Standards für die quantitative Metalloproteomic Analyse mit Größenausschluss-ICP-MS

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, verschiedene Metalloproteine in komplexen Standards auf der Grundlage der Verwendung bekannter Metalloproteinstandards quantifizieren zu können. Diese Methode kann wichtige Fragen zur Rolle von Metallen in der Biologie beantworten. Wie verändert sich zum Beispiel der Metallstatus eines Proteins bei einer Krankheit?

Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie den Metallstatus eines Proteins in seinem nativen Zustand messen können. Die Technik wird von Amber Lothian, einer Doktorandin aus meinem Labor, vorgeführt. Zu Beginn werden Gewebe- oder Zellkulturproben durch manuelles Absenken oder Beschallung für fünf Minuten mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung homogenisiert.

Homogenate werden durch Zentrifugation bei 16.000 G fünf Minuten lang geklärt. Nach dem Sammeln des resultierenden Überstands normalisieren Sie die Gesamtproteinmenge, indem Sie die Proteinkonzentrationen bestimmen, wie im Textprotokoll beschrieben. Erwärmen und optimieren Sie den Maspektrometor mit induktiv gekoppeltem Plasma unter Verwendung der Protokolle des Herstellers.

Verdünnen Sie die Metalloprotein-Standards, um den Abfall im Bereich von null bis 500 Mikrogramm pro Liter mit einem Prozent Salpetersäure zu genießen. Um Standards innerhalb dieses Bereichs zu erreichen, verwenden Sie keine Verdünnungen über eins und 20. Legen Sie die Reihenfolge der Injektionen fest, indem Sie zunächst die sieben Kalibrierungsstufen analysieren.

Konzentrationen von null bis 500 Mikrogramm pro Liter, gefolgt von den Metalloprotein-Standards. Die sieben Kalibrierstufen sind null, eins, fünf, zehn, 50, 100 und 500 Mikrogramm pro Liter. Wählen Sie als Nächstes interessante Elemente aus.

Verwenden Sie hier Eisen, Kupfer, Zink, Kobalt und Jod. Denn sie sind die Elemente, an die die Proteinstandards gebunden sind. Wählen Sie die Elemente in der Erfassungsmethode aus, indem Sie die Registerkarte Elementauswahl öffnen und die Elemente und ihre jeweiligen Isotopenmassen hinzufügen, die analysiert werden sollen.

Führen Sie dann eine Probenanalyse mit dem Gerät durch. Die Gerätesoftware erstellt automatisch die Kalibrierkurven für jedes der zu analysierenden Elemente. Verwenden Sie die Kalibrierkurven, um die Metallkonzentration in den unbekannten Proben zu bestimmen.

Generieren Sie aus den Ergebnissen der Bulk-Analyse die Metalloprotein-Standards, die die drei am häufigsten vorkommenden Spurenelemente in Säugetiergeweben enthalten, indem Sie eine Mischung aus Kupfer, Zink-Superoxid-Dismutase und Ferritin verwenden. Spülen Sie die hyperformance Schnellchromatographie- oder HPLC-Pumpen fünf Minuten lang mit 200 millimolaren Ammoniumnitratpuffer bei einer Durchflussrate von fünf Millilitern pro Minute. Sobald das System gespült ist, stellen Sie die Durchflussmenge auf null Punkt eins Milliliter pro Minute ein.

Und verbinden Sie die Ausschlussspalte der Seite. Verbinden Sie das gegenüberliegende Ende der Säule mit dem UV-Detektor und stellen Sie die Messabsorption mit einem Peak-Schlauch auf 280 Nanometer ein. Erhöhen Sie die Durchflussrate der Säule schrittweise in Schritten von null Punkt eins Milliliter pro Minute, bis eine endgültige Durchflussrate von null Punkt vier Milliliter pro Minute erreicht ist.

Überprüfen Sie dabei die Schlauchverbindungen zur Säule auf Undichtigkeiten. Überwachen Sie den Druck dieses Systems, um sicherzustellen, dass er die Anforderungen an die Säule nicht überschreitet, indem Sie die Druckspur auf dem Chromatogramm in der Software beobachten. Lassen Sie die Säule bei der erforderlichen Durchflussrate über fünf bis 10 Säulenvolumina äquilibrieren.

Schließen Sie nach der Äquilibrierung die Instrumente an, um die Probenanalyse zu ermöglichen. Richten Sie die HPLC-Methode so ein, dass Puffer A 15 Minuten lang bei null Punkt vier Milliliter pro Minute über die Säule gepumpt wird. Versetzen Sie das ICPMS in den Standby-Modus, bevor Sie die Hardwareeinstellungen ändern.

Sobald Sie sich im Standby-Modus befinden, schalten Sie die Kommunikation für den Auto-Sampler aus und ändern Sie die Sample-Einleitung durch andere. Verwenden Sie PEEK-Schläuche, um den Ausfluss aus dem UV-Detektor direkt mit dem Vernebler am ICPMS zu verbinden. Schalten Sie das ICPMS ein und lassen Sie das Gerät 10 bis 20 Minuten lang aufwärmen.

Nachdem das Plasma gezündet hat, schließen Sie das Remote-Kabel vom ICPMS an die Rückseite des HPLC-Autosamplers an. Tun Sie dies, sobald sich das Plasma entzündet hat. Andernfalls wird das HPLC-System automatisch heruntergefahren, da das ICPMS nicht eingeschaltet ist.

Ändern Sie die ICPMS-Methode, um Daten für LC-ICPMS zu erfassen, indem Sie zuerst die Erfassungsmethode von Spektrum auf Zeitauflösungserfassung ändern. Wählen Sie dann die zu analysierenden Elemente aus. Eisen, Kupfer, Zink, Kobalt, Jod sowie alle anderen interessanten Elemente und festgelegte Integrationszeiten.

Nachdem Sie die gewünschten Elemente ausgewählt haben, passen Sie die Erfassungszeit an die Laufzeit der Chromatographie an. Passen Sie das ICPMS manuell auf die Empfindlichkeit und die Kollisionszell-Heliumgasflussraten mit einem Chromatographiepuffer an, der mit Cäsium und Antimon im Puffer fließt. Sobald sich die Metallionenzahl stabilisiert hat und die relative Standardabweichung unter fünf Prozent liegt, ist das System einsatzbereit.

Erstellen Sie Beispiellauflisten sowohl in den HPLC- als auch in den ICPMS-Softwareprogrammen. Die Stichprobenlaufliste enthält die Reihenfolge, in der die einzelnen Stichproben injiziert werden sollen. Sowie der Name, unter dem die Daten gespeichert werden.

Überprüfen Sie, ob die Gesamtzahl der Samples in der Liste mit den beiden Programmen übereinstimmt. Starten Sie die Probencharge für das ICPMS vor der HPLC, da die Injektion der Probe durch die HPLC das ICPMS dazu veranlasst, mit der Datenerfassung zu beginnen. Wenn dies nicht in der richtigen Reihenfolge geschieht, führt dies zu fehlenden Daten.

Generieren Sie Kalibrierkurvenpunkte durch Injektion unterschiedlicher Volumina des gemischten Superoxiddismutase- und Ferritin-Standards. Die Injektionsvolumina reichen von einem Mikroliter bis zu 30 Mikrolitern. Analysieren Sie abschließend jede der unbekannten Proben, wie z. B. Gewebe, Plasma oder Zellkultur, bevor Sie die Daten wie im Textprotokoll beschrieben analysieren.

Die Illusion von Ferritin über einen Bereich von 2000 bis 60.000 Pikogramm Eisen, das auf die Säule injiziert wird, wird gezeigt. Die Regressionsanalyse wurde anhand der Peakfläche durchgeführt. Die Illusionsprofile für Kupfer, Zink und Superoxiddismutase sind sowohl für Kupfer als auch für Zink dargestellt.

Die Regressionsanalysen, die mit Hilfe von Peakbereichen erstellt wurden, werden ebenfalls dargestellt. Die Ergebnisse der Regressionsanalyse werden verwendet, um die Rohdaten in Zählungen pro Sekunde in Pikogramme pro Sekunde umzuwandeln. Damit kann die Menge an Metall, die mit dem Protein assoziiert ist, quantitativ bestimmt werden.

Diese Technik kann zur Identifizierung von Metalloproteinen in komplexen biologischen Proben verwendet werden. Hier ist das menschliche Gehirn durch SEC ICPMS getrennt. Jedes von ihnen repräsentiert ein anderes Metall von Interesse.

Nämlich Kupfer, Zink oder Eisen. Hier sind die Spuren zu sehen, die erhalten werden, wenn menschliches Plasma dieser Technik unterzogen wird. Die Komplexität und Häufigkeit der Stichprobe wirkt sich auf die Anzahl der Peaks aus, die gesehen werden.

Erwartungsgemäß wird das Plasma von einigen wenigen Metalloproteinen dominiert, darunter Ceruloplasmin und Transferrin. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Instrument einrichten, um den nativen Zustand von Metalloproteinen in komplexen Proben zu messen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Stunden erfolgreich angewendet werden.

Auf diese Weise können 20 bis 36 Proben an einem einzigen Tag analysiert werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, die entsprechenden Metalloproteinstandards zu verwenden, wie z. B. Kupfer-Zink-SOD, wenn Sie sich für Kupfer und Zink interessieren. Sowie die internen Standards im Puffer, wie z. B. Cäsium, mit denen Sie jede Drift des Instruments im Laufe der Zeit korrigieren können.

Nach diesem Verfahren können Sie auch andere Formen der Massenspektrometrie implementieren, um wichtige Fragen zu beantworten. Zum Beispiel, welche Metalloproteine sind in meiner Probe vorhanden? Dies kann durch Standardtrips bei der Verdauung und Massenspektrometrie von Proteinpeptiden erfolgen.

Oder, indem man die Proteine in takt analysiert, in ihrem nativen Zustand. Nach ihrer Entwicklung kann diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Proteomik den Weg ebnen, um die Rolle von Metalloproteinen bei Krankheiten wie der Alzheimer-Krankheit zu verstehen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit konzentrierter Salpetersäure und klinischen Proben.

Es sollte geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen werden.