Isolierung, Charakterisierung und funktionelle Untersuchung des Zahnfleisch Immune Cell Network

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, gingivale Immunzellen zu isolieren, um die Immunantworten im Zusammenhang mit oraler Immunität und Parodontitis detailliert zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der oralen Immunität zu beantworten, z. B. welche zellulären Faktoren an der Pathogenese der Parodontitis beteiligt sind. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie die Bewertung des oralen Immunzellnetzwerks und die Isolierung von genügend lebensfähigen Zellen für nachgelagerte In-vitro-Untersuchungen ermöglicht.

Beginnen Sie als ersten Schritt dieses Protokolls mit dem Platzieren von Stecknadeln, um den Körper der Maus zu immobilisieren und die Brust- und Bauchhöhle zu öffnen, um das Herz und die inneren Organe freizulegen. Machen Sie als Nächstes einen Schnitt in der Hohlvene und verwenden Sie eine 3-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um 3 Milliliter PBS über den linken Ventrikel zu verabreichen. Wenn das gesamte Blut gespült wurde, stecken Sie den Kopf der Maus mit dem Bauch nach oben auf ein Präparierpad.

Schneiden Sie dann mit einer Schere jede Kommissur der Lippe in Richtung Hals ab, trennen Sie die Haut, die den Unterkiefer und den Halsbereich bedeckt, und legen Sie das darunter liegende Gewebe und die Muskeln frei. Schneiden Sie zwischen den unteren Schneidezähnen, um beide Seiten des Unterkiefers zu trennen. Immobilisieren Sie jede Seite des getrennten Unterkiefers mit 25-Gauge-Nadeln, um Zugang zur Mundhöhle zu erhalten.

Nachdem Sie den Gaumen identifiziert haben, verwenden Sie eine chirurgische Klinge mit der Nummer 10, um vertikale Schnitte direkt vor dem ersten Backenzahn und hinter dem dritten Backenzahn vorzunehmen. Präparieren Sie dann das Gewebe von der Nasenhöhle weg und präparieren Sie auch die Blöcke vom Unterkiefer. Entfernen Sie dann das überschüssige Gewebe vom Rand der Gingiva und übertragen Sie die Oberkiefer- und Unterkieferblöcke in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 5 Millilitern Kollagenase und DNase auf Eis.

Verdauen Sie das Gewebe in einem Shaker-Inkubator bei 37 Grad Celsius für eine Stunde und fügen Sie in den letzten fünf Minuten 50 Mikroliter 0,5 molare EDTA hinzu. Geben Sie dann 5 Milliliter kaltes DNase-Medium in das Gewebe und mischen Sie den Röhrcheninhalt vorsichtig durch Schwenken. Übertragen Sie dann die vier Gewebeblöcke in eine Petrischale.

Und bedecken Sie sie mit 500 Mikrolitern frischem DNase-Medium. Verwenden Sie ein Skalpell, um das Zahnfleisch aus jedem Gewebeblock zu entfernen. Und geben Sie den gesamten Inhalt der Schale in ein 70-Mikron-Zellsieb auf einem 50-Milliliter-Röhrchen.

Waschen Sie die Petrischale und das Sieb mit 3 bis 5 Millilitern frischem DNase Medium. Und dann verwenden Sie den Kolben einer sterilen 3-Milliliter-Spritze, um das Zahnfleischgewebe gegen das Netz des Siebs zu drücken. Spülen Sie das Sieb mit 30 bis 35 Millimetern kaltem DNase-Medium und zentrifugieren Sie das Filtrat.

Dann resuspendieren Sie den Gaumen in 1 Milliliter vollständigem Medium und bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen. Die Isolierung und Aufbereitung von Immunzellen, wie gerade gezeigt, ergibt eine ausreichende Anzahl von Zellen, um eine ex-vivo-Stimulation und Charakterisierung der Zytokinsekretionsmuster von Zahnfleischzellen sowohl von Wildtyp- als auch von Parodontitis-anfälligen Tieren durchzuführen. Tatsächlich kann die Zusammensetzung der gingivalen Immunzellen der Maus analysiert werden, wie in diesen Dichtediagrammen gezeigt wird, die die t- und natürlichen Killerzellkompartimente in Parodontitis-anfälligen LFA-Knockout-Mäusen bewerten.

Mit Hilfe der entsprechenden Gating-Strategien kann auch die intrazelluläre Zytokinproduktion von TCR-beta-CD4-positiven, TCR-beta-CD8-positiven und TCR-gamma-Delta-positiven T-Zellen sowie von NK und angeborenen lymphatischen Zellen bestimmt werden. Einmal gemeistert, können die Zellen in drei Stunden für die Immunfärbung isoliert werden, wenn die Technik richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Schritte effizient und schnell auszuführen und die Zellen auf Eis zu halten, wenn sie nicht manipuliert werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Zellsortierung, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Funktion der spezifischen Zelluntergruppen zu beantworten.