RNAi-Trigger Lieferung in

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht in der Verabreichung von Auslösern der RNA-Interferenz bei Anopheles gambiae, um Gen-Knockdowns einzuleiten, die während des Puppenstadiums der Entwicklung beginnen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Vektorbiologie zu beantworten und Gene aufzudecken, die während der vorerwachsenen oder frühen erwachsenen Entwicklungsphasen eine Rolle spielen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie Forschenden die Möglichkeit bietet, schnelle funktionelle genomische Studien durchzuführen, wobei die Gen-Knockdowns bereits während des Entwicklungsabschnitts, dem Puppenstadium, beginnen – ein Zeitraum, in dem RNA-Interferenz-Injektionsprotokolle bisher nicht implementiert wurden.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Injektionsschritte aufgrund der erforderlichen Präzision und der empfindlichen Beschaffenheit der Puppen in diesem Entwicklungsstadium schwer zu beherrschen sein können. Nach der Auswahl des Gens der Interesse liegt, identifizieren Sie einen 200 bis 800 Basenpaare langen Bereich, von dem vorhergesagt wird, dass er keine Off-Target-Effekte verursacht, und führen Sie eine Standard-PCR-Amplifikation durch, um eine doppelsträngige RNA-Synthesematrize zu erhalten, die von einer T7-Promotorsequenz flankiert wird. Anschließend synthetisieren Sie die doppelsträngige RNA und reinigen die Produkte mithilfe eines kommerziellen In-vitro-Kits.

Stellen Sie die endgültige RNA-Konzentration auf drei Mikrogramm pro Mikroliter ein. Verwenden Sie anschließend ein standardmäßiges 2 % Agarosegel, um einen halben Mikroliter der doppelsträngigen RNA mit der Matrizen-DNA und Standardmarkern zu vergleichen. Nach dem Laufen lassen überprüfen Sie die Qualität und Länge des Bands der doppelsträngigen RNA.

Es sollten keine sichtbaren unspezifischen Produkte vorhanden sein. Die doppelsträngige RNA wandert langsamer als die Vorlage-DNA. Zum Aufbewahren bereiten Sie Aliquote der doppelsträngigen RNA vor und lagern Sie bei minus 20 Grad Celsius.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Fast Green FCF Farbstoffs. Verdünnen Sie den Farbstoff zunächst auf 0,1 % (Volumen pro Volumen) in RNase-freiem Wasser. Überführen Sie dann Ein-Mikroliter-Mengen der Zubereitung in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Erhitzen Sie die beladenen Röhrchen 3 Stunden lang bei 65 Grad Celsius, um das Wasser zu verdampfen. Kühlen Sie die Röhrchen anschließend vor der Verwendung der Farbstoff-Feststoffe mindestens 30 Minuten lang ab. Bereiten Sie danach kapillarzugespitzte Glasinjektionsnadeln aus Borosilikatglasröhrchen vor.

Stellen Sie den Nadelextrahierer auf einen Spitzen­durchmesser von 10 bis 30 Mikrometern ein. Bei einem NARISHIGE-Kapillar­zieher stellen Sie den ersten Heizstab auf 100 und den zweiten Heizstab auf 70. Danach wird die Kapillarnadel eingespannt und das Ziehen durchgeführt.

Bereiten Sie nun die Injektionsstation vor. Wählen Sie eine Plattform, die leicht unter dem Mikroskop bewegt werden kann. Befestigen Sie auf der Plattform zunächst ein dickes Filterpapier mit Klebeband.

Danach eine dünne Filterpapierlage auf das dicke Filterpapier kleben. Anschließend 10 µL jeder zu injizierenden doppelsträngigen RNA in die festen Farbstoffröhrchen geben und den Farbstoff erneut suspendieren. Diese Röhrchen auf Eis lagern.

Sammeln Sie nun die Puppen ein, die injiziert werden sollen. Füllen Sie eine 60 Millimeter große Petrischale mit 10 Milliliter deionisiertem Wasser und überführen Sie mithilfe einer Plastik-Transferpipette etwa 50 hellfarbene Puppen in die Schale. Verwenden Sie ausschließlich leicht pigmentierte Puppen, da Puppen, die bereits mittlere bis dunkle Bräunungsstadien erreicht haben, Schäden am Cuticula erleiden und eine geringe Überlebensrate aufweisen.

Der erste Schritt zur Mikroinjektion besteht darin, die Nadel zu öffnen. Brechen Sie unter dem Mikroskop mit feinen Pinzetten die äußerste Spitze der Nadel ab. Füllen Sie anschließend die Nadel mit Mineralspiritus mit einer 30-Gauge-Nadel und einer Spritze auf.

Nach dem Befüllen wird das überschüssige Öl mit dem Mikroinjektor ausgestoßen. Stellen Sie den Mikroinjektor so ein, dass 69 Nanoliter Volumina aufgezogen werden. Füllen Sie dann die Nadel von vorne mit der vorbereiteten Injektions-RNA auf.

Überprüfen Sie die Abgabe von doppelsträngiger RNA auf Probleme. Verstopfungen in der Spitze und unzureichend befestigte Nadeln sind die Hauptursachen für Probleme. Sobald der Injektor vorbereitet ist, wählen Sie ein bis drei Puppen aus und übertragen Sie sie auf die Filterpapierhalterung.

Mit einem Pinsel die Puppe so ausrichten, dass die dorsale Kutikula zugänglich ist. Durch Andruck auf das Papier wird das überschüssige Wasser an den Puppen absorbiert. Unter gleichbleibender Fixierung der Puppe mit einem feuchten Pinsel die Nadel im Bereich zwischen Abdomen und Thorax in die dorsale Kutikula unter einem Winkel von etwa 30 Grad einsetzen, und zwar von anterior nach posterior.

Dann injizieren Sie ein bis zwei Pulse von doppelsträngiger RNA in den Hämolymphe. Die Verteilung des Farbstoffs im gesamten Körper sollte sichtbar sein, wenn die Injektion erfolgreich war. Während der Injektion der Puppe ist es entscheidend, dass die Nadel nur die dorsale Cuticula durchsticht.

Wenn die Nadelpunktion die ventrale Kutikula durchdringt, wird sich die farbstoffmarkierte Flüssigkeit sichtbar außen am Puppenkörper sammeln oder der Farbstoff auf das Filterpapier übertragen. In solchen Fällen muss die Puppe entsorgt werden. Wenn sich der Farbstoff nicht im gesamten Hämolymphe verteilt, ist die Spitze vermutlich verstopft.

Bewegen Sie die Spitze leicht und prüfen Sie, ob eine Freisetzung von RNA und Farbstoff erfolgt ist. Wenn kein Hinweis auf eine Freisetzung des Farbstoffs vorliegt, entsorgen Sie die Puppe. Überprüfen Sie anschließend die Nadelspitze und führen Sie eine weitere Injektion an einer neuen Puppe durch.

Nach einer erfolgreichen Injektion eines Puppenstadiums verwenden Sie einen feuchten Pinsel, um die Puppe vorsichtig von der Nadel zu lösen, und bringen Sie sie in die Schale mit Wasser, in der sie ihre Entwicklung abschließen wird. Stellen Sie die Schale mit den injizierten Puppen in einen Mückenkäfig oder ein Behältnis unter normalen Zuchtbedingungen. Als Nahrungsquelle für erwachsene Tiere stellen Sie eine 10 %ige (Gewicht pro Volumen) Glucoselösung bereit, die in einen Wattebausch eingeweicht ist.

Nachdem die erwachsenen Insekten geschlüpft sind, vergleichen Sie sie mit Kontrolltieren. Beispielsweise sollten Insekten mit doppelsträngigem SRPN2 täglich auf die Bildung von Pseudotumoren hin überprüft werden. Kühlen Sie dazu die erwachsenen Insekten zwei bis drei Minuten lang auf minus 20 Grad Celsius ab und überführen Sie sie zur Beobachtung auf eine kalte Platte mit zwei Grad Celsius.

Nach der Betrachtung der erwachsenen Tiere diese in den Insektenzuchtbereich zurückbringen. Sobald die Technik beherrscht war, schlüpften injizierte Puppen mit einer Frequenz von etwa 70 %. Bei einer Teilmenge der injizierten Puppen kam es zu einem teilweisen Schlüpfen aus der Puppenhülle, was zu nicht lebensfähigen Mücken führte. Es gab keinen Unterschied in der Schlüpfgeschwindigkeit zwischen injizierten und nicht injizierten Mücken, und die Auswirkungen der Injektion variierten nicht je nach Geschlecht.

Zehn Tage nach dem Schlupf zeigte sich kein bemerkenswerter Unterschied in der Überlebensrate der injizierten Mücken im Vergleich zu den nicht injizierten Kontrollen. Der Serinprotease-Inhibitor SRPN2 diente als positiver Kontrollfaktor, und doppelsträngiges LacZ wurde als negativer Kontrollfaktor für die Injektionen mit doppelsträngiger RNA verwendet. Bereits drei Tage nach dem Schlupf waren Pseudotumore bei den als Erwachsene mit doppelsträngigem SRPN2 Injizierten mittels Lichtmikroskopie erkennbar.

Nach acht Tagen waren Pseudotumore sehr ausgeprägt. Bei adulten Mücken waren melanotische Pseudotumore bei den meisten nach Injektion von doppelsträngigem SRPN2 behandelten Tieren durch das Cuticula sichtbar, während bei den Kontrollen keine Pseudotumore beobachtet wurden. Fünf Tage nach der Injektion waren die SRPN2-Proteinspiegel bei den mit doppelsträngigem SRPN2 injizierten Mücken im Vergleich zu den mit doppelsträngigem LacZ injizierten Kontrollen und den nicht injizierten Kontrollen signifikant niedriger.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Abgabe von RNA-Interferenz-Auslösern in Anopheles gambiae-Puppen mithilfe dieses neu entwickelten Injektionsprotokolls durchführt. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Bewegung der Puppe unvorhersehbar ist. Durch die Einübung der korrekten Positionierung und Stabilisierung der Puppe lässt sich die Erfolgsrate sowie die Qualität der Injektion jedoch erheblich verbessern.

Nachdem Sie die Technik beherrschen, benötigen diese Injektionen etwa 30 Sekunden pro Puppe. Durch die Entwicklung dieser Methode haben wir den Weg dafür geebnet, dass Forschende auf dem Gebiet der Vektorbiologie die Genfunktion während der vorerwachsenen und frühen erwachsenen Entwicklungsstadien im Malariavektor Anopheles gambiae untersuchen und bewerten können. Nach dieser Prozedur können weitere Methoden wie die Western-Blot-Analyse oder die quantitative PCR durchgeführt werden, um das Ausmaß der Zielgen-Reduktion auf Ebene der Protein- beziehungsweise Transkriptexpression zu bestimmen.

Schließlich kann diese Technik dazu beitragen, Gene zu identifizieren, die für die Übertragung von Parasiten durch Mücken entscheidend sind, und dieser Ansatz wird uns helfen, neue Zielstrukturen zu finden und neue Erkenntnisse darüber zu gewinnen, wie wir effektivere Strategien zur Vektorbekämpfung entwickeln können.