Ein Magnet Microbead Occlusion Modell Ocular Hypertension Abhängige Glaucoma in Mäusen zu induzieren

Das übergeordnete Ziel dieses chirurgischen Eingriffs besteht darin, eine okulärer Hypertension-abhängige Glaukomerkrankung durch Injektion magnetischer Mikroperlen in die vordere Augenkammer des Mausauges hervorzurufen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Glaukoms zu beantworten, beispielsweise welche frühen pathologischen Veränderungen im Auge auftreten, bevor ein offensichtlicher Untergang der retinalen Ganglienzellen eintritt. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass der interokulare Druck zuverlässig erhöht werden kann, wodurch während des Eingriffs eine minimale Schädigung des Auges verursacht wird.

Menschen, die neu in dieser Methode sind, werden Schwierigkeiten haben, die Hornhaut während der Injektion zu punktieren, und benachbarte Strukturen wie die Linse aufgrund einer unsachgemäß präparierten Mikronadel oder einer falschen Positionierung der Mikronadel beschädigen. Beginnen Sie damit, mit einem Kapillarzieher eine Mikronadel aus einer Bohr-Silikatglas-Kapillare zu ziehen. Verwenden Sie unter einem Mikroskop eine scharfe Klinge, um sorgfältig eine Öffnung an der Spitze der Mikronadel zu erzeugen, sodass die Spitze eine elliptische Form mit einem größeren und einem kleineren Achsendurchmesser von etwa 190 Mikrometern bzw. 70 Mikrometern aufweist.

Platzieren Sie im Mikropipetten-Anschleifsystem die Mikronadel in einem Winkel von 20 Grad relativ zur Schleifplatte, sodass die Öffnung der Mikronadel die Platte berührt. Schleifen Sie etwa 10 Minuten lang unter Zugabe von Wassertropfen, bis die Kanten flach und glatt sind. Drehen Sie anschließend die Nadel, um die beiden Kanten um die Öffnung herum abzuschleifen, bis die Spitze der Mikronadel scharf ist.

Anschließend säubern Sie mit einem Aerosol-Reiniger alle Rückstände und Wasser von der Öffnung der Mikronadelspitze. Untersuchen Sie die fertige Mikronadel sorgfältig unter einem Mikroskop. Verwerfen Sie Mikronadeln mit Rissen.

Das folgende Verfahren erfordert zwei Personen zur Durchführung. Wenn eine bestimmte Maßnahme von einer spezifischen Person durchgeführt werden soll, wird die jeweilige Person als „Person 1“ oder „Person 2“ angegeben. Bereiten Sie die magnetische Mikroperlen-Lösung gemäß dem Textprotokoll vor. Um den Basis-Innendruck des Auges, oder IOP, bei einem wachen Maus zu messen, halten Sie die Maus vorsichtig fest, indem Sie die Haut zwischen den Ohren greifen.

Stellen Sie die Maus auf die Labortischplatte, sodass das Tier bequem liegt und die Augen gut zugänglich sind. Geben Sie einen Tropfen Proparakainhydrochlorid auf die Hornhaut, halten Sie dann das Tonometer senkrecht zur Hornhautoberfläche und nehmen Sie mindestens drei Serien mit jeweils 10 aufeinanderfolgenden Messwerten pro Auge vor, um einen mittleren Augeninnendruck (IOP) zu erhalten. Danach verabreichen Sie, nachdem die Maus gemäß dem schriftlichen Protokoll anästhesiert wurde, 0,05 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht Buprenorphin subkutan.

Behandeln Sie das Auge anschließend mit einem Tropfen Tropikamid, um eine Pupillenerweiterung zu bewirken, die die Sichtbarmachung der Positionierung der Mikronadel während der Injektion erleichtert. Tragen Sie eine topische Salbe auf das kontralaterale Auge auf, um eine Austrocknung der Hornhaut während des Eingriffs zu verhindern. Befestigen Sie nun eine sterile Mikronadel an der Injektionsvorrichtung der Mikrospritzpumpe.

Überführen Sie dann die anästhetisierte Maus auf die Operationsplattform. Unter dem Mikroskop stellt Person 1 sicher, dass die Pupille vollständig erweitert ist und die okularen Muskeln entspannt sind, sodass keine Augenbewegungen erfolgen, um die Stabilität während des Eingriffs zu gewährleisten. Mit saugfähigen Tupfern wird tropicamidhaltiger Augentropfen vorsichtig vom Auge abgewischt.

Person 2 soll die magnetische Mikroperlen-Lösung durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mischen. Anschließend wird mit Hilfe der Mikrospritzpumpe die Mikronadel mit 1,5 µL der homogenisierten magnetischen Mikroperlen-Lösung gefüllt. Dabei sicherstellen, dass sich keine Luftblasen an der Spitze der Mikronadel befinden.

Positionieren Sie die Nadel so schnell wie möglich in einem Winkel von 45 Grad anterior relativ zum Limbus. Person 1 soll die Augen mit der Plastikpinzette stützen und dabei einen Winkel von etwa 90 Grad zwischen der Mikronadel und der Plastikpinzette halten. Mit Hilfe der Mikrospritzpumpe sticht Person 2 vorsichtig mit der beladenen Mikronadel in die Hornhaut, sodass die Spitze der Mikronadel in die vordere Augenkammer eindringt, wobei Linse, Iris und hintere Augenkammer vermieden werden.

Ohne den Mauskopf zu bewegen, platziere Person 1 den Magneten neben dem Auge, das der Nadelspitze gegenüberliegt, um die magnetischen Mikroperlen in die vordere Augenkammer zu ziehen und den Kontakt der Perlen mit der inneren Oberfläche der Hornhaut zu minimieren. Während Person 1 den Magneten weiterhin festhält, injiziert Person 2 mithilfe der Mikrospritzenpumpe über einen Zeitraum von 15 bis 30 Sekunden 1,5 µL der magnetischen Perlenlösung in die vordere Augenkammer.

Nachdem das gesamte Volumen der Kügelchen injiziert wurde, ziehen Sie die Mikronadel langsam aus dem Auge heraus. Um einen Rückfluss der Mikrokügelchen zu vermeiden, hält Person 1 den Magneten weitere 30 bis 60 Sekunden lang neben das Auge, um die Kügelchen in die vordere Augenkammer zu ziehen. Anschließend verwenden Sie den Magneten, um die Kügelchen zum Irido-Corneal-Winkel zu lenken, wobei darauf geachtet werden muss, dass die Kügelchen nicht an die innere Oberfläche der Hornhaut gelangen, wo sie haften könnten.

Stellen Sie sicher, dass die Kügelchen einen gleichmäßig verteilten Ring entlang des Umfangs der vorderen Augenkammer bilden. Danach behandeln Sie das operierte Auge mit einem antibiotischen Augentropfen, um das Infektionsrisiko zu minimieren. Lassen Sie die Maus auf einer Wärmeunterlage ausreichend aus der Narkose aufwachen, wobei das operierte Auge nach oben zeigt, um Infektionen und eine Ansammlung der Kügelchen an der inneren Hornhautoberfläche zu verhindern.

Nach mindestens zwei Tagen Erholungszeit messen Sie den IOP, wie zuvor im Video gezeigt, und überwachen Sie diesen mindestens einmal pro Woche oder bei Bedarf häufiger, jeweils zur gleichen Tageszeit. Analysieren Sie die Ergebnisse gemäß dem schriftlichen Protokoll. Die Injektion magnetischer Mikroperlen in die vordere Augenkammer erwachsener Mäuse, wie in diesem Protokoll beschrieben, führte zu einer deutlichen und reproduzierbaren Erhöhung des IOP.

Wie hier zu sehen ist, stieg der Augeninnendruck eine Woche nach dem Eingriff von einem durchschnittlichen Ausgangswert von 10 ± 0,6 mmHg auf 19 ± 0,5 mmHg in hypertensiven Augen an. Diese Tabelle zeigt, dass sich der Augeninnendruck danach stabilisierte und über mindestens sechs Wochen, dem längsten in dieser Studie untersuchten Zeitpunkt, mit durchschnittlich 20 mmHg erhöht blieb. Der durchschnittliche maximale Augeninnendruck in den mit Mikroperlen injizierten Augen betrug zwei, drei und sechs Wochen nach der Operation jeweils 25 mmHg.

Um den Verlust von retinalen Ganglienzellen (RGC) zu beurteilen, wurde die Anzahl BRN-3A-positiver Zellen auf flachen Präparaten der Netzhäute ein, zwei, drei und sechs Wochen nach der Induktion einer okularen Hypertension quantifiziert. Obwohl eine signifikante Erhöhung des Augeninnendrucks (IOP) bereits nach einer Woche nachgewiesen wurde, wurde innerhalb der ersten zwei Wochen kein signifikanter Verlust von RGC-Somen beobachtet. Dagegen wurde drei und sechs Wochen nach der Operation ein signifikanter Zelltod festgestellt.

In dieser Abbildung zeigen toluidinblau-gefärbte Querschnitte des Sehnervs einen erheblichen Verlust von RGC-Axonen nach drei und sechs Wochen im Vergleich zu intakten Sehnerven, was darauf hinweist, dass diese Operation zu einem axonalen Verlust führt, wie er bei Glaukom beobachtet wird. Wenn der Vorgang einmal beherrscht ist, kann die Injektion bei einer Maus innerhalb von 15 Minuten durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, geeignete Maßnahmen zu ergreifen, um sicherzustellen, dass die gleiche Anzahl von Mikroperlen in die vordere Augenkammer injiziert wird.

Dies wird die Variation verringern, die zwischen den Tieren auftreten kann. Nach dem Anschauen des Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine okulare Hypertonie erzeugt, indem magnetische Mikroperlen in die vordere Augenkammer der Mausaugen injiziert werden.