Eine quantitative Glycomics und Proteomics Kombinierte Reinigungsstrategie

Das übergeordnete Ziel dieses auf einem einzigen Filter basierenden Workflows ist es, N-Glykane und Proteine aus biologischen Proben aus der Massenspektrometrie einfach und quantitativ zu reinigen. Die Skalierbarkeit, Geschwindigkeit und analytische Reproduzierbarkeit dieser Methode macht sie in Bezug auf Ressourcen und Fähigkeiten für biologische Massenspektrometrie-Labore direkt zugänglich. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es Forschern ermöglicht, Glykomics, Glykosylierungsstellenbelegung und Proteomik-Fragen gleichzeitig in groß angelegten biologischen Hochdurchsatzstudien zu untersuchen.

Wir haben die Herausforderungen der N-Glykan-Messung überwunden, indem wir diese Methode mit einer massenspektrometrisch zugeschnittenen Ableitungsstrategie gekoppelt haben, die zu einer genauen, relativen Quantifizierung zwischen Krebs- und Kontrollzuständen führt. Mit reduzierter analytischer Variabilität können neue biologische Wechselwirkungen zwischen dem Glycome und dem Proteom aufgeklärt werden, was wichtige Einblicke in Krankheitszustände und neue Möglichkeiten für die Entdeckung von Biomarkern liefert. Laden Sie zunächst 2,5 Mikroliter Plasma auf einen Filter.

Geben Sie dann 2 Mikroliter 1M Dithiothreitollösung zu jeder Probe im Filter. Verdünnen Sie die Probe mit 200 Mikrolitern 100-mM Ammoniumbicarbonat-PNGAase-Aufschlusspuffer. Verschließen Sie das Filterprobenrohr und wirbeln Sie es leicht ein, wobei Sie darauf achten müssen, den Filter nicht von seinem Sitz zu stören.

Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei 56 Grad Celsius, um die Proteine und Glykoproteine zu denaturieren. Um die Proben zu alkilatieren, fügen Sie 50 Mikroliter 1M Iodacetamid hinzu, um eine Endkonzentration von etwa 200 mM zu erhalten. Dann 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Konzentrieren Sie das denaturierte Glykoprotein auf den Filter, indem Sie die Proben 40 Minuten lang bei 14.000 x g zentrifugieren, bevor Sie den Durchfluss verwerfen. Waschen Sie die Probe mit 100 Mikrolitern PNGase-Aufschlusspuffer. Konzentrieren Sie das Glykoprotein auf den Filter und verwerfen Sie den Durchfluss.

Wiederholen Sie den Wasch- und Konzentratschritt zweimal, insgesamt dreimal, bis ein Konzentrat im Totvolumen des Filters entsteht. Entsorgen Sie den gesamten Durchfluss und das Auffangfläschchen, sobald die Waschvorgänge abgeschlossen sind. Geben Sie dann 2 Mikroliter des glycerinfreien Peptids N-Glykosidase F oder PNGase F in den Filter, nachdem Sie es in ein frisches Auffangfläschchen umgefüllt haben.

Fügen Sie 98 Mikroliter PNGase-Aufschlusspuffer hinzu, um das Gesamtvolumen auf 100 Mikroliter zu erhöhen, und pipettieren Sie vorsichtig auf dem Filter auf und ab, um zu mischen. Für den Anstieg des Aufschlussprotokolls inkubieren Sie die Proben 2 Stunden lang bei 50 Grad Celsius. Entnehmen Sie die Proben schnell und geben Sie weitere 2 Mikroliter glycerinfreies PNGase F hinzu. Werfen Sie die Proben 1 bis 2 Sekunden lang leicht in die Flüssigkeit, um sie zu mischen.

Inkubieren Sie die Proben bei 50 Grad Celsius für weitere 2 Stunden. Nachdem Sie die Glykane durch Zentrifugieren der Probe bei 20 Grad Celsius entgangen haben, geben Sie 100 Mikroliter PNGase-Aufschlusspuffer in den Filter und zentrifugieren Sie erneut. Sammeln Sie die Waschung, die das verbleibende N-verknüpfte Glykan enthält, in derselben Durchstechflasche wie das Eluent

Entfernen Sie nach zweimaligem Wiederholen den Filter und setzen Sie ihn in ein neues Auffangfläschchen für die Proteomik-Vorbereitung ein. Inkubieren Sie anschließend die Glykanproben 30 bis 60 Minuten lang im 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank, bis sie eingefroren sind. Anschließend 4 bis 6 Stunden bei Raumtemperatur in einem Vakuumkonzentrator trocknen.

Spülen Sie den Filter mit den deanimierten Peptiden mit 400 Mikrolitern 8M Harnstoffpuffer. Verschließen Sie das Sammelfläschchen und sprühen Sie es leicht vor sich hin, um es zu mischen. Konzentrieren Sie die Peptide auf dem Filter, bevor Sie den gesamten Durchfluss verwerfen.

Nachdem Sie die Harnstoffpufferwäsche noch zweimal wiederholt haben, spülen Sie den Filter mit den deanimierten Peptiden mit Trypsin-Aufschlusspuffer. Verschließen Sie das Auffangfläschchen und sprühen Sie es leicht durch, um es zu mischen, bevor Sie sich wieder wie zuvor auf den Filter konzentrieren. Verwerfen Sie den gesamten Durchfluss und wiederholen Sie den Vorgang 2 weitere Male für insgesamt 3 Trypsin-Aufschlusspuffer-Waschungen.

Sammeln Sie alle zukünftigen Eluenten und Waschungen in einem neuen Sammelfläschchen. Fügen Sie dann 50 Mikroliter porzinmodifiziertes Trypsin in einem Trypsin-Protein-Verhältnis von 1:50 für die Proteomik oder einem Trypsin-Protein-Verhältnis von 1:5 für quantitative Proteomik-Experimente hinzu. Verschließen Sie das Sammelfläschchen und sprühen Sie es leicht vor sich hin, um es zu mischen.

Nachdem Sie die Proben 2 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, entnehmen Sie die Proben schnell und fügen Sie weitere 50 Mikroliter Trypsin im entsprechenden Trypsin-Protein-Verhältnis hinzu. Drehen Sie die Proben 1 bis 2 Sekunden lang leicht, um sie zu mischen. Dann weitere 2 Stunden bei 50 Grad Celsius inkubieren.

Nach der Elution der Peptide durch Zentrifugieren wie zuvor für 20 Minuten spülen Sie die restlichen Peptide mit Quench-Puffer aus dem Filter. Den Filter durch Zentrifugieren wie zuvor 15 Minuten lang abschalten. Nachdem Sie die Peptidkonzentration in den Proben quantifiziert haben, inkubieren Sie die Peptidproben im 80 Grad Celsius Gefrierschrank, bis sie eingefroren sind.

Anschließend 4 bis 6 Stunden bei Raumtemperatur in einem Vakuumkonzentrator trocknen. Dann werden die tryptischen Proteine kurz vor der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie oder LCMS-Analyse in der mobilen Phase A auf die gewünschte Konzentration eingestellt. Tryptische Peptidkonzentrationen ab 2,5 Mikrolitern Plasma liegen zwischen 100 und 300 Nanogramm pro Mikroliter.

Vor der Glykananalyse werden die getrockneten stabilen Isotope, die als 4-Phenethylbenzohydrazid-Reagenzien markiert sind, sowie die nativen P2GPN-Reagenzien in einem Milliliter Ableitungslösung für eine Endkonzentration von 0,25 Milligramm pro Milliliter rekonstituiert. Es dauert bis zu 10 Minuten, bis die Reagenzien vollständig löslich sind. Großflächig vortexen, um eine vollständige Solubilisierung zu gewährleisten.

Markieren Sie die getrockneten N-Glykane mit 200 Mikrolitern stabilisotopenmarkiertem oder nativem P2GPN-Reagenz. Pipettieren Sie auf und ab, um die getrockneten Glykane wieder zu suspendieren. Drehen Sie dann die Proben vor und drehen Sie sie etwa 5 Sekunden lang auf einer Tischzentrifuge.

Reagieren Sie die Glykane 3 Stunden lang bei 56 Grad Celsius mit dem Reagenz. Übertragen Sie die Glykane sofort aus dem Inkubator in den Vakuumkonzentrator und trocknen Sie sie 3 bis 5 Stunden lang bei 55 Grad Celsius. Suspendieren Sie das markierte N-Glykan in 25 bis 50 Mikrolitern Wasser kurz vor der Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie

Pipettieren Sie auf und ab, um sicherzustellen, dass die N-Glykane vollständig löslich sind. Nachdem Sie die Proben wie zuvor 5 Minuten lang zentrifugiert haben, entfernen Sie den Überstand und achten Sie darauf, dass die Spitze der Pipette nicht den Boden des Zentrifugenröhrchens berührt. Kombinieren Sie ein Paar nativer und stabiler Isotopen-markierter Proben in einem Verhältnis von 1:1 für die Tandemanalyse zur relativen Quantifizierung.

Bereiten Sie 2 verschiedene LCMS-Methoden für die Proteomik- und Glykomik-Workflows vor. Für die Proteinanalyse injizieren Sie etwa 400 Nanogramm Protein auf die Säule in NPA. Führen Sie die Probe mit 300 Nanolitern pro Minute durch, mit einer 1-Mikroliter-Vorsäulenäquilibrierung und einer 5 Mikroliter analytischen Säulenäquilibrierung.

Ionisieren Sie die Proteine unter den im Textprotokoll angegebenen MS-Bedingungen. Für die Glykananalyse injizieren Sie 5 Mikroliter resuspendierte, mit P2GPN markierte native und mit stabilen Isotopen markierte Equi-M-Proben auf die Säule. Führen Sie die Probe bei 300 Nanolitern pro Minute mit einer 2-Mikroliter-Vorsäulenäquilibrierung und einer analytischen Säulenäquilibrierung von 5 Mikrolitern durch.

Ionisieren Sie dann die Glykane unter den MS-Bedingungen, die im Textprotokoll angegeben sind. Das filterbasierte Aufreinigungsprotokoll wurde mit der Standard-Festphasenextraktionsmethode verglichen, und die Häufigkeiten der zwischen den beiden Protokollen nachgewiesenen Plasmaglykane unterschieden sich nicht signifikant. Bei beiden Methoden wurden die gleichen Glykane in der Nähe der Nachweisgrenze gefunden, wo die Variabilität zunimmt.

Die Intervariabilität für equiM-Mischungen von Plasma, das mit dem filterbasierten oder dem Standard-Festphasenextraktionsprotokoll gereinigt wurde, wurde bewertet. Beide Protokolle hatten Gaußsche Verteilungen, deren Mittelwerte sich nicht signifikant von Null unterschieden. 80 Prozent der Glykane fielen innerhalb einer zweifachen Veränderung.

Die Molekulargewichtsverteilungen der Glykane, die in den neuen und traditionellen Reinigungsprotokollen nachgewiesen wurden, unterschieden sich nicht signifikant und deckten den gleichen Bereich ab. Qualitativ wurde keine Verzerrung zwischen den Glykanen beobachtet. Die Plasmaproteine wurden durch standardmäßige filtergestützte Probenvorbereitung und mehrere Inline-Protokolle präpariert.

Die Anzahl der identifizierten Proteine war für die verschiedenen Protokolle ähnlich. Die unspezifische Deamidierung wurde in Mikrowellenaufschluss- und Spike-Indigestion-Protokollen auf weniger als 10 Prozent kontrolliert. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass eine genaue Belegung der Glykosylierungsstelle von der Minimierung der Wärme- und Zeiteinwirkung abhängt.

Einmal gemeistert, kann die Inline-Pecuriken-N-Glykan-Reinigung in 2 Tagen abgeschlossen werden. Durch dieses Verfahren können eine genaue Quantifizierung des Protein-N-Glykans und die Belegung der Glykosylierungsstelle integriert und mit statistischen Techniken höherer Ordnung modelliert werden. Diese Technik ermöglicht es, die komplexe Sprache der Krebsbiologie schnell nachzulesen, Unterschiede in Proteintherapeutika quantitativ zu vergleichen und die Bedeutung der Glykosylierung in einem biologischen Kontext wirklich aufzuzeigen.