht während des gesamten Operationsablaufs intakt bleibt. Tauchen Sie die Blutgefäße stets in Krebs-Ringer-Puffer, um die endothelialen Zellen vor dem Fixierungsschritt am Leben zu erhalten.In Kombination mit diesem Verfahren können andere Maßnahmen wie die Analyse vasomotorischer Reaktionen von Blutgefäßen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen hinsichtlich der physiologischen Funktion endothelialer Zellen bei der Regulierung des Gefäßtonus zu beantworten.

en-face-detection-nitric-oxide-superoxide-endothelial-layer-intact

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Elektronenspin-Resonanz (EPR)-Spektroskopie wurde eingesetzt, um Stickoxid aus Rinder-Endothelzellen und Superoxidradikalanion von menschlichen Neutrophilen unter Verwendung von Eisen (II)-N-Methyl-D-glucamin Dithiocarbamat, Fe (MGD)...

Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid-Radikalanion von paramagnetischer Resonanzspektroskopie von Zellen mit Spinfallen

Die endogene Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) reguliert eine Vielzahl von biologischen Funktionen. Es wird zunehmend klar, dass Störungen oder Fehlregulation der NO-basierter Signalisierung in vielen menschlichen Krankheiten beteiligt ist. Methoden zur Quantifizierung relevanter keine Metaboliten können neue diagnostische oder prognostische Biomarker für Erkrankungen des Menschen bieten.

Analytische Verfahren zur Bestimmung von Stickoxid Bioaktivität

Die Funktion der vaskulären Zellen hängt von der Aktivität der intrazellulären Botenstoffe ab.  Beschrieben wird hier ein ex vivo Zwei-Photonen-Bildgebungsverfahren, das die Messung des intrazellulären Calcium- und Stickoxidspiegels als Reaktion auf physiologische und pharmakologische Reize in einzelnen endothelialen und glatten Muskelzellen einer isolierten Aorta ermöglicht.

Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Transport- und Stickoxid-Produktion in Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Rattenaorta

Primäre humane Nabelvenendothelzellen (HUVECs) wurden innerhalb eines mikrofluidischen Netzwerkgeräts zur Konfluenz gezüchtet. Die Endothelzellübergänge und F-Aktin-Verteilungen wurden dargestellt und die Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration und der Stickoxidproduktion als Reaktion auf Adenosintriphosphat (ATP) wurden in Echtzeit auf Einzelzellebene quantifiziert.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Ein Verfahren zur Herstellung von Gesichtspräparaten der Kartoffel-Arterie und Aorta der Maus ist beschrieben. Solche Präparate, wenn sie mit spezifischen Antikörpern immunfluoreszenz gefärbt sind, ermöglichen es uns, die Lokalisation von Proteinen und die Identifizierung von Zelltypen innerhalb der gesamten Gefäßwand durch konfokale Mikroskopie zu untersuchen.

En Face Vorbereitung der Maus Blutgefäße

Dieses Manuskript präsentiert Protokolle für die Anwendung neuartiger genetisch kodierter Stickstoffmonoxid (NO•)-Sonden (geNOps) zur Überwachung von NO•-Fluktuationen einzelner Zellen in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie. Die Ca2+-getriggerte NO•-Bildung auf der Ebene einzelner Endothelzellen wurde durch die Kombination von geNOps mit einem chemischen Ca2+-Sensor sichtbar gemacht.

Die Anwendung von genetisch kodierter Fluorescent Stickstoffmonoxid (NO) • Sonden, die geNOps, für Echtzeit-Imaging von NO • Signale in Einzelzellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Immunfluoreszenzfärbung vor, um die Endothelzellen der Mausaorta direkt zu beobachten. Diese Technik ist nützlich, wenn der zelluläre und molekulare Phänotyp von Endothelzellen in verschiedenen Strömungsmustern und bei der Entwicklung von Arteriosklerose untersucht wird.

Verwendung von En Face Immunofluoreszenz Färbung zur direkten Beobachtung von vaskulären Endothelzellen

Hier stellen wir Protokolle zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen biologisch relevanten Derivaten mittels Chemilumineszenz-basierter Assays mit hoher Sensitivität vor.

Chemilumineszenz-basierte Assays zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen Derivaten aus Autoxidation und nitrosierten Verbindungen

Die Bildung von Superoxid-Anionen ist essentiell für die Stimulation von Blutplättchen und, wenn sie dysreguliert ist, entscheidend für thrombotische Erkrankungen. In diesem Artikel stellen wir drei Protokolle für den selektiven Nachweis von Superoxid-Anionen und die Untersuchung der redoxabhängigen Thrombozytenregulation vor.

Alternative Methoden zum Nachweis der Erzeugung von Superoxid-Anionen in Blutplättchen 

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) ist eine sensible und quantitative Methode zur globalen Muster der post-translationale Modifikationen in Zubereitungen native, intakte Nukleosomen zu erkennen. Diese Änderungen umfassen Methylierungen, Acetylierungen und Phosphorylierungen an bestimmten Histon Aminosäurereste und damit NU-ELISA bietet eine globale Proteom-Test des Gesamtsystems Chromatin Modifikation Staaten von spezifischen Zelltypen.

Erkennung von Post-translationale Modifikationen auf Native Intact Nukleosomen mittels ELISA

Lernen Sie die simultane Detektion von Stickstoffmonoxid und Superoxid in intakten Mäuseaorten mit den Fluoreszenzfarbstoffen DAF-2DA und DHE. Diese Methode ermöglicht die direkte Visualisierung oxidativer Stressmarker in Endothelzellen.

En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

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