RNAi-Trigger Lieferung in Anopheles gambiae Pupae

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Verabreichung von RNA-Interferenzauslösern in Anopheles gambiae, um Gen-Knockdowns zu initiieren, die während des Puppenstadiums der Entwicklung beginnen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Vektorbiologie zu beantworten und Gene aufzudecken, die in den Entwicklungsstadien vor oder im frühen Erwachsenenalter eine Rolle spielen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie den Forschern die Möglichkeit bietet, schnelle funktionelle genomische Studien durchzuführen und mit dem Gen-Knockdown während des Entwicklungsintervalls, dem Puppenstadium, zu beginnen, wenn RNA-Interferenzinjektionsprotokolle in der Vergangenheit nicht implementiert wurden.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Injektionsschritte aufgrund der erforderlichen Präzision und der empfindlichen Natur der Puppen in diesem Entwicklungsstadium schwer zu beherrschen sein können. Identifizieren Sie nach der Auswahl des interessierenden Gens eine Region mit 200 bis 800 Basenpaaren, von der erwartet wird, dass sie keine Off-Target-Effekte aufweist, und führen Sie eine Standard-PCR-Amplifikation durch, um eine doppelsträngige RNA-Synthesevorlage zu erhalten, die von einer T7-Promotorsequenz flankiert wird. Synthetisieren Sie dann die doppelsträngige RNA und reinigen Sie die Produkte mit einem kommerziellen In-vitro-Kit.

Passen Sie die endgültige RNA-Konzentration auf drei Mikrogramm pro Mikroliter an. Verwenden Sie als Nächstes ein Standard-2%-Agarose-Gel, um einen halben Mikroliter der doppelsträngigen RNA mit Template-DNA und Standardmarkern zu vergleichen. Überprüfen Sie nach dem Leerlauf die Qualität und Länge der doppelsträngigen RNA-Bande.

Es sollten keine unspezifischen Produkte sichtbar sein. Die doppelsträngige RNA wandert langsamer als die Matrizen-DNA. Bereiten Sie für die Lagerung doppelsträngige RNA-Aliquote vor und bewahren Sie sie bei minus 20 Grad Celsius auf.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Fast Green FCF-Farbstoffs. Zuerst verdünnen Sie den Farbstoff auf 0,1 Vol.-% in RNase-freiem Wasser. Übertragen Sie dann ein Mikrolitervolumen des Präparats in 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen.

Erhitzen Sie die beladenen Röhren etwa drei Stunden lang bei 65 Grad Celsius, um das Wasser zu verdampfen. Kühlen Sie dann die Tuben mindestens 30 Minuten lang ab, bevor Sie die Farbstoffe verwenden. Bereiten Sie als Nächstes gezogene Glasinjektionsnadeln aus Borosilikatglasröhren vor.

Stellen Sie den Nadelabzieher auf einen Spitzendurchmesser von 10 bis 30 Mikrometern ein. Für einen NARISHIGE Kapillarabzieher stellen Sie die erste Heizung auf 100 und die zweite Heizung auf 70. Klemmen Sie dann die Kapillarnadel ein und fahren Sie mit dem Ziehen fort.

Bereiten Sie nun die Injektionsstation vor. Wählen Sie eine Plattform, die sich leicht unter dem Mikroskop manövrieren lässt. Klebe auf der Plattform zuerst ein dickes Filterpapier fest.

Kleben Sie dann ein dünnes Filterpapier auf das dicke Filterpapier. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter jeder doppelsträngigen RNA, die injiziert werden soll, zu den Farbstoffröhrchen und suspendieren Sie den Farbstoff erneut. Lagern Sie diese Röhren auf Eis.

Sammeln Sie nun die Puppen, die injiziert werden sollen. Füllen Sie eine 60-Millimeter-Petrischale mit 10 Millilitern entionisiertem Wasser und geben Sie mit einer Plastikpipette etwa 50 blassfarbene Puppen in die Schale. Verwenden Sie nur leicht pigmentierte Puppen, da Puppen, die bereits einen mittleren bis dunklen Bräunungsgrad erreicht haben, Schäden an der Nagelhaut erleiden und schlechte Überlebensraten haben.

Der erste Schritt zur Mikroinjektion besteht darin, die Nadel zu öffnen. Brechen Sie unter dem Mikroskop die sehr distale Spitze der Nadel mit einer feinen Pinzette ab. Füllen Sie dann die Nadel mit einer 30-Gauge-Nadel und einer Spritze mit Mineralöl auf.

Nach dem Befüllen das überschüssige Öl mit dem Mikroinjektor ausstoßen. Stellen Sie den Mikroinjektor so ein, dass er 69 Nanoliter Volumen zieht. Füllen Sie dann die Nadel mit der vorbereiteten Injektions-RNA.

Testen Sie die Abgabe von doppelsträngiger RNA auf Probleme. Verstopfungen in der Spitze und unzureichend gesicherte Nadeln sind die Hauptursachen für Probleme. Sobald der Injektor vorbereitet ist, nehmen Sie ein bis drei Puppen heraus und geben Sie sie in die Filterpapierphase.

Richten Sie die Puppe mit einem Pinsel so aus, dass die dorsale Kutikula zugänglich ist. Durch das Drücken auf das Papier wird das überschüssige Wasser auf den Puppen absorbiert. Während Sie die Puppe mit einem feuchten Pinsel ruhig halten, führen Sie die Nadel in einem Winkel von etwa 30 Grad von vorne nach hinten in die dorsale Kutikula zwischen Bauch und Thorax ein.

Injizieren Sie dann ein bis zwei Impulse doppelsträngiger RNA in die Hämolymphe. Die Dispersion des Farbstoffs im ganzen Körper sollte sichtbar sein, wenn die Injektion erfolgreich war. Bei der Injektion der Puppe ist es wichtig, dass die Nadel nur die dorsale Kutikula durchsticht.

Wenn sich die Nadelpunktion durch die ventrale Kutikula erstreckt, ist eine Ansammlung von farbstoffmarkierter Flüssigkeit an der Außenseite der Puppe erkennbar, oder der Farbstoff wird auf das Filterpapier übertragen. In solchen Fällen muss die Puppe entsorgt werden. Wenn sich der Farbstoff nicht in der Hämolymphe verteilt, ist die Spitze höchstwahrscheinlich verstopft.

Bewegen Sie die Spitze leicht und stellen Sie fest, ob eine Freisetzung von RNA und Farbstoff stattgefunden hat. Wenn es keine Anzeichen für eine Farbfreisetzung gibt, entsorgen Sie die Puppe. Beurteilen Sie dann die Spitze der Nadel und führen Sie eine weitere Injektion bei einer neuen Puppe durch.

Nachdem Sie eine Puppe erfolgreich injiziert haben, lösen Sie sie vorsichtig mit dem nassen Pinsel von der Nadel und legen Sie sie in die Schale mit Wasser, wo sie ihre Entwicklung abschließen wird. Stellen Sie die Schale mit den injizierten Puppen unter normalen Aufzuchtbedingungen in einen Mückenkäfig oder -behälter. Für eine Nahrungsquelle für Erwachsene geben Sie Glukose in einer Lösung mit 10 Vol.-%, die in einem Wattebausch eingeweicht wird.

Nachdem die erwachsenen Tiere geschlüpft sind, vergleichen Sie sie mit Kontrollen. Zum Beispiel sollten doppelsträngige SRPN2-Insekten täglich auf Pseudotumorbildung untersucht werden. Dazu kühlen Sie die Erwachsenen zwei bis drei Minuten bei minus 20 Grad Celsius und stellen Sie sie zum Betrachten auf eine zwei Grad Celsius kalte Platte.

Nachdem Sie die erwachsenen Tiere gesehen haben, bringen Sie sie in den Insektenzuchtbereich zurück. Nachdem die Technik gemeistert worden war, schlüpften injizierte Puppen mit einer Häufigkeit von etwa 70 %. In einer Untergruppe der injizierten Puppen kam es zu einem teilweisen Schlüpfen aus dem Puppenfall, was zu nicht lebensfähigen Mücken führte. Es gab keine Verzögerung in der Emergenzrate zwischen injizierten und nicht injizierten Mücken, und die Auswirkungen der Injektion variierten nicht je nach Geschlecht.

Zehn Tage nach dem Schlüpfen gab es keine nennenswerte Veränderung in der Überlebensrate der injizierten Mücken im Vergleich zu den nicht injizierten Kontrollen. Der Serinproteaseinhibitor SRPN2 wurde als Positivkontrolle verwendet, und doppelsträngiges LacZ wurde als Negativkontrolle für doppelsträngige RNA-Injektionen verwendet. Drei Tage nach dem Auflaufen waren Pseudotumoren bei den doppelsträngigen SRPN2-injizierten Erwachsenen lichtmikroskopisch nachweisbar.

Nach acht Tagen waren die Pseudotumoren sehr ausgeprägt. Bei Mücken im adulten Stadium waren melanotische Pseudotumoren durch die Kutikula der meisten doppelsträngigen SRPN2-injizierten Tiere zu beobachten, während bei den Kontrollen keine Pseudotumoren beobachtet werden konnten. Fünf Tage nach der Injektion waren die SRPN2-Proteinspiegel bei doppelsträngigen SRPN2-injizierten Mücken signifikant niedriger als bei doppelsträngigen LacZ-injizierten Kontrollen und nicht injizierten Kontrollen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit diesem neu entwickelten Injektionsprotokoll die Verabreichung von RNA-Interferenztriggern an Anopheles gambiae-Puppen durchführen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der unvorhersehbaren Bewegung der Puppe Schwierigkeiten haben. Das Üben der korrekten Positionierung und Stabilisierung der Puppe erhöht jedoch die Rate der erfolgreichen Injektion sowie die Injektionsqualität erheblich.

Sobald Sie die Technik beherrschen, benötigen diese Injektionen etwa 30 Sekunden pro Puppe. Mit der Entwicklung dieser Technik haben wir den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Vektorbiologie geebnet, um die Genfunktion während der Entwicklungsstadien vor und im frühen Erwachsenenalter beim Malariavektor Anopheles gambiae zu erforschen und zu bewerten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Western-Blot-Analyse oder die quantitative PCR durchgeführt werden, um das Ausmaß des Zielgen-Knockdowns auf der Ebene der Protein- bzw. Transkriptexpression zu bestimmen.

Letztendlich kann diese Technik dazu beitragen, Gene zu identifizieren, die für die Parasitenübertragung durch Mücken entscheidend sind, und dieser Ansatz wird uns helfen, neue Ziele zu identifizieren und neue Erkenntnisse darüber zu liefern, wie wir effektivere Strategien zur Vektorkontrolle entwickeln können.