Name: Standards für die quantitative Metalloproteomic Analyse mit Größenausschluss-ICP-MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Lernen Sie die quantitative Metalloproteomanalyse mit Größenausschluss-ICP-MS für biologische Proben. Diese Methode ermöglicht die Messung des Metallstatus nativer Proteine und liefert Einblicke in metallbedingte Krankheitsmechanismen.

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Wir möchten Unterstützung von Operational Support der Infrastruktur-Programm der Regierung von Victoria zu bestätigen, das Australian Research Council Linkage Projekte Scheme (mit Agilent Technologies), der Australian National Health und Medical Research Council, das viktorianische Hirnbank, Cooperative Research Centre for Mental Health und der Neuroproteomics Einrichtung.

1. Herstellung von Puffern und Proben <ol><li> Bereiten 500 ml Puffer, 200 mM Ammoniumnitrat pH 7,6-7,8 (pH mit Ammoniumhydroxid eingestellt (NH 4 OH)) mit Cäsium (Cs) und antinomy (Sb) zu einer Endkonzentration von 10 ppb. Verwenden Cäsium und antinomy als interne Standards für jede Drift in der Reaktion von ICP-MS zu überwachen. Filter Puffer vor durch ein 0,22 um-Filter zu verwenden. </li><li> Bereiten Probe in Abhängigkeit von der Art der Probe: flüssig, Gewebe- oder Zellkultur. <ol><li> Für Proben , die Homogenisierung erfordern (zB Gewebe oder Zellen), stellen Sie sicher , dass sie nicht enthalten Reinigungsmittel. Verwenden Tris-Puffer für die Probenvorbereitung. Alternativ können Phosphatpuffer , aber sie können sich negativ auf die metalloproteome im Laufe der Zeit oder mit Gefrier - Auftau - Zyklen 12 beeinflussen. </li><li> Homogenisieren Gewebe- oder Zellkulturproben durch manuelle Dounce oder Beschallung für 5 min unter Verwendung von Tris-gepufferter Kochsalzlösung (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM Natriumchlorid(NaCl) + Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Inhibitoren freie Protease). </li><li> Klärung Homogenate durch Zentrifugation bei 16.000 × g für 5 min. Sammeln Sie die resultierende Überstand. Halten Proben bei 4 ° C. Hinweis: Alle Proben müssen vor dem Laden in die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Fläschchen zentrifugiert werden Partikel zu verhindern, dass der Grßenausschlußchromatographie (SEC) Säule blockiert. </li></ol></li><li> Normalisieren der Gesamtmenge an Protein auf der Säule für die Proben geladen. Bestimmen Proteinkonzentrationen bei 280 nm ein Mikrovolumen UV - Spektralphotometer 13. Last zwischen 20 und 150 &amp; mgr; g Protein. Verwenden Sie typische Injektionsvolumina im Bereich von 2 bis 80 &amp; mgr; l in Abhängigkeit von der Probenkonzentration. <ol><li> Reinigen Sie den Probenarm des Mikrovolumen UV-Spektrophotometer mit destilliertem Wasser vor der Probenbeladung. Der Probenarm ist, wo die Proteinproben geladen werden. </li><li> Blank das Instrument gegen 2 ul the-Probenpuffer. Dann Last 2 ul jeder Probe auf den Arm und messen der Extinktion bei 280 nm. </li><li> Bestimmen Sie die Konzentrationen. Rohprotein Proben, einen Extinktionskoeffizienten von 1 Abs = 1 mg / ml verwendet werden. Um die Konzentration von Protein in den Proben zu bestimmen, verwenden das Beer-Lambert Gesetz, A = ε xlxc, wobei A die Extinktion ist, ε der Extinktionskoeffizient ist, L die Weglänge in Zentimetern und c ist die Konzentration. </li></ol></li></ol> 2. Massenanalyse von Metalloprotein Standards mit induktiv gekoppeltem Plasma - Massenspektrometrie <ol><li> Warm-up und stimmen die Instrumentenherstellers Protokolle. </li><li> Sobald Instrument wird erwärmt und abgestimmt, führen Sie Bulk-ICP-MS. Hinweis: Auf Lösungen von gereinigtem Metalloproteine ​​im Allgemeinen vor der Messung verdünnt werden müssen. Metall Stöchiometrien und der geschätzten Protein concentra: die Metallkonzentration des Standards kann aus der bekannten Protein abschätzbartion. Diese Informationen können verwendet werden, um die Verdünnung zu bestimmen, die geeignet sein wird, erzeugt im Bereich der Standardkurve fallen. <ol><li> Verdünnte Metalloprotein Standards, Thyroglobulin, Ferritin, Ceruloplasmin, Cu / Zn - SOD und Vitamin B 12, um sicherzustellen , dass sie im Bereich von 0 fallen - 500 ug / l, mit 1% Salpetersäure. Um das zu erreichen Standards in diesem Bereich, verwenden Sie keine Verdünnungen von mehr als 1 in 20 in Wasser durchführen Reihenverdünnungen die Bestände vor, dies zu verdünnen, falls erforderlich. </li><li> Legen Sie die Reihenfolge der Injektionen auf. Zunächst analysieren die sieben Kalibrierniveaus, Konzentrationen im Bereich von 0 bis 500 ug / l, die von den Metalloprotein Standards gefolgt. Die sieben Kalibrierungswerte sind 0, 1, 5, 10, 50, 100 und 500 ug / L. </li><li> Wählen Sie Elemente von Interesse. Hier verwenden Fe, Cu, Zn, Co und I, da sie die Elemente sind, dass die Protein-Standards gebunden. Wählen Sie die Elemente in der Erwerbsmethode durch die Elementauswahl Registerkarte Öffnen und Hinzufügen der eleme<html> nts und ihre jeweiligen Isotopenmassen, die analysiert werden sollen. </li><li> Führen Sie die Probenanalyse mit dem Instrument und der Geräte-Software erstellt automatisch die Kalibrierungskurven für jedes der Elemente analysiert. Die Eichkurven werden durch die Software erstellt, indem die Zählungen / sec der gegen die Menge an Metall detektiert Metall aufgetragen, die den Standard gemeint ist enthalten, in ug / l. Mithilfe der Eichkurven die Konzentration des Metalls in den unbekannten Proben zu bestimmen. Anmerkung: Unter Verwendung der Kalibrierungskurve, bestimmt die Software, um die Konzentration des Metalls in jedem der Metalloprotein Standards. </li><li> Aus den bulk Analyseergebnisse Metalloprotein Standards, die die drei am häufigsten vorkommenden Spurenelemente in Säugetiergewebe unter Verwendung einer Mischung von Cu, Zn-Superoxid-Dismutase (SOD), verdünnt auf 200 ug / L von Kupfer und Zink und Ferritin (FTN) an einer abschließenden umfassen erzeugen Konzentration von 2000 ug / l Eisen. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. HPLC System-Setup und Grßenausschlußchromatographie Äquilibrierung der Säule Anmerkung: Dieser Abschnitt sollte parallel zum vorhergehenden durchgeführt werden, da sie beide etwa 1 erforderlich - 1,5 Stunden durchzuführen. <ol><li> Purge HPLC-Pumpen mit Puffer in Schritt 1.1 und reinigen die Pumpen für 5 min bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml / min. </li><li> Sobald das System gespült wird, stellen Sie den Durchfluss bei 0,1 ml / min und schließen Sie die Größenausschluss-Säule (4,6 x 300 mm, 3 &amp; mgr; m, 150 Å). Hinweis: Eine nasse Verbindung zwischen dem Rohr und der Säule vermeidet jegliche Luftblasen während der Verbindung der Säule eingefangen wird. </li><li> Verbinden Sie das andere Ende der Säule mit dem UV-Detektor eingestellt Absorption bei 280 nm zu messen PEEK Schläuche verwenden. </li><li> Nach und nach die Geschwindigkeit in Schritten von der Säulenfluss erhöhen von 0,05-0,1 ml / min bis zu einer endgültigen Fließgeschwindigkeit von 0,4 ml / min erreicht wird. Während dies geschieht, überprüfen Sie die Schlauchverbindungen auf die Säule auf Lecks. Überwachen Sie den Druckes überschreitet nicht die Spalte Anforderungen sicherzustellen des Systems durch das Chromatogramm in der Software der Druckverlauf zu beobachten. </li><li> Lassen Sie die Spalte mit der erforderlichen Strömungsgeschwindigkeit über 5 äquilibrieren - 10 Säulenvolumen. Nachdem sie ins Gleichgewicht gebracht wird, schließen Sie die Instrumente Probenanalyse auftreten zu lassen. </li><li> Stellen Sie die HPLC-Methode nach oben nach oben Puffer A über die Säule bei 0,4 ml / min für 15 min zu pumpen. </li></ol> 4. Einrichten und Größenausschluss Running - Induktiv gekoppeltes Plasma - Massenspektrometrie Hinweis: Betriebsverfahren kann variieren zwischen den Instrumenten und Modellen. Kontaktieren Sie das Instrument technischer Spezialist mehr darüber zu erfahren, wie die ICP-MS verwendet zu konfigurieren ist. <ol><li> Legen Sie die ICP - MS in den Standby-Modus, bevor Sie die Hardware-Einstellung zu ändern. <ol><li> Im Standby-Modus, schalten Sie die Kommunikation für die Autosampler aus und ändern Sie die Probe Einführung in die &quot;andere&quot;. Hinweis: Je nach Software und hartware Konfigurationsauswahl &quot;HPLC&quot; als Probeneinführungsquelle kann verwendet werden. Kontaktieren Sie das Instrument technischen Spezialisten zu lernen, wenn diese Option verfügbar ist. </li></ol></li><li> Verwenden Sie PEEK-Schlauch (ID 0,13 mm), um den Ausfluss aus dem UV-Detektor zum direkten Anschluss an den Zerstäuber auf dem ICP-MS. </li><li> Schalten Sie den ICP sichern - MS und lassen Sie das Gerät für 10 zum Aufwärmen - 20 min. </li><li> Nachdem das Plasma gezündet hat, schließen Sie das Remote-Kabel von der ICP - MS auf der Rückseite des HPLC-Autosampler. Tun Sie dies einmal das Plasma gezündet hat; andernfalls wird das HPLC-System automatisch, da die ICP heruntergefahren - MS nicht eingeschaltet ist. </li><li> Ändern Sie die ICP-MS-Methode zur Erfassung von Daten für die LC-ICP-MS. <ol><li> Alter der Erwerbsmethode von Spektrum zu Zeit resolve Erfassung (TRA). </li><li> Wählen Sie die Elemente analysiert werden, Fe, Cu, Zn, Co, I sowie andere Elemente von Interesse, und setzen Integrationszeiten (in der Regel zwischen 0,05 bis 0,3 sec). Nachdem die Elemente von Interesse einRe gewählt, stellen Sie die Erfassungszeit die Laufzeit für die Chromatographie zu entsprechen (zB 900 sec für eine 15 - min - Chromatographie - Lauf). </li><li> Manuelles Einstellen der ICP - MS für die Empfindlichkeit und Kollisionszelle Helium (He) Gasflussraten mit dem Puffer-Chromatographie fließt unter Verwendung von Cs und Sb in dem Puffer enthalten. Die He Strömungsraten liegen typischerweise ~ 1 ml / min weniger als die für die Massenanalyse verwendet. Sobald die Metallionenzählungen stabilisiert haben und die relative Standardabweichung (RSD) Werte unter 5%, ist das System betriebsbereit. </li></ol></li><li> Machen Probe laufen Listen sowohl in der HPLC und ICP-MS-Software-Programme. Die Probe Laufliste enthält die Reihenfolge, in der jeder der Proben ist ebenso wie der Name injiziert werden, mit dem die Daten gespeichert werden. Überprüfen Sie, dass die Gesamtzahl der Proben, die in der Liste Übereinstimmung zwischen den beiden Programmen. </li><li> Starten Sie den Probencharge für das ICP-MS vor der HPLC, wie die Injektion der Probe durch HPLC wird das ICP auslösen - MS zu starten SammelDaten. Wenn dies nicht in der richtigen Reihenfolge durchgeführt wird, wird es in fehlenden Daten führen. </li><li> Generieren Kalibrierungskurve Punkte durch Variation Volumina der SOD und FTN gemischten Standard von 200 ug / l bis 6000 ug / l Injektion injiziert auf Spalte für Cu &amp; Zn und 2000 ug / l bis zu 60.000 g / L für Fe. Injektionsvolumina im Bereich von 1 bis 30 &amp; mgr; l. Anmerkung: Diese Konzentrationsbereiche umfassen, die Konzentrationen von Fe, Cu und Zn in der Regel komplexe Homogenaten beobachtet. Bei Proben, die nur gereinigte Proteine ​​die maximale Reichweite der Kurve enthalten sollte entsprechend angepasst werden. Da die Menge an Metall, die mit dem Protein assoziiert ist, einen kleineren oder größeren Bereich erfordern, da es weniger Verunreinigung in der Probe von anderen Faktoren. </li><li> Analysieren jedes der unbekannten Proben Gewebe, Plasma oder Zellkultur. </li></ol> 5. Datenanalyse, Manipulation und Visualisierung <ol><li> Speichern Sie die Daten im Comma Separated Value (CSV) Dateiformat und laden into Verarbeitungsprogramme wie erforderlich. </li><li> Damit Instrument Drift zu steuern, teilen Sie die Zählungen pro Sekunde für jedes Element durch die Zählungen pro Sekunde für entweder Cs oder Sb. </li><li> Erzeugen Eichkurven für jedes der Elemente. <ol><li> Bestimmung der Fläche unter der Metall peak, der dem entspricht, der Metalloprotein es für jede der Einspritzungen durch Ausführen Peakintegration in der bevorzugten Datenanalyse-Software gebunden ist. </li><li> Plotten der Fläche unter dem Peak Metall gegen die Gesamtmenge des Metalls, die auf die Säule in jedem Durchlauf injiziert wurde, 200 - 6,000 ug / l für Cu und Zn und 2,000 - 60,000 &amp; mgr; g / L für Fe. Führen der linearen Regressionsanalyse nach der Software-Protokoll. </li><li> Verwenden Sie die Steigung ergibt sich aus der linearen Regressionsanalyse als Faktor zählt zu konvertieren pro Sekunde pg / sec. Teilen jede der Zählungen pro Sekunde Datenpunkte über das Chromatogramm, das durch den Gradienten des Linienwert. </li></ol></li><li> Graph, der die Daten inpg / s gegen das Chromatogramm Zeit. Die Fläche unter den Peaks von Interesse. Die Fläche unter dem Peak repräsentiert die Gesamtmenge an Metall, das das Protein gebunden ist, in pg. </li><li> Generieren eines Kalibrierungs bezogen auf das Molekulargewicht der bekannten Metalloproteine ​​und dem Zeitpunkt, zu dem sie eluieren. Hier können Sie die Größe der Proteinpeaks in komplexen Proben zu schätzen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen

Gewährleistung der nativen Zustand des Proteins bedeutet, besondere Aufmerksamkeit auf die Puffer verwendet und Lagerung der Probe erforderlich sind. Nicht alle chromatographischen Techniken oder Probenpräparationstechniken können eingesetzt werden. Es ist wichtig, dass die Puffer im gesamten Probenvorbereitung und Chromatographie verwendet frei sind von Metallchelatoren und Puffer, die Verwendung physiologischen pH-Wert und Salzkonzentrationen nachahmen. Andere Bedingungen zu vermeiden , umfassen Erwärmen der Probe oder die Zugabe von Proteindenaturierungsmitteln (zB Harnstoff). Es ist wichtig, die Anzahl der Gefrier-Auftau-Zyklen zu minimieren. Die Fähigkeit des gewählten Puffers zweiwertiger Metalle zu binden, ist ebenfalls wichtig und ist ein Grund dafür, daß Tris oder Ammoniumnitrat Puffer über Phosphatbasis Puffern ausgewählt werden. Die niedrige Auflösung und Peakkapazität der Grßenausschlußchromatographie relativ zu anderen Formen der Chromatographie ist eine wichtige Einschränkung dieser Technik. Doch die sanfte Art der Größenausschluss chromatography ist wichtig, den nativen Zustand des Proteins aufrecht zu erhalten und damit die relativ schwache Metall-Protein-Bindungen zu erhalten. Die Anforderung , den nativen Zustand der Proteine ​​erfordert besondere Aufmerksamkeit auf die Behandlung der Proben zu erhalten , einschließlich der Anzahl der Gefrier - Auftau - Zyklen zu begrenzen, die Vermeidung Metallchelatbildner (zB EDTA) oder chaotropen Salzen und Detergenzien. Diese geringe Auflösung dieser Technik wirkt sich auf die Fähigkeit, die Menge an Metall mit einem bestimmten Protein zu quantifizieren, wenn sie in einer komplexen Probe wie die Peaks wird mehr als ein Protein angesehen enthalten. Daher bestimmt die Menge an Metall, um die Peak-Integration unter Verwendung wäre ein Hinweis auf die Gesamtmenge an Metall zu diesem Zeitpunkt und nicht nur ein spezifisches Protein mit allen der Proteine ​​eluierenden Verbindung gebracht werden. Um diese Einschränkung zu überwinden würde das Protein von Interesse müssen weiter unter nativen Bedingungen gereinigt werden. Dies würde für die Quantifizierung vondas Metall mit diesem Protein in Verbindung mit einem höheren Grad an certainity gemeldet werden. Eine weitere potentielle Einschränkung dieser Technik würde der Verlust an Protein aufgrund nicht reversible Bindung an die Säule. Um festzustellen, ob dies ein Rückgewinnungsexperiment geschieht sollte durchgeführt werden, wobei die Menge an Protein aus der Säule eluiert wird analysiert, um zu bestimmen, ob dies die Menge übereinstimmt injiziert. Das gleiche kann durch Messung des Metallgehalts des Eluierung Materials und des Ausgangsmaterials durch bulk ICP-MS durchgeführt werden. Spaltenrückgewinnung kann in Abhängigkeit von den verwendeten Bedingungen unterscheiden, aber es hat sich gezeigt , daß eine vollständige Rückgewinnung von Proteinen aus einer Größenausschlusssäule ist möglich 9. Daher ist es wichtig, ob oder nicht zu überprüfen ist der Verlust unter den Betriebsbedingungen verwendet werden. Modifikationen des Protokolls können auf die Metalloprotein Standards in Beziehung gesetzt werden, die ebenso wie die untersuchten Elemente verwendet werden. Die Art der Metalloprotein Standard unsed wird in Abhängigkeit von den Elementen unterscheiden, die von Interesse sind. Für Elemente, wie Cu, Fe und Zn-Proteine, SOD und Ferritin verwendet. Jede andere Metalloprotein, die bekannt stoichometries haben, können auch verwendet werden und einige Beispiele wurden hier gezeigt. Eine Hauptkomplikation, die diese Technik verwenden, ist der Aufbau der Salzkristalle in dem Brenner der ICP-MS entstehen können. 1,000 ml Puffer, der durch das System geleitet wurde, oder wenn es durch visuelle Inspektion festgestellt wird, daß das Brenner gewaschen werden soll - zum Aufbau der Salzkristalle zu verhindern, wird der Brenner mit destilliertem Wasser nach 500 gewaschen. Ein weiteres Problem, das ist ein schneller Rückgang der Sauberkeit der Proben- und Extraktionskegel entstehen können. Diese müssen gereinigt werden regelmäßig folgende Herstellerprotokolle. Die anfängliche Probenvorbereitung ist der wichtigste Schritt im Protokoll. Wenn es irgendwelche Änderungen an der Protein - Metallkomplex der informationen erzeugt wird, nicht gültig ist. Dies ist eine der wichtigsten Beschränkungen der Technik; Zusätzlich ergibt die Verwendung der niedrigen Auflösung, Grßenausschlusssäule eine begrenzte detaillierte Ansicht der wahren Komplexität der Metalloproteine ​​in der Biologie. Die hier beschriebene Technik ermöglicht die Erweiterung des Wissens des metalloproteome eines Organismus. Massenanalyse liefert nur eine grobe Angabe der Änderungen der Menge an Metall in einer Probe. Neben den allgemeinen Überlegungen, die ergriffen werden müssen, bietet diese Technik ein Werkzeug, das verwendet werden kann, die Menge an Metall mit Proteinen sowie die Identifizierung Metalloproteine ​​assoziiert zu quantifizieren, die durch einen Vergleich der Spuren berechnet wurde, abweichen. Die Verwendung dieser Technik kann verwendet werden, Unterschiede zwischen Krankheitszuständen zu identifizieren. Die identifizierten Metalloproteine ​​können dann die Rolle bestimmen zu helfen, untersucht werden sie in Krankheitsprozessen spielen. Die Anwendung von Bindestrichen ICP-MS hat eine wachsendeZukunft die Rolle von Drogen zu bestimmen, die ein Heteroatom wie beispielsweise Platin, Iod oder Kupfer als ICP-MS haben, können verwendet werden, um die Proteine ​​zu identifizieren, die das Medikament bindet.

Wesentliche Metalle spielen eine entscheidende Rolle bei der normalen biologischen Funktionen, einschließlich der sekundären Botenwege, Stoffwechselwege und Organell Funktionen. 30% aller Proteine ​​sind gedacht , Metalloproteine ​​1 und 50% aller Enzyme 2 sein. Metalloenzyme nutzen diese Spurenmetalle als Cofaktoren chemische Reaktionen zu katalysieren, Proteinstruktur und für regulatorische Funktionen wie sekundäre Botenstoffe stabilisieren. Einige der untersuchten Spurenelemente in Bezug auf die Neurodegeneration sind Kupfer, Eisen und Zink - 3. Sie sind gedacht, in vielen Krankheitswegen beteiligt werden, in denen durch dyshomeostasis haben negative Auswirkungen. Beispielsweise die Metallstatus von Superoxid - Dismutase (SOD) wirkt sich direkt auf die Lebensdauer und Phänotyp der transgenen Mausmodellen von familiärer Art von amyotropher Lateralsklerose (ALS) 4. Bei der Alzheimer-Krankheit, wurden metalloproteomics Techniken verwendet, um eine Abnahme in der Metallstand von Transferrin in p zu entdecken5 LASMA. Diese Studien unterstreichen die wichtige Rolle Metalloproteine ​​in Krankheit spielen kann. Die Studie von Metalloproteinen direkt aus biologischen Geweben ist ein Entwicklungsfeld. Obwohl einige Metalloenzyme charakterisiert worden sind, bleiben die meisten immer noch nicht charakterisierten oder unbekannt 6. Eine der großen Herausforderungen bei der Messung Metalloproteine ​​ist die Forderung , den nativen Zustand des Proteins 7 zu halten. Klassische Bottom-up-Proteom-Techniken stützen sich auf die Verdauung der Proteine ​​in Peptide. Dieser Vorgang unterbricht die nichtkovalente Interaktion von Metallen und deren Proteine. Somit wird keine Information über das Metall Status eines Proteins gewonnen. Eine Möglichkeit , dieses Problem zu überwinden , ist die Verwendung von Grßenausschlußchromatographie mit induktiv gekoppeltem Plasma gepaart - Massenspektrometrie 8,9 (SEC-ICP-MS). Dies erzeugt Informationen über die ungefähre Größe des Proteins sowie alle Metalle, die Assoc sindverbundes mit ihm 10. Ferner ist Größenausschluss eine sanfte chromatographische Technik, die den nativen Zustand eines Enzyms oder Protein-Protein-Komplex erhalten kann. Ein Vorteil induktiv gekoppeltem Plasma - Massenspektrometrie (ICP-MS) ist die quantitative Natur der Technologie. Mit einer Reihe von Metalloproteinen Standards ist es möglich , absolute Quantifizierung von Metalloproteine ​​aus biologischen Proben 9,11 bereitzustellen. Dies wird durch Erzeugen einer Standardkurve durch Injizieren bekannter Metalloproteine ​​über einen Bereich von Metallkonzentrationen erreicht. Dieses Protokoll zeigt ein Beispiel, wie dies für eine Vielzahl von Metalloprotein Standards erreicht werden. In diesem Papier wollen wir Standardkurven für Metalle zu schaffen, die in biologischen Gebieten, einschließlich Eisen weitgehend untersucht (Fe), Kupfer (Cu), Zink (Zn), Jod (I) und Cobalt (Co).

<table><tbody><tr><td>Agilent 1290 Infinity Binärpumpe</td><td>Agilent</td><td>G4220A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Infinity Autosampler</td><td>Agilent</td><td>G4226A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1200 Serie Autosampler Thermostat</td><td>Agilent</td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Infinity Thermostatisiertes Säulenfach</td><td>Agilent</td><td>G1316C</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1290 Infinity Detektor mit variabler Wellenlänge</td><td>Agilent</td><td>G1314E</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7700 ICP-MS</td><td>Agilent</td><td>G3282A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ammoniumhydroxid Spurenmetall Basis&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ammoniumnitrat&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>256064</td><td>Stellen Sie am Tag des Experiments eine frische 200-mM-Lösung her</td></tr><tr><td>&nbsp; Antinomie&nbsp;</td><td>Auswahl analytisch&nbsp;</td><td>10002-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ceruloplasmin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Cäsium&nbsp;</td><td>Auswahl analytisch&nbsp;</td><td>100011-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Vollständige, EDTA-freie Proteasehemmer&nbsp; &nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Conalbumin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7786</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Concanavalin A aus Canavalia ensiformis (Jack Bean)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L7647</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Cu, Zn-Superoxid-Dismutase&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9697</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ferritin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F4503</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ICP-MS Multielement-Kalibrierstandards&nbsp;</td><td>AccuStandard</td><td></td><td>Hergestellt bis zu den erforderlichen Konzentrationen in 1 % Salpetersäure</td></tr><tr><td>&nbsp; Mikrovolumen-UV-Spektralphotometer&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 65% Salpetersäure&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>100441</td><td>Zur Verwendung auf 1% verdünnt</td></tr><tr><td>&nbsp; Peek-Schläuche&nbsp; &nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5042-6461</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Formatausschlusssäule BioSEC-3 SPS. Säule, 4,6 x 300 mm, 3 &mu; m, 150 & Aring; &nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5190-2508</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Natriumchlorid&nbsp;</td><td>Chem Supply</td><td>SA046</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Trishydrochlorid&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals Inc.&nbsp;</td><td>103130</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Thyreoglobulin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T9145</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Vitamin B12&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>V2876</td><td></td></tr></tbody></table>

standards für die quantitative metalloproteomic analyse mit größenausschluss-icp-ms

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Metalle sind essentiell für die Proteinfunktion als Cofaktoren, um chemische Reaktionen zu katalysieren. Eine Störung der Metallhomöostase wird mit einer Reihe von Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson in Verbindung gebracht, aber die genaue Rolle, die diese Metalle spielen, ist noch nicht vollständig geklärt. Die Identifizierung von Metalloproteinen stößt auf viele Herausforderungen und Schwierigkeiten. Hier berichten wir über einen Ansatz, der es ermöglicht, Metalloproteine in komplexen Proben zu quantifizieren. Dies wird durch die Größenausschlusschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (SEC-ICP-MS) erreicht. Anhand von sechs bekannten Metalloproteinen kann die Größenausschlusssäule kalibriert und die jeweiligen Spurenelemente (Eisen, Kupfer, Zink, Kobalt, Jod) zur Quantifizierung herangezogen werden. SEC-ICP-MS-Spuren des menschlichen Gehirns und Plasmas werden vorgestellt. Die Verwendung dieser Metalloproteinstandards bietet die Möglichkeit, die Metalloproteinhäufigkeiten zwischen biologischen Proben quantitativ zu vergleichen. Diese Technik ist bereit, die Rolle von Metalloproteinen bei neurodegenerativen Erkrankungen sowie bei anderen Krankheiten, bei denen ein Ungleichgewicht der Spurenelemente eine Rolle spielt, zu beleuchten.

Die Verwendung von Metalloprotein Standards ermöglicht die Kalibrierung der Grßenausschlußsäule. 1A zeigt das Elutionsprofil für die Standards Thyroglobulin, Ferritin, Ceruloplasmin, Cu / Zn - SOD und Vitamin B 12 , bezogen auf das Metall , das sie gebunden sind (Fe, Co, Cu, Zn und I). 1B zeigt die Eichkurve für die Spalte Grßenausschluß basierend auf dem Molekulargewicht der Proteinstandards und deren Elutionszeit, in dem Format von Elutionsvolumen dargestellt (Ve) , geteilt durch das Leervolumen der Säule (Vo). Die Proteine ​​verwendet, um dieses Standardkurve zu erzeugen, sind Concanavalin A, Conalbumin, Ceruloplasmin, Ferritin, SOD und Thyreoglobulin. 2A zeigt die Elution von Ferritin über einen Bereich von 2.000 - 60.000 pg Fe injiziert auf Spalten- und 2D ist die Regressionsanalyse durchgeführt unter Verwendung von peak Bereich. 2B und 2C sind die Elutionsprofile für Cu / Zn SOD für Cu und Zn und 2E und 2F sind die Regressionsanalyse unter Verwendung von Peakflächen erzeugt. Die Ergebnisse der Regressionsanalyse verwendet, um die Rohdaten in Counts / sec zu pg / sec zu konvertieren, so dass die Menge an Metall, die mit dem Protein assoziiert ist, quantitativ bestimmt werden. Die Umwandlung wird durch Division des Counts / sec durch die Steigung der linearen Regression durchgeführt (zB 334,6 (Counts / s) x (s / pg) Kupfer). Wie bereits erwähnt, kann diese Technik verwendet werden, Metalloproteine ​​in komplexen biologischen Proben zu identifizieren. Menschliche Gehirn und Plasma wurden zu dieser Technik unterzogen und Figuren 3 bzw. 4 erhaltenen Ergebnisse zeigen. Menschliche Gehirn getrennt durch SEC-ICP-MS ist in den 3A bis 3C gezeigt, von denen jede repräsentieren eine andere Metall der<html> Interesse (Cu, Zn oder Fe). 4A-4C die Spuren erhalten zeigen , wenn Humanplasma dieser Technik unterzogen wird. Die Komplexität und die Fülle der Probe wird die Anzahl der Spitzen auswirken, die zu sehen sind. Wie erwartet Plasma wird durch ein paar Metalloproteine ​​einschließlich Ceruloplasmin und Transferrin bestimmt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig1.jpg" /> Abbildung 1. Kalibrierung der Größe Chromatographie Ausschluss - Massenspektrometrie unter Verwendung bekannter Metalloproteins (A) Elutionsprofil für die Metalloprotein Standards auf der Grundlage ihrer jeweiligen Metalle - Induktiv Plasma gekoppelt ist .. (B) Molekulargewichtskalibrierungskurve für Proteinstandards Thyroglobulin (i), Ferritin (ii), Ceruloplasmin (iii), Conalbumin (iv), Cu / Zn - SOD (v) und Concanavalin A (vi).&quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig2.jpg" /> Abbildung 2. Verwendung von Ferritin und Cu / Zn - SOD als Metalloprotein Standards zur Bestimmung der Menge an Cu, Fe oder Zn Verbunden mit Metalloproteins in einer komplexen biologischen Probe (A) Elutionsprofil für Ferritin über den Injektionsbereich 2000 -. 60.000 ug / l Eisen. (B) und (C) Elutionsprofil für Cu / Zn SOD auf die Injektionsbereich von 200 - 6000 g / L von Kupfer und Zink, respectively. (D), (E) und (F) zeigen die Regressionsanalyseergebnissen für die Metalle Eisen, Kupfer und Zink sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 3. Cu, Fe und Zn Metalloproteome des menschlichen Gehirns. (A) Kupferspur (B) Eisen Spur (C) Zink Spur. Die Elution der Proteinstandards für jedes Metall durch die schwarze Kurve mit ihrem Molekulargewicht unter dem Diagramm angezeigt dargestellt ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53737/53737fig4.jpg" /> Abbildung 4. Cu, Fe und Zn Metalloproteome für Humanplasma. (A) Kupferspur (B) Eisen Spur (C) Zink Spur. Die Elution der Proteinstandards für jedes Metall wird durch die schwarze Kurve mit ihrem Molekulargewicht gezeigt indicated unter dem Graphen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53737/53737fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Die Größenausschlusschromatographie mit Bindestrich mit induktiv gekoppeltem Plasma - Massenspektrometrie (ICP-MS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Veränderungen in der Häufigkeit von Metalloproteinen direkt aus biologischen Proben zu messen. Hier beschreiben wir eine Reihe von Metalloprotein-Standards, die zur Abschätzung der Molekülmasse und der Menge an Metall verwendet werden, die mit unbekannten Proteinen assoziiert ist.

Standards für die quantitative Metalloproteomic Analyse mit Größenausschluss-ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, verschiedene Metallproteine in komplexen Proben durch die Verwendung bekannter Metallproteinstandards quantifizieren zu können. Diese Methode kann zentrale Fragen zur Rolle von Metallen in der Biologie beantworten. Zum Beispiel: Wie verändert sich der Metallgehalt eines Proteins bei einer Erkrankung?Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, den Metallstatus eines Proteins in seinem nativen Zustand zu messen. Die Demonstration der Technik übernimmt Amber Lothian, eine Doktorandin aus meinem Labor. Beginnen Sie damit, homogenisiertes Gewebe oder Zellkulturproben manuell oder durch Beschallung für fünf Minuten unter Verwendung von Tris-gepuffertem Salzlösung zu homogenisieren.Klären Sie die Homogenate durch Zentrifugation bei 16.000 × g über fünf Minuten. Nach dem Sammeln des resultierenden Überstands normalisieren Sie die Gesamtmenge an Protein, indem Sie die Protein-Konzentrationen gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll bestimmen. Erwärmen und kalibrieren Sie das induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometer gemäß den Herstellerprotokollen.Verdünnen Sie die Metallproteinstandards auf einen Bereich von null bis 500 Mikrogramm pro Liter unter Verwendung von einprozentiger Salpetersäure. Um Standards innerhalb dieses Bereichs zu erhalten, verwenden Sie keine Verdünnungen über 1 zu 20. Richten Sie die Reihenfolge der Injektionen ein, indem Sie zunächst die sieben Kalibrierstufen analysieren.Konzentrationen im Bereich von null bis 500 Mikrogramm pro Liter, gefolgt von den Metallproteinstandards. Die sieben Kalibrierstufen betragen null, eins, fünf, zehn, 50, 100 und 500 Mikrogramm pro Liter. Danach Elemente der Untersuchung auswählen.Verwenden Sie hier Eisen, Kupfer, Zink, Kobalt und Jod, da es sich um die Elemente handelt, an die die Proteinstandards gebunden sind. Wählen Sie die Elemente in der Erfassungsmethode aus, indem Sie die Elementauswahl-Registerkarte öffnen und die Elemente sowie ihre jeweiligen Isotopenmassen hinzufügen, die analysiert werden sollen.Führen Sie anschließend die Probenanalyse mit dem Instrument durch. Die Instrumentensoftware erstellt automatisch die Kalibrierkurven für jedes der analysierten Elemente. Verwenden Sie die Kalibrierkurven, um die Konzentration des Metalls in den unbekannten Proben zu bestimmen.Aus den Ergebnissen der Gesamtanalyse erzeugen Sie Metallproteinstandards, die die drei am häufigsten vorkommenden Spurenelemente in Säugetiergeweben enthalten, indem Sie eine Mischung aus Kupfer, Zinksuperoxiddismutase und Ferritin verwenden. Spülen Sie die Hochleistungs-Quick-Chromatographie- oder HPLC-Pumpen fünf Minuten lang mit 200 Millimolar Ammoniumnitratpuffer bei einer Flussrate von fünf Milliliter pro Minute aus. Sobald das System gespült ist, stellen Sie die Flussrate auf 0,1 Milliliter pro Minute ein.Und schließen Sie die Ausschluss-Säule an der Seite an. Verbinden Sie das gegenüberliegende Ende der Säule mit dem UV-Detektor und stellen Sie die Messung der Absorption bei 280 Nanometern unter Verwendung von Peak-Tubing ein. Erhöhen Sie schrittweise die Flussrate der Säule in Schritten von 0,1 mL/min, bis eine endgültige Flussrate von 0,4 mL/min erreicht ist.Währenddessen überprüfen Sie die Schlauchanschlüsse an der Säule auf eventuelle Lecks. Überwachen Sie den Druck des Systems, um sicherzustellen, dass die Säulenvorgaben nicht überschritten werden, indem Sie die Druckkurve im Chromatogramm der Software beobachten. Lassen Sie die Säule bei der erforderlichen Flussrate über fünf bis zehn Säulenvolumina hinweg equilibrieren.Nachdem es ausgeglichen ist, schließen Sie die Geräte an, um die Probenanalyse durchzuführen. Richten Sie die HPLC-Methode so ein, dass Puffer A mit 0,4 mL/min über die Säule gepumpt wird, und zwar 15 Minuten lang. Schalten Sie das ICPMS in den Standby-Modus, bevor Sie die Hardware-Einstellungen ändern.Nachdem der Standby-Modus erreicht ist, schalten Sie die Kommunikation für den Auto-Sampler ab und wechseln Sie die Probenzufuhr auf eine andere. Verwenden Sie PEEK-Schläuche, um den Ausfluss aus dem UV-Detektor direkt mit dem Nebulizer des ICPMS zu verbinden. Schalten Sie das ICPMS ein und lassen Sie das Gerät 10 bis 20 Minuten aufwärmen.Nachdem das Plasma gezündet wurde, schließen Sie das Fernkabel vom ICP-MS an die Rückseite des HPLC-Autosamplers an. Tun Sie dies erst, nachdem das Plasma gezündet wurde. Andernfalls schaltet sich das HPLC-System automatisch ab, da das ICP-MS nicht eingeschaltet ist.Ändern Sie die ICP-MS-Methode, um Daten für die LC-ICP-MS zu sammeln, indem Sie zunächst die Erfassungsmethode von Spektrum auf zeitauflösende Erfassung umstellen. Wählen Sie anschließend die zu analysierenden Elemente aus. Eisen, Kupfer, Zink, Kobalt, Jod sowie alle anderen interessierenden Elemente und legen Sie die Integrationszeiten fest.Nachdem die gewünschten Elemente ausgewählt wurden, passen Sie die Erfassungszeit an die Laufzeit der Chromatographie an. Stimmen Sie das ICP-MS manuell auf Empfindlichkeit und Heliumflussrate in der Kollisionszelle ab, wobei ein Chromatographiepuffer mit enthaltenem Cäsium und Antimon durch das System fließt. Sobald die Metallionenzählraten stabil sind und die Werte der relativen Standardabweichung unter fünf Prozent liegen, ist das System betriebsbereit.Erstellen Sie Probelauflisten sowohl in der HPLC- als auch in der ICPMS-Software. Die Probelaufliste enthält die Reihenfolge, in der jede Probe injiziert wird, sowie den Namen, unter dem die Daten gespeichert werden.Überprüfen Sie, ob die Gesamtanzahl der Proben in der Liste zwischen den beiden Programmen übereinstimmt. Starten Sie die Probenreihe für das ICP-MS vor dem HPLC, da die Injektion der Probe durch das HPLC das ICP-MS auslöst, um mit der Datenerfassung zu beginnen. Wird dies nicht in der richtigen Reihenfolge durchgeführt, führt dies zu fehlenden Daten.Erzeugen Sie Kalibrierkurvenpunkte, indem Sie variierende Volumina des gemischten Standards aus Superoxiddismutase und Ferritin injizieren. Die Injektionsvolumina reichen von einem Mikroliter bis zu 30 Mikrolitern. Analysieren Sie abschließend jede der unbekannten Proben, wie zum Beispiel Gewebe, Plasma oder Zellkultur, bevor Sie die Daten wie im Textprotokoll beschrieben auswerten.Die Illusion von Ferritin über einen Bereich von 2000 bis 60.000 Pikogramm Eisen, das auf die Säule injiziert wurde, ist dargestellt. Die Regressionsanalyse wurde unter Verwendung der Peakfläche durchgeführt. Die Illusionsprofile für Kupfer, Zink und Superoxiddismutase sind für sowohl Kupfer als auch Zink gezeigt.Die unter Verwendung der Peakflächen durchgeführten Regressionsanalysen sind ebenfalls dargestellt. Die Ergebnisse der Regressionsanalyse dienen dazu, die Rohdaten in Zählraten pro Sekunde in Pikogramm pro Sekunde umzurechnen, um die Menge des mit dem Protein assoziierten Metalls quantitativ bestimmen zu können.Mithilfe dieser Technik können Metallproteine in komplexen biologischen Proben identifiziert werden. Hier ist ein menschliches Gehirn dargestellt, das mittels SEC-ICPMS getrennt wurde. Jeder Peak repräsentiert ein anderes Metall von Interesse.Und zwar Kupfer, Zink oder Eisen. Hier dargestellt sind die Spuren, die erhalten werden, wenn menschliches Plasma dieser Technik unterzogen wird. Die Komplexität und Menge der Probe beeinflusst die Anzahl der sichtbaren Peaks.Wie erwartet wird das Plasma von einigen Metallproteinen dominiert, darunter Ceruloplasmin und Transferrin. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Instrument einrichtet, um den nativen Zustand von Metallproteinen in komplexen Proben zu messen. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie erfolgreich innerhalb von drei bis vier Stunden angewendet werden.Dadurch können 20 bis 36 Proben an einem einzigen Tag analysiert werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die geeigneten Metallproteinstandards zu verwenden, beispielsweise Kupfer-Zink-SOD, falls Kupfer und Zink von Interesse sind. Ebenso sind interne Standards im Puffer erforderlich, wie beispielsweise Cäsium, um Korrekturen für eventuelle Drifts des Instruments über die Zeit vornehmen zu können.Mithilfe dieses Verfahrens können Sie auch andere Formen der Massenspektrometrie anwenden, um wichtige Fragen zu beantworten. Zum Beispiel: Welche Metallproteine sind in meiner Probe vorhanden? Dies kann durch standardmäßige Verdauungsschritte und massenspektrometrische Sequenzierung von Proteinpeptiden erfolgen.Oder durch die Analyse der Proteine intakt und in ihrem nativen Zustand. Nach ihrer Entwicklung kann diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Proteomik den Weg ebnen, um die Rolle von Metallproteinen bei Krankheiten wie der Alzheimer-Krankheit zu verstehen. Vergessen Sie nicht, mit konzentrierter Salpetersäure und klinischen Proben zu arbeiten.Es sollte geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

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Standards für die quantitative Metalloproteomic Analyse mit Größenausschluss-ICP-MS

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