Ex-vivo-Live-Imaging von Lungenmetastasen und deren Mikromilieu

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, dynamische Stroma-Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Lungenmetastasen sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsmetastasierung zu beantworten, wie z.B. wie Metastasen etabliert werden und welche Zelltypen innerhalb der Mikroumgebung an diesem Prozess beteiligt sind? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine schnelle und einfache Methode für die ex vivo Lungenbildgebung handelt, die die Visualisierung lebender Zellen für mindestens vier Stunden ermöglicht. Diese Technik könnte unser Verständnis der Wirkmechanismen verschiedener zielgerichteter Therapeutika zur Behandlung von Lungenmetastasen erweitert haben. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir Metastasen mittels Lungenschnitt untersuchten und durch dieses Verfahren mit einem weitgehenden Zelltod zu kämpfen hatten. Um die Lunge für die Ex-vivo-Live-Bildgebung vorzubereiten, beginnen Sie damit, die Maus auf einem Styroporschaumdeckel zu immobilisieren, der mit einem Stück Tropftuch bedeckt ist, und sterilisieren Sie das Tier mit 70 % Ethanol. Als nächstes machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen quer verlaufenden epigastrischen Schnitt durch die Haut, gefolgt von einem ähnlichen Schnitt durch das Bauchfell. Bewegen Sie dann das Präparierbrett in eine vertikale Position und schneiden Sie die absteigende Aorta, so dass sich das Blut in den Bauch und nicht in die Brusthöhle sammelt. Schneiden Sie die kleine Öffnung in der Membran ab, um das Vakuum abzulassen. Schneiden Sie dann entlang des Brustkorbs, um das Zwerchfell zu entfernen und die Lunge sichtbar zu machen. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere die Haut bis zur Luftröhre über dem Brustkorb ein, wobei die Rippen intakt bleiben. Trennen Sie dann die Haut vom Brustkorb und entfernen Sie das umgebende Bindegewebe, um die Luftröhre freizulegen, wobei Sie darauf achten müssen, die Luftröhre selbst nicht zu beschädigen. Schneiden Sie eine kleine Öffnung von etwa einem Millimeter Durchmesser in die freiliegende Luftröhre, parallel zu den Knorpelringen, so nah wie möglich am Kehlkopf, ohne die Luftröhre vollständig zu durchtrennen. Führen Sie dann vorsichtig eine 20-Gauge-Nadel vier bis fünf Millimeter in die Luftröhre ein, ohne Gegenkraft. Das Ende der Nadel sollte durch die Luftröhre sichtbar sein. Füllen Sie eine Spritze mit 400 Mikrolitern Agarose bei 37 Grad Celsius und 2 % niedriger Schmelztemperatur und stabilisieren Sie die Nadel dann mit einer Pinzette. Halten Sie das Präparierbrett senkrecht und träufeln Sie langsam die gesamte Menge an warmer Agarose durch die Nadel in die Lunge. Sobald die Lunge aufgeblasen ist, lösen Sie die Spritze, während Sie die Nadel in der Luftröhre halten, und gießen Sie etwa 50 Milliliter 20 Grad Celsius PBS über die Lunge, um die Agarose zu fixieren. Wenn sich die Agarose verfestigt hat, entfernen Sie die Nadel und verwenden Sie eine Pinzette, um die Luftröhre zu verschließen, um das Austreten von nicht verfestigter Agarose zu verhindern. Öffnen Sie nun den Brustkorb weiter durch Sternotomie und fassen Sie die Luftröhre mit einer Pinzette. Schneiden Sie dann mit einer chirurgischen Schere die Luftröhre vollständig durch. Um die Lunge zu entfernen, ziehen Sie die Luftröhre vorsichtig nach oben, schneiden Sie das Bindegewebe und die Speiseröhre ab und ziehen Sie die Lunge vollständig aus der Brusthöhle heraus. Tauchen Sie das Gewebe in 37 Grad Celsius RPMI 1640, um das überschüssige Blut abzuwaschen. Schneiden Sie mit Schere und Pinzette die Lappen ab