Name: Eine hohe Auflösung Methode zur Phosphorylierung abhängige Aktivierung von IRF3 Überwachen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Lernen Sie eine hochauflösende Methode zur Analyse der phosphorylierungsabhängigen Aktivierung von IRF3 mittels SDS-PAGE, Native-PAGE und phosphospezifischen Antikörpern. Diese Technik ermöglicht die Unterscheidung verschiedener aktivierter IRF3-Formen in humanen und murinen Zellen.

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Die Autoren danken früheren und aktuellen Mitgliedern des Labors für die Entwicklung der Protokolle. Die Arbeit wurde durch Mittel der Canadian Institutes of Health Research (CIHR) [grant # MOP-130527] und des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [NSERC-355306-2012] unterstützt. NG ist Träger eines Tier II Canada Research Chair. AR ist Stipendiatin des Ausbildungsprogramms des Respiratory Health Research Network des Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).

HINWEIS: Das Protokoll wird hier unter Verwendung von A549-Zellen mit Sendai-Virus (SeV) infiziert beschrieben. Jedoch wird das Protokoll für die SDS-PAGE und native PAGE funktioniert auch bei allen bisher untersuchten humanen und murinen Zelltypen, insbesondere Knochenmarkzellen mit verschiedenen Stimuli 9,15,19,24,25 IRF3 aktivierende stimuliert. 1. Die Infektion von A549-Zellen <ol><li> Aufrechtzuerhalten A549-Zellen in Kultur in einer 15 cm Platte bei 37 ° C / 5% CO 2 in 20 ml F12K / Ham-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (HALLO-FBS) und 1% L-Glutamin (gesamt F12K / Ham-Medium). Hinweis: Alle für die Zellkultur und Behandlungen verwendet Lösungen müssen steril sein. </li><li> Bei 24 Stunden vor der Infektion, saugt den mittleren und die Zellen werden mit 10 ml destilliertem phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS) bei RT. </li><li> 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung zu jeder Platte, die Zellen abdecken und bei 37 ° C für 3 min. </li><li> Stoppen Sie die Inkubationszeit, sobald the-Zellen beginnen, von der Platte durch Ausklopfen sanft mit einer Hand zu lösen. Inaktivierung der Trypsin durch Zugabe von 10 ml vorgewärmt komplette F12K / Ham-Medium pro Platte und übertragen Sie die Zellen auf eine 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 350 × g für 3 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 8 ml komplette F12K / Ham-Medium, um eine homogene Einzelzellsuspension zu erhalten. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Pflanzensamen, die Zellen in einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen pro 60 mm Platte in 4 ml vorgewärmt komplette F12K / Ham-Medium. Inkubation für 20-24 Stunden bei 37 ° C / 5% CO 2. Nach 20 bis 24 h, bilden die Zellen eine 90% konfluenten Monolayer (das entspricht 1,5 x 10 6 Zellen). </li><li> Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 2 ml Serum-freiem F12K / Ham-Medium (SFM). 2 ml frischem SFM pro 60 mm Platte. </li><li> Tauwetter ein Aliquot des Sendai-Virus (SeV) (bei -80 ° C gelagert aliquotiert) auf Eis und kurz vortexen. </li><li> Verdünnen Sie the-Virus im vorgeheizten SFM bis 60 HAU / 100 &amp; mgr; l zu erhalten. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren sanft und fügen Sie 100 ul der verdünnten Virus pro Platte, um die Infektion bei 40 HAU / 10 6 Zellen durchzuführen. Sie Virus in der nicht infizierten Kontrollplatte hinzufügen, nicht. </li><li> Die Zellen in den Inkubator bei 37 ° C / 5% CO 2. Man schüttelt die Platten von Hand 3 oder 4 mal, oder mit Hilfe eines automatischen Orbital- oder Schüttler direkt in den Inkubator gestellt, während der ersten Stunde der Infektion. </li><li> Bei 2 h nach der Infektion, 2 ml F12K / Ham-Medium, das 20% HALLO-FBS, um eine Endkonzentration von 10% HALLO-FBS zu erhalten. </li><li> Die Zellen in den Inkubator bei 37 ° C / 5% CO 2 für eine weitere 1, 4 und 7 h auf insgesamt Infektion Zeiten von 3, 6 und 9 Stunden zu erreichen sind. An jedem dieser Zeitpunkte, fahren Sie mit Schritt 2.1. </li></ol> 2. Herstellung von Ganzzellextrakte (WCE) <ol><li> Entfernen Sie das Infektionsmedium. Ernte der Zellen durch Abschaben in 1 mleiskaltem D-PBS und übertragen Sie die Zellsuspension auf eine vorgekühlte 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 16,000 × g bei 4 ° C für 20 sec und sorgfältig dekan alle Spuren von D-PBS. HINWEIS: Bei diesem Schritt kann das Zellpellet direkt auf Proteinextraktion oder schockgefroren in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis / Ethanol-Bad bei -80 ° C bis zur Lyse gespeichert unterworfen werden. </li><li> Vorbereitung der Lysepuffer, enthaltend 50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10% Glycerin und 1% Nonidet P-40 in destilliertem Wasser (ddH 2 O). Extemporarily hinzuzufügen Protease (1 ug / ml Leupeptin und 2 &amp; mgr; g / ml Aprotinin) und Phosphatase-Inhibitoren (5 mM Natriumfluorid, 1 mM aktiviert Natriumorthovanadat, 2 mM p-Nitrophenylphosphat und 10 mM β-Glycerophosphat, pH 7,5). HINWEIS: Der Lysepuffer ohne Inhibitoren können bei 4 ° C gelagert werden. Ein spezifisches Protokoll für die Aktivierung von Natriumorthovanadat in der Tabelle mit den spezifischen Reagenzien / Aufstellb beschriebennt. </li><li> Zellpellet in 70 &amp; mgr; l Lysepuffer. Typischerweise ist das Lysat Konzentration wird etwa 2 ug / ul sein. </li><li> Inkubieren auf Eis für 20 min. Flash-Einfrieren des Lysats durch Inkubation in einem Bad mit flüssigem Stickstoff für 15 Sek. Auftauen Lysat bei RT, bis es vollständig geschmolzen ist und Vortex für 10 Sekunden. Wiederholen Sie die Frost / Tau / Wirbelzyklus 3 mal. <ol><li> Alternativ führen Sie den Gefrierschritt in einem Ethanol / Trockeneis-Bad für 1 min. </li></ol></li><li> Zentrifuge bei 16.000 × g bei 4 ° C für 20 min. Den Überstand (der dem WCE) in eine neue vorgekühlte 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. Halten Sie das WCE auf Eis zu allen Zeiten. </li><li> Quantifizierung von Proteinen unter Verwendung jedes Protein Quantifizierungsverfahren mit Lysepuffer wie Bradford-Protein-Assay auf Basis 26 kompatibel. </li></ol> 3. Beschlussfassung der WCE Hohe Auflösung SDS-PAGE <ol><li> Bereiten Sie drei denaturierenden Elektrophorese Gele. <ol><li> Zum Nachweis vonIRF3 Formen gießen zwei Gele von mindestens 16 cm Länge mit einem Trenngel 7,5% Acrylamid / Bis-Acrylamid (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl, pH 8,8 (RT), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS ), 1% Ammoniumpersulfat und 0,1% in ddH 2 O TEMED und einem Sammelgel 4% Acrylamid, 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, 1% Ammoniumpersulfat und 0,1% in ddH 2 TEMED O. Vorsicht! Acrylamid, TEMED und SDS sind toxisch und / oder reizend. Schutzhandschuhe tragen und unter einer Abzugshaube zu manipulieren. </li><li> Zum Nachweis von SeV Proteine ​​gießen einem Gel aus einem Minimum von 8,5 cm Länge bei, ähnlich der in 3.1.1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass das Trenngel enthält 12% Acrylamid-Gel Eigenschaften. </li></ol></li><li> Denaturieren des in Schritt 2.6 erhaltenen WCE durch Zugabe von 1: 4 (v / v) 5x Ladepuffer (125 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT), 10% SDS, 20% (p / v) Glycerin, 0,0005% Bromphenolblau und 25% β-Mercaptoethanol in ddH 2 O), gefolgt von Erwärmen bei 100 °C für 10 min. Schnellspin die Rohre nach unten die Kondensation, die in der Kappe bildet zu bringen. Vorsicht! β-Mercaptoethanol ist giftig beim Einatmen. Schutzhandschuhe tragen und unter einer Abzugshaube zu manipulieren. </li><li> Montieren Sie die Gele in der Migrationsgerät. Füllen des oberen und unteren Kammern mit Laufpuffer, der 25 mM Tris-Base, 0,1% SDS und 192 mM Glycin in destilliertem Wasser (dH 2 O). </li><li> Last 14 ul der Molekulargewichtsstandard in einer Vertiefung jeder 16 cm Gel und 7 ul der Molekulargewichtsstandard in einem auch der 8,5 cm-Gel. Last 30 ug denaturierter WCE (hergestellt wie in Schritt 3.2 beschrieben) pro Vertiefung der beiden Gele in Schritt 3.1.1 IRF3 Formen Detektions hergestellt. Last 8-10 ug denaturierte WCE (hergestellt wie in Schritt 3.2 beschrieben) pro Vertiefung auf dem Gel in Schritt 3.1.2 SeV Analyse vorbereitet. </li><li> Führen Sie die Gele bei 30 mA Konstantstrom, bis der Migrationsfront den Boden des Gels erreicht. HINWEIS: Migration dauert in der Regel approximadig 3 Stunden für eine 16 cm-Gel und 45 min für eine 8,5 cm Gel. </li><li> Fahren Sie mit dem Transfer auf Nitrocellulosemembranen (Schritt 5). </li></ol> 4. Analyse der IRF3 Dimerisierung von Native-PAGE Hinweis: Diese Methode wurde ursprünglich von der Gruppe von Dr. T. Fujita 27 beschrieben. <ol><li> Bereiten Sie die obere (-) und unteren (+) Kammer Elektrophorese-Puffer. Die obere Kammer Puffer besteht aus 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT), 192 mM Glycin und 1% Natriumdeoxycholat (DOC) in ddH 2 O. Die untere Kammer Puffer enthält 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT) und 192 mM Glycin in ddH 2 O. HINWEIS: Die obere und die untere Kammer der Elektrophorese-Puffer bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. Stellen Sie jedoch sicher, dass sie auf RT vorgewärmt, bevor Sie die Elektrophorese. </li><li> Gießen eines nicht denaturierenden Trenngel von mindestens 8,5 cm Länge, enthaltend 7,5% Acrylamid / Bisacrylamid (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl, pH 8,8 (RT), 1% ammonium Persulfat und 0,1% in ddH 2 O. TEMED </li><li> Vorlauf das Gel bei 40 mA Konstantstrom für 30 Minuten auf Eis. Drücken Sie die Laufgerät in das Eis in etwa der Höhe des unteren Kammer Elektrophorese-Puffer. Es ist wichtig, dass das Gel nicht in das Eis. </li><li> Während Vorlauf, mischen WCE auf Eis gehalten mit 2x nativen PAGE-Ladepuffer 1: 1 (v / v), die 125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 30% Glycerin und 0,1% Bromphenolblau in ddH 2 O. </li><li> Last 8 - 10 &amp; mgr; g WCE (hergestellt wie in Schritt 4.4 beschrieben) unmittelbar am Ende des Vorlauf. </li><li> Führen Sie das Gel bei 25 mA Konstantstrom auf Eis, wie oben für den Vorlauf beschrieben, bis der Migrationsfront den Boden des Gels (ca. 40 min) erreicht. </li></ol> 5. Immunoblotanalyse IRF3 Species <ol><li> Vorbereitung der Transferpuffer, der 25 mM Tris-Base und 192 mM Glycin in ddH 2 O. Kühlen den Transferpuffer bei 4 ° C vor dem Gebrauch. </li><li> Nass drei Stück Nitrocellulose-Membran auf eine Größe geringfügig größer als die Gele in einem Kunststoff / Glas-Box mit den Übertragungspuffer geschnitten. Geben Sie die Orientierung der Membran durch Abschneiden einer Ecke. Der Übertragungspuffer kann 3-mal wiederverwendet werden. Lagern Sie den Puffer bei 4 ° C zwischen den Anwendungen. </li><li> Ungegossen die Gele (SDS-PAGE und native-PAGE) und schneiden Sie eine Ecke jedes Gel für die richtige Orientierung. <ol><li> Für native-PAGE, Inkubation des Gels bei RT unter leichtem Schütteln für mindestens 30 min in der SDS-PAGE-Laufpuffer, um das DOC vor der Übertragung auf dem Übertragungspuffer zu entfernen. </li></ol></li><li> Die Gele (SDS-PAGE und native-PAGE) in der Transferpuffer Inkubation für 5 - 10 min. </li><li> Montieren Sie einen Transfer-Sandwich pro Gel in einer Transferkassette mit der Membran in Richtung der positiven Elektrode (Schaumstoffpolster / Filterpapier / Membran / Gel / Filterpapier / Schaumstoffunterlage). Seien Sie vorsichtig, um alle Luftblasen zwischen den Schichten des Sandwich zu entfernen. </li><li> Führen Sie die Übertragung, wie empfohlen by der Hersteller für die Übertragungsvorrichtung verwendet wird. HINWEIS: Führen Sie alle Inkubationen und Waschungen in den nächsten Schritten auf einem Schaukel oder Orbitalschüttelvorrichtung Plattform. </li><li> Am Ende der Bewegungsphase, Inkubation der Membranen für 15 min in der Fixierungslösung, die 7% Essigsäure, 40% Ethanol und 3% Glycerin in ddH 2 O. Waschen der Membranen 3x 5 min in PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10,2 mM Na 2 HPO 4 und 1,8 mM KH 2 PO 4 in dH 2 O). Vorsicht! Essigsäure ist giftig, reizend und brennbar. Schutzhandschuhe tragen und unter dem Abzug zu manipulieren. HINWEIS: Die Fixierungslösung kann mehrfach wiederverwendet werden. </li><li> Für die native-PAGE-Membran gehen Sie direkt zu Schritt 5.11. </li><li> Spülen der drei SDS-PAGE Membranen schnell in dH 2 O vor dem Inkubieren für 1 min in rot ponceau Lösung, enthaltend 6,57 mM rotem Ponceau und 1% Essigsäure in ddH 2 O. HINWEIS: Die rote ponceau Lösung r<html> eused mehrmals. </li><li> Spülen Sie die Membranen in dH 2 O, bis der Hintergrund ist weiß genug, um die Proteinbanden in rot gefärbt sehen. Beachten Sie die Markierungen mit einem Bleistift und den überflüssigen Membran um den Proteinen. Entfärben Membranen durch Inkubation für 5 min in PBS unter Rühren. </li><li> Die Membranen 1 h bei RT oder O / N Inkubieren bei 4 ° C in Blockierungslösung (PBS, enthaltend 0,05% Tween 20 und 5% fettfreier Trockenmilch (PBS-T-Milch). Waschen der Membranen 3x 5 Minuten in PBS-T. HINWEIS: Die PBS-T Wäsche ist optional und nur dann erforderlich, wenn die Anwendung streng Antikörper in PBS-T, enthaltend 5% Rinderserumalbumin (PBS-T-BSA) (Abbildung 1 und Tabelle 1) in der nächsten Stufe verdünnt. </li><li> Inkubieren Sie die vier Membranen (von SDS-PAGE und native-PAGE) mit den primären Antikörper gemäß der Reihenfolge in Abbildung 1 und Tabelle 1 beschrieben. Führen Sie 5x 5 min Waschen in PBS-T. </li></ol>&quot;&gt; <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53723/53723fig1.jpg" /> Abbildung 1. Reihenfolge der Immunoblot Analysen. Die schematische beschreibt die einzelnen SDS-PAGE und native-PAGE-Gelen erforderlich, um die verschiedenen IRF3 phosphoryliert und monomeren / dimeren Formen zu erkennen. Die spezifische Reihenfolge der Antikörper an die Membran von jedem Gel im Immunoblot Verfahren hervor angewandt ist. Beachten Sie, dass die Anti-Aktin-Antikörper werden zuerst verwendet, um eine gleiche Beladung der Proben vor Anwenden anderer spezifischer Antikörper zu gewährleisten. Die alternierende Sequenz, mit anti-Aktin-Antikörper, die nach den anti-phospho-IRF3 Antikörper aufgebracht, auch funktioniert. Stripping ist zwischen anti-Aktin und anti-SeV Antikörpern oder zwischen anti-Phospho-IRF3 und Anti-IRF3 Antikörper wegen der Größe der überlappenden Signalen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53723/53723fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Primäre Antikörper </td><td> Verdünnung </td><td> Verdünnungspuffer </td><td> Incubation </td><td> Sekundärantikörper </td><td> Bemerkungen </td></tr><tr><td> Anti-Actin </td><td> 1 / 10.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> 15 min bei RT </td><td> Anti-Maus- </td><td> Zu verwenden, nach SDS-PAGE Verdünnt antibodyies kann mehrere Male wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C in Gegenwart von 0,02% Natriumazid gelagert. </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-P-Ser386 </td><td> 1/200 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N bei 4 ° C </td><td> Anti-Kaninchen- </td><td> Verwenden Sie nach dem Mutter-PAGE. Es wird nicht empfohlen, um die verdünnte Antikörper Wiederverwendung </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-P-Ser396 </td><td> 1 / 10.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N bei 4 ° C </td><td&gt; Anti-Kaninchen- </td><td> Verwenden Sie nach der SDS-PAGE. Es wird nicht empfohlen, um die Wiederverwendung der verdünnten Antikörpers Anti-IRF3-P-396 ist auch von Cell Signaling. Optimale Verdünnung wurde als 1 / 1.000 für diesen Antikörper definiert, sondern kann zwischen den Chargen variieren. </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-P-Ser398 </td><td> 1 / 10.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N bei 4 ° C </td><td> Anti-Kaninchen- </td><td> Verwenden Sie nach der SDS-PAGE. Es wird nicht empfohlen, um die verdünnte Antikörper Wiederverwendung </td></tr><tr><td> Anti-IRF3 voller Länge </td><td> 1 / 7.500 </td><td> PBS-T-Milch </td><td> 3 h bei RT </td><td> Anti-Kaninchen- </td><td> Verwenden Sie nach der SDS-PAGE. Anti-IRF3 Antikörpers voller Länge kann nach der nativen PAGE verwendet werden, aber es ist weniger empfindlich, um das Monomer zu erkennen. Verdünnt Antikörper können mehrmals wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C in Gegenwart von 0,02% Natriumazid gelagert. </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-NES </td><td> 0,5 ug / ml </td><td> PBS-T-Milch </td><td> 3 h bei RT </td><td> Anti-Kaninchen- </td><td> Verwenden Sie nach dem Mutter-PAGE. Verdünnt antibodyies kann mehrere Male wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C in Gegenwart von 0,02% Natriumazid gelagert. </td></tr><tr><td> Anti-SeV </td><td> 1 / 14.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> 3 h bei RT </td><td> Anti-Kaninchen- </td><td> Verwenden Sie nach der SDS-PAGE. Verdünnt antibodyies kann mehrere Male wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C in Gegenwart von 0,02% Natriumazid gelagert. </td></tr><tr><td colspan="6"> HINWEIS: Verdünnung und Puffer für HRP-gekoppelten sekundären Antikörper verwendet werden, müssen optimiert werden, da sie variiert von einem Unternehmen zum anderen. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Technische Daten der Antikörper im Immunoblotting-Verfahren verwendet. <ol start="13"><li> Inkubieren der Membranen mit der Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugierten sekundären Antikörper, wie in Abbildung 1 und Tabelle 1 aufgeführt. Waschen der Membranen 5x 5 min in PBS-T, gefolgt von 2 x 5 min in PBS, um Spuren von Tween vollständig entfernen. </li><li> Die Membranen 1 min Inkubieren in einem Volumen von verstärkter Chemilumineszenz-Reagenz ausreicht zur vollständigen Bedeckung der Membranen. Trocknen Sie die Membranen unter Verwendung von Filterpapier. </li><li> Legen Sie die Membranen in einem lumineszierenden Bildes Analysator, um die immunreaktiven Banden sichtbar zu machen. <ol><li> Alternativ führen Sie den Nachweis von immunreaktiven Banden mit empfindlichen Röntgenfilme. </li></ol></li><li> Die Membranen 3x 5 min in PBS waschen. HINWEIS: Bei diesem Schritt können die Membranen trocken gehalten werden. Ist jedoch eine weitere Abziehen erforderlich ist, ist es besser, das Strippen vor dem Trocknen der Membran durchzuführen. Membranen können auch zur kurzfristigen in PBS gelagert werden. </li><li> Für die Membranen, die nicht Strippen zwischen Inkubation mit Antikörpern erfordern (siehe Abbildung 1) gehen Sie direkt zu Schritt5.20. </li><li> Beim Abisolieren zwischen Antikörpern (siehe Abbildung 1), Inkubation der Membranen in vorgewärmtem Ausstreiflösung, die 2% SDS, 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8 (RT) und 0,7% β-Mercaptoethanol in ddH 2 O bei 50 ° C erforderlich für 20 min unter regelmäßiger Bewegung. Die Membranen 3x 5 min in PBS waschen. HINWEIS: Agitation während des Stripping-Verfahren ist der Schlüssel. Strippen kann in einem Hybridisierungsofen durchgeführt werden. Alternativ Strippen kann unter Verwendung von Membranen, die in Kunststoffbeutel versiegelt und in ein Wasserbad eingetaucht werden. In diesem Fall ist es wichtig, um die Membranen 4 rühren - 5 mal während der Inkubation. </li><li> Die Membranen inkubiere 1 h bei RT oder O / N bei 4 ° C in PBS-T-Milch. </li><li> Die Schritte 5,12-5,16 gemäß 1. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das Protokoll beschreiben wir hier aus einer Kombination von hochauflösenden SDS-PAGE und native-PAGE auf die Verwendung von mehreren phosphospecific Antikörper zu den monomeren / dimeren und phosphoforms I-IV IRF3 unterscheiden gekoppelt. Entsprechende Erfassung dieser IRF3 Spezies ist wichtig, um vollständig zu charakterisieren IRF3 Aktivierung in einer bestimmten Umgebung. B. LPS-Stimulierung von aktivierten Makrophagen führt zur Bildung von dimeren, Ser396 / 398 phosphoryliert IRF3 die eine hypophosphorylierten (For...

<html> Das ubiquitär und konstitutiv exprimierten Transkriptionsfaktors Interferon (IFN) Regulatory Factor 3 (IRF3) ist entscheidend für die erste Linie der Verteidigung gegen Krankheitserreger vor allem durch die Induktion von IFN &amp; beta;, aber auch durch die Induktion des Chemokin (CC motif) Ligand 5 (CCL5 ) und mehrere antivirale Proteine, einschließlich IFN-induzierte Protein mit tetratricopeptide wiederholt IFIT1 / 2/3 1-3. Oder Lipopolysaccharid (LPS) 4: IRF3 Aktivierung wurde nach der Infektion mit einer Vielzahl von Viren, oder durch Einwirkung von Polyinosin-Polycytidylsäure (Poly-I C) angegeben. Wichtig ist, dass die meisten untersuchten Viren Mechanismen entwickelt, um die IRF3 vermittelte Reaktion entziehen und damit die Flucht der Host angeborenen Immunabwehr 5. Somit überwachen IRF3 Aktivierung ist von großer Bedeutung, um die molekularen Mechanismen der unspezifischen antiviralen Abwehr verstehen, sondern auch, um die durch Viren verwendet, um diese Antwort entgegenzuwirken Strategie zu identifizieren. ent &quot;&gt; Viele veröffentlichten Berichten allerdings nur eine begrenzte Analyse IRF3 Aktivierung durch die Überwachung der IRF3-Zielgen Induktion (IFNB1 und IFIT1) durchgeführt und / oder Luciferase-Reportergen-Assay zu niedrige Auflösung Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gekoppelt ist (SDS- PAGE) -Analyse IRF3. Jedoch zahlreiche biochemische Studien zeigte die Analyse des Verhaltens verschiedener IRF3 Mutanten und Aufklärung der Kristallstruktur IRF3 6-11 haben dazu beigetragen, dass IRF3 herzustellen ist mit einer komplexen Reihe von aufeinanderfolgenden posttranslationalen Modifikationen durch Phosphorylierung an unterworfen mehreren Standorten. Die Menge der Phosphorylierung in IRF3 Aktivierung beteiligt scheint von dem Stimulus und höchstwahrscheinlich nach Zelltyp zu sein. Bei nicht infizierten Zellen, koexistiert IRF3 als nicht-phosphoryliert und hypophosphorylierten enthaltenden Arten phosphoresidues einschließlich Thr135 und Ser173, in der 1 -198 aa N-terminalen Bereich 6,12-14. Anhäufung dieser hypophosphorylierten form der IRF3 durch Stress induzieren, Wachstumsfaktoren und DNA-schädigende Mittel 6 induziert. Phosphorylierung von Ser / Thr-Reste am C-terminalen Region von IRF3 enthaltend die Transaktivierungsdomäne ausgelöst nach einer Aktivierung, die durch Viren, Poly I: C oder LPS in einer zelltypabhängig 15-17. C-terminale Phosphorylierung von IRF3 beinhaltet nicht weniger als 7 verschiedene phosphoacceptor Standorten in zwei Hauptcluster, Ser385 / Ser386 und Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405 organisiert, dass jeder dazu beitragen, IRF3 Aktivierung durch Dimerisierung, Kernakkumulation, Verbindung mit dem CREB bindenden Protein (CBP) / p300 Co-Aktivatoren, DNA-Bindung an sensiblen Antwortelement (ISRE) Konsensus-Sequenzen und Transaktivierung von Zielgenen 9,10,17-19 IFN. Die Phosphorylierung von Thr390 ist auch gedacht, um virusinduzierten IRF3 Aktivierungs 20 beizutragen. Massenspektrometrie-Analysen von IRF3 haben gezeigt, dass Ser386, Thr390, Ser396 und Ser402 Reste direkt phosphorylatdurch den Inhibitor der &amp; kgr; B-Kinase ε (IKKε) ed / TANK-bindenden Kinase 1 (TBK1) Kinasen 9,10. Phosphorylierung an der C-terminalen Reste auch für die Beendigung des IRF3 Aktivierung über Polyubiquitinierung und Proteasom-vermittelten Abbau 10 erforderlich. Dieses Verfahren ist auch abhängig von der Phosphorylierung an Ser339, der für die Einstellung des propyl Isomerase Pin1 10,11 erforderlich ist. IRF3 Spezies, die mindestens Phospho-Ser339 / 386/396 Rückstände berücksichtigt werden hyperphosphorylierten Formen. Der genaue Ablauf und Funktion der Website bleibt eine Frage der Diskussion 10,21. Es ist nun klar, dass aktiviert IRF3 keinen homogenen Zustand dar, sondern dass verschiedene aktivierte Spezies ausgeprägte Phosphorylierung oder Dimerisierung Eigenschaften aufweisen vorhanden 10,22. Um ein vollständiges Verständnis der IRF3 Aktivierung in Reaktion auf bestimmte Krankheitserreger liefern, ist es daher notwendig, characterize welche der aktivierten Spezies induziert werden. Induktion IRF3 Zielgene IFNB1 und IFIT1 hat sich als zuverlässige Auslese für IRF3 Aktivierung. Jedoch Überwachen Expression dieser Gene nicht zwischen verschiedenen Aktivierungszuständen des IRF3 unterscheiden. Eine umfassende Analyse der IRF3 Aktivierungszustände in einer bestimmten Einstellung stützt sich auf die detaillierte Charakterisierung ihrer Phosphorylierung und Dimerisierung Status 10. Unphosphorylierten (Form I), hypophosphoryliert (Form II) und hyperphosphoryliertem (Formen III und IV) IRF3 Formen 6,18,23 erfolgreich durch eingeschränkte Mobilität in hoher Auflösung SDS-PAGE-Analyse aufgelöst werden. Monomeren und dimeren IRF3 Spezies effizient durch native-PAGE-Analyse identifiziert werden. Diese Ansätze werden stark verbessert, wenn es in Kombination mit phosphospecific Antikörper gegen verschiedene IRF3 phosphoacceptor Teilen geleitet verwendet. Standardprotokolle ermöglichen eine schlechte Auflösung vonProteine, die keine wirksame Trennung von unterschiedlichen IRF3 phosphorylierten Formen zulässt. Hier beschreiben wir im Detail ein Verfahren, um die höchste Auflösung zu erreichen, um die Induktion von verschiedenen Virus-aktivierte IRF3 Spezies unter Verwendung von SDS-PAGE, native-PAGE in Kombination mit Immunoblot gekoppelt mit Gesamt und phosphospecific Antikörper zu überwachen. In vivo Diskriminierung zwischen den Aktiv Formen IRF3 wird auf der Basis ihrer in der SDS-PAGE beobachteten Mobilitätsverschiebungen durchgeführt. Zusätzlich kann IRF3 Monomer und Dimer von nicht-denaturierenden Elektrophorese unterschieden werden. Die Kombination dieser zwei komplementären Techniken mit Immunoblot erweist sich als eine kostengünstige und sensiblen Umgang mit alle notwendigen Informationen für eine vollständige Analyse der Phosphorylierung-vermittelte Aktivierung von IRF3 erwerben.

<table><tbody><tr><td>F12/Ham Life</td><td>Technologies</td><td>11765-054</td><td>Warm bei 37°; C Bad vor Gebrauch.</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>Für die Zellkultur.</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA 0,25%</td><td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Sendai Virus Cantell Stamm</td><td>Charles River Laboratories</td><td>600503</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Bioshop</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>Schneiden Sie das Ende der Spitze ab und pipetieren Sie langsam, da sie sehr dick ist.</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7771</td><td>Eingetragene Marke entsprechend Octylphenoxypoly(ethylenoxy)ethanol (Nonidet P-40) Waschmittel</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Bioshop</td><td>LEU001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Bioshop</td><td>APR600.25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>Natriumorthovanadat</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Aktivierung von Natriumorthovanadat 0,2 M : 1) Erhöhen Sie den pH-Wert auf 10,0 mit entweder 1 N NaOH oder 1 N HCl. Der Ausgangs-pH-Wert der Natriumorthotovanadatlösung kann mit vielen Chemikalien variieren. 2) Die Lösung ist bei einem pH-Wert von 10,0 gelb. 3) Kochen Sie, bis sie farblos sind. 4) Auf RT abkühlen lassen. 5) Den pH-Wert auf 10,0 erhöhen und die Schritte 3-4 wiederholen, bis die Lösung farblos bleibt und sich bei 10,0 stabilisiert. Lagern Sie die aktivierten Natriumorthovanadat-Aliquots bei -20 °C.</td></tr><tr><td>p-Nitrophenylphosphat Dinatriumsalzhexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Glycerophosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6376&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Reagenz&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006&nbsp;</td><td>zytotoxisch</td></tr><tr><td>Acrylamid/Bis-Acrylamid (37,5 : 1) 40%</td><td>Bioshop</td><td>ACR005&nbsp;</td><td>zytotoxisch</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Bioshop</td><td>DEO701</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl)</td><td>LabChem</td><td>LC15320-4&nbsp;</td><td>Arbeiten Sie unter Abzug. Giftig und reizend.</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Bioshop</td><td>SDS001.1&nbsp;</td><td>aufreizend.</td></tr><tr><td>Amoniumpersulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td>Giftig und reizend.</td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Fisher Scientific</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>Arbeiten unter dem Abzug. Giftig für das Nervensystem, die Schleimhäute. Kann giftig für die oberen Atemwege, die Augen und das Zentralnervensystem sein.</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.5</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Bioshop</td><td>SHY700&nbsp;</td><td>aufreizend.</td></tr><tr><td>Nitrozellulose-Membran (0,45 mm)</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure Gletscher</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.4</td><td>Arbeiten unter dem Abzug. Giftig, reizend und brennbar.</td></tr><tr><td>Roter Ponceau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3504&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911&nbsp;</td><td>Für PBS-Zusammensetzung für Immunoblot.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Bioshop</td><td>SPD307.5</td><td>Für die PBS-Zusammensetzung für Immunoblot.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662&nbsp;</td><td>Für PBS-Zusammensetzung für Immunoblot.</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Für PBS-T-BSA-Zusammensetzung für Immunoblot.</td></tr><tr><td>Fettfreie Trockenmilch</td><td>Carnation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (Tween)</td><td>MP Biomedicals</td><td>103168</td><td>Schneiden Sie das Ende der Spitze ab und pipetieren Sie langsam, da sie sehr dick ist.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser386</td><td>IBL-America</td><td>18783</td><td>Aliquotiert bei -20 oC. Frost/Auftauen vermeiden.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser396</td><td>Hausgemacht19</td><td></td><td>Lagern, aliquotiert bei -80 oC. Frost/Auftauen vermeiden.</td></tr><tr><td>Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4947s</td><td>Bei -20 oC lagern.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser398</td><td>Hausgemacht15</td><td></td><td>Lagern bei -80 oC. Frost/Auftauen vermeiden.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-Actif-Motiv in voller Länge</td><td></td><td>39033</td><td>Aliquotiert bei -80 oC lagern. Frost/Auftauen vermeiden.</td></tr><tr><td>Anti-IRF3-NES</td><td>IBL-America</td><td>18781</td><td>Store aliquotiert bei -20 oC.</td></tr><tr><td>Western Lightning Chemilumineszenz-Reagenz Plus</td><td>Perkin-Elmer Life Sciences</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>LAS4000mini CCD-Kameragerät</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Molekulargewichtsstandards, Breitenbereich</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0317</td><td>Aliquotiert bei -20 oC.</td></tr></tbody></table>

eine hohe auflösung methode zur phosphorylierung abhängige aktivierung von irf3 Überwachen

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

Der Transkriptionsfaktor IRF3 ist entscheidend für die erste Verteidigungslinie gegen Krankheitserreger, hauptsächlich durch Interferon-β und antivirale Genexpression. Eine detaillierte Analyse der IRF3-Aktivierung ist unerlässlich, um zu verstehen, wie Krankheitserreger die angeborene antivirale Reaktion auslösen oder umgehen. Unterschiedliche aktivierte Formen von IRF3 können anhand ihrer Phosphorylierung und ihres Monomer- vs. Dimerstatus unterschieden werden. In vivo kann eine Unterscheidung zwischen den verschiedenen aktivierten Spezies von IRF3 durch die Trennung von IRF3-phosphorylierten Formen anhand ihrer Mobilitätsverschiebungen auf SDS-PAGE erreicht werden. Zusätzlich können die Spiegel von IRF3-Monomer und -Dimer mittels nicht-denaturierender Elektrophorese überwacht werden. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um die höchste Auflösung zu erreichen und die meisten Informationen über den Aktivierungsstatus von IRF3 zu erhalten. Dies wird durch die Kombination einer hochauflösenden SDS-PAGE und einer nativen PAGE erreicht, die an Immunoblots unter Verwendung mehrerer Gesamt- und phosphospezifischer Antikörper gekoppelt ist. Diese experimentelle Strategie stellt einen kostengünstigen und sensitiven Ansatz dar, um alle notwendigen Informationen für eine vollständige Analyse der Phosphorylierungs-vermittelten Aktivierung von IRF3 zu erhalten.

Abbildung 2 zeigt ein typisches Bild der Immunoblot IRF3 mit IRF3 Gesamt Antikörper und IRF3-phosphospecific Antikörper gegen Ser396 und Ser398 nach der Auflösung des WCE durch hochauflösende SDS-PAGE nachgewiesen. In unstimulierten Zellen A549 wird IRF3 als zwei Banden bei 50 und 53 kDa in der SDS-PAGE entsprechend dem nicht-phosphoryliert (Form I) und der hypophosphorylierten (Form II) Spezies IRF3 detektiert. Exposition der Zellen A549 SEV für 3-9 Stunden ergibt eine ...

Hier beschreiben wir ein Verfahren, das eine detaillierte Analyse der phosphorylierungsabhängigen Aktivierung des IRF3-Transkriptionsfaktors ermöglicht. Dies wird durch die Kombination einer hochauflösenden SDS-PAGE und einer nativen PAGE erreicht, die mit Immunoblots unter Verwendung mehrerer phosphospezifischer Antikörper gekoppelt ist.

Eine hohe Auflösung Methode zur Phosphorylierung abhängige Aktivierung von IRF3 Überwachen

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine detaillierte Analyse der phosphorylierungsabhängigen Aktivierung des IRF3-Transkriptionsfaktors zu ermöglichen. Diese Methode kann also dazu beitragen, zentrale Fragen zur Interferon-vermittelten angeborenen Immunantwort zu beantworten. Zum Beispiel aktiviert ein Krankheitserreger die IRF3-abhängige Interferon-beta-Expression oder dringt in sie ein.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einen erschwinglichen und empfindlichen Ansatz darstellt, um die verschiedenen IRF3-aktivierten Formen zu unterscheiden, die nach verschiedenen Stimulationen auftreten können. Obwohl diese Methode Einblicke in die Virusinfektion menschlicher Zellen bietet, kann sie auch auf Maus- oder menschliche Gewebe angewendet werden, die anderen Krankheitserregern oder pathogenassoziierten molekularen Mustern ausgesetzt sind. Alexa Robitaille und Melissa Mariani, zwei Zell-Simulink-Expertinnen aus meinem Labor, werden das Verfahren vorführen.Die in diesem Verfahren verwendeten A549-Zellen werden in Kultur in einer 15-Zoll-Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in vollständigem F-12K-Schinkenmedium aufbewahrt. Vierundzwanzig Stunden vor der Infektion trypsinisieren Sie die Zellen wie im Protokolltext beschrieben und überführen die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Bei 350 x G drei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren.Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Küvettenpellet erneut in acht Millilitern vollständigem F-12K-Schinkenmedium, um eine homogene einzellige Suspension zu erhalten. Nach dem Zählen der Zellen mit einem Hämoktyometer werden die Zellen mit einer Dichte von einem mal Zehntel bis zu den sechsten Zellen pro 60-Millimeter-Platte und vier Millilitern vorgewärmtem vollständigem F-12K-Schinkenmedium ausgesät. Inkubieren Sie 20 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius, fünf Prozent Kohlendioxid.Nach 20 bis 24 Stunden sollten die Zellen eine 90%ige konfluente Monoschicht bilden. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit zwei Millilitern serumfreiem F-12K Ham Medium oder SFM. Fügen Sie zwei Milliliter frisches SFM pro 60-Millimeter-Platte hinzu.Verdünnen Sie das aufgetaute Aliquot des Sendai-Virus in vorgewärmtem SFM, um 60 Hämagglutinationseinheiten oder HAU pro 100 Mikroliter zu erhalten. Mischen Sie, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren und dann 100 Mikroliter verdünntes Virus Tropfen für Tropfen auf jede Platte geben, um die Infektion mit 40 HAU pro 10 auf die sechste Zelle durchzuführen. Geben Sie keine Viren in die nicht infizierte Kontrollplatte.Inkubieren Sie die Zellen im Inkubator bei 37 Grad Celsius, fünf Prozent Kohlendioxid. Rühren Sie die Platten in der ersten Stunde der Infektion drei- bis viermal mit der Hand um. Zwei Stunden nach der Infektion werden zwei Milliliter F-12K Schinkenmedium mit 20 % Hitze und aktiviertem FDS zugegeben, um eine Endkonzentration von 10 % Hitze und aktiviertem FDS zu erhalten.Inkubieren Sie die Zellen im Inkubator für eine, vier und sieben weitere Stunden, um eine Gesamtinfektionszeit von drei, sechs bzw. neun Stunden zu erreichen. Zu jedem dieser Zeitpunkte werden Zellen für die Herstellung von Ganzzellextrakten geerntet, wie im nächsten Videosegment gezeigt. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie das Infektionsmedium entfernen.Ernten Sie die Zellen, indem Sie einen Milliliter eiskaltes DPBS einkratzen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein vorgekühltes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 16.000 x g bei 4 Grad Celsius für 20 Sekunden pelletiert.Und dekantieren Sie sorgfältig alle Spuren von DPBS. Suspendieren Sie das Zellpellet erneut in 70 Mikrolitern Lysepuffer. 20 Minuten auf Eis inkubieren.Das Lysat wird durch Inkubation in einem Flüssigstickstoffbad 15 Sekunden lang schockgefroren. Tauen Sie dann das Lysat bei Raumtemperatur auf, bis es vollständig geschmolzen ist. Vortex für zehn Sekunden.Wiederholen Sie diesen Frost-Tau-Vortex-Zyklus dreimal. Zentrifugieren Sie bei 16.000 x g bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Übertragen Sie den Überstand, d. h. den gesamten Zellextrakt, in ein neues vorgekühltes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Es ist wichtig, die ganzen Zellextrakte immer auf Eis zu halten. Um die Ganzzellextrakte mit hochauflösender SDS-PAGE aufzulösen, bereiten Sie drei denaturierende Elektrophorese-Gele, zwei 16-Zentimeter-Gele für den Nachweis von IRF3-Formen und ein 8,5-Zentimeter-Gel für den Nachweis von Sendai-Virus-Proteinen vor. Laden Sie 14 Mikroliter Standardmolekulargewicht in eine Vertiefung jedes 16-Zentimeter-Gels.Laden Sie anschließend 30 Mikrogramm denaturierten Ganzzellextrakt pro Vertiefung der beiden 16-Zentimeter-Gele. Laden Sie sieben Mikroliter Standard-Molekulargewicht in eine Vertiefung des 8,5 Zentimeter großen Gels. Laden Sie acht bis zehn Mikrogramm denaturierten Ganzzellextrakt pro Vertiefung des 8,5 Zentimeter großen Gels.Lassen Sie die Gele bei 30 Milliampere konstantem Strom laufen, bis die Migrationsfront den Boden des Gels erreicht. Die Migration dauert technisch gesehen etwa drei Stunden für ein 16-Zentimeter-Gel und 45 Minuten für ein 8,5-Zentimeter-Gel. Beginnen Sie diese Analyse, indem Sie ein nicht denaturierendes, auflösendes Gel mit einer Länge von mindestens 8,5 Zentimetern herstellen, indem Sie dem Verfahren im Protokolltext folgen.Drücken Sie das Laufgerät etwa bis zur Höhe des Elektrophoresepuffers der unteren Kammer in Eis, aber stellen Sie sicher, dass sich das Gel nicht im Eis befindet. Lassen Sie das Gel bei 40 Milliampere konstantem Strom 30 Minuten lang auf Eis laufen. Mischen Sie während des Vorlaufs die auf Eis aufbewahrten Ganzzellextrakte eins zu eins mit Two-X Native-PAGE Ladepuffer.Unmittelbar am Ende des Vorlaufs laden Sie acht bis zehn Mikrogramm Ganzzellextrakt auf das Gel. Es ist wichtig, die Proben nahe am Boden der Vertiefung zu laden, damit die Streifenbildung nicht gestört wird. Lassen Sie das Gel bei 25 Milliampere konstantem Strom auf Eis laufen, wie für den Vorlauf gezeigt, bis die Migrationsfront den Boden des Gels erreicht.Dies dauert ca. 40 Minuten. Nach Abschluss aller Gelläufe werden die Proteine auf Nitrozellulosemembranen übertragen und fixiert. Der Ablauf der Übertragung ist im begleitenden Protokolltext beschrieben.Die drei SDS-PAGE-Membranen, nicht aber die Native-PAGE-Membran, werden mit roter Ponceau-Lösung gefärbt, um die Molekulargewichtsmarker zu identifizieren. Nachdem Sie alle vier Membranen aus SDS-PAGE und Native-PAGE in Blockierungslösung inkubiert haben, inkubieren Sie die Membranen mit den Primärantikörpern in der in diesem Diagramm gezeigten sequenziellen Reihenfolge. Die Membranen müssen vor der Inkubation mit den entsprechenden Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern fünf fünfminütige Waschungen in PBS-T unterzogen werden.Nach der Entfernung von Spuren von Tween mit PBS inkubieren Sie die Membranen eine Minute lang in dem Volumen des verstärkten Chemilumineszenzreagenzes, das ausreicht, um die Membranen vollständig zu bedecken. Verwenden Sie Filterpapier, um die Membranen zu trocknen, und legen Sie sie dann in den lumineszierenden Bildanalysator, um die immunreaktiven Banden sichtbar zu machen. Vor der Inkubation mit den nächsten Primärantikörpern waschen Sie die Membranen dreimal jeweils fünf Minuten lang in PBS.Wenn ein Stripping zwischen Antikörpern erforderlich ist, inkubieren Sie die Membranen in vorgewärmter Stripping-Lösung bei 50 Grad Celsius für 20 Minuten unter regelmäßigem Rühren. Details zur Immunoblot-Analyse finden Sie im begleitenden Protokolltext. Hier ist ein typisches Immunoblot-Bild von IRF3 zu sehen, das mit IRF3-Gesamtantikörpern und IRF3-Phosphospezifischen Antikörpern gegen Ser396 und Ser398 nachgewiesen wurde, nachdem Ganzzellextrakte mit hoher Auflösung aufgenommen wurden.In nicht stimulierten Zellen wird IRF3 in zwei Banden nachgewiesen, die der nicht-phosphorylierten und der hypophosphorylierten Spezies von IRF3 entsprechen. Die Exposition der Zellen gegenüber dem Sendai-Virus führt zu einer zeitabhängigen Verschiebung zu langsam migrierenden hyperphosphorylierten Formen drei und vier, die mit den phosphospezifischen Antikörpern gegen Ser396 und Ser398 ebenfalls spezifisch immundetektiert werden. Die nächste Abbildung zeigt ein Profil des IRF3-Nachweises, der aus Ganzzellextrakten gewonnen wurde, die durch natives PAGE aufgelöst wurden, gefolgt von Immunoblot mit Anti-IRF3-NES-Antikörpern und phosphospezifischen Antikörpern gegen Ser386.In unstimulierten Zellen wird IRF3 als einzelne Bande nachgewiesen, die der momeren Form entspricht. Nach einer Infektion mit dem Sendai-Virus nehmen die Spiegel des IRF3-Monomers ab, wobei gleichzeitig eine langsam wandernde Bande akkumuliert wird, die der dimeren Form von IRF3 entspricht, die auch mit phosphospezifischen Antikörpern gegen Ser386 spezifisch immundetektiert wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Zusammensetzung und Länge der verschiedenen Gele entscheidend ist, um eine angemessene Auflösung der IRF3-Phosphoformen zu erreichen.Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie DNA-Bindung oder Genreportersäuren, durchgeführt werden, um die IRF3-Aktivität zu beurteilen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die verschiedenen aktiven Formen von IRF3 unterscheiden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Krankheitserregern gefährlich sein kann und Manipulationen in Übereinstimmung mit den Biosicherheitsrichtlinien Ihrer Gastinstitution durchgeführt werden sollten.

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Forschung

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Biology

Biologie

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