Name: Immunfärbung Phospho-Epitope in Ciliated Organe Ganze Berge Zebrafischembryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Lernen Sie die Immunfärbung von Phospho-Epitopen in ganzen Zebrafisch-Embryonen für die Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht die Lokalisierung calciumabhängiger Signalwege in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation Grant IOS-0817658 unterstützt.

Der Zebrafisch Verfahren in diesem Protokoll wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Virginia Commonwealth University genehmigt. 1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> 4% PFA / PBS. Wiegen 8 g Paraformaldehyd (PFA) in der Abzugshaube. Während noch in der Dunstabzugshaube, lösen sich die trockene PFA in ~ 80 ml ​​destilliertem H 2 O unter Rühren und Erwärmen auf 50 ° C. Unter Rühren hinzufügen, 3-10 Tropfen frischer 1 N NaOH bis PFA vollständig gelöst ist und Lösung klärt. Vom Herd nehmen und mit 100 ml 2x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Bringen Volumen auf 200 ml mit destilliertem H 2 O. Abkühlen auf RT und bestätigen pH-Wert von 7,4 vor dem Gebrauch. Lagerung im Dunkeln bei 4 ° C, aber verwenden innerhalb einer Woche. </li><li> Verwenden Sie 100% Methanol ohne Ergänzungen. Verwenden Sie 95% Ethanol ohne Ergänzungen. </li><li> Bereiten Phosphat-gepufferter Tween (PBT). Ergänzen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,1% Tween-20. In 0.5 ml einer 20% igen Tween-20-Stammlösung zu 100 ml 1x PBS. Lagern bei RT. </li><li> Bereiten phosphatgepufferter Triton-X (PBTx). Ergänzen PBS mit 0,1% Triton X-100. 0,5 ml einer 20% Triton X-100 Lager zu 100 ml PBS. Lagern bei RT. </li><li> Bereiten Sie 10% NGS / PBTx. Normales Ziegenserum (NGS) blockiert unspezifische Bindungsstellen. Shop NGS bei -20 ° C. So verwenden, 1 ml bis 9 ml PBTx. </li><li> Vorbereitung 50% Glycerin / PBS. Gründlich mischen zu gleichen Teilen aus 2x PBS und 100% Glycerin. Lagern bei RT. </li></ol> 2. Embryo Fixation <ol><li> . (. ZB β-Actin: CAAX-GFP) Abstammung Erhalten Wildtyp (AB und WIK) oder transgenen Embryos durch natürliche Paarungen. Falls gewünscht, injizieren Embryonen mit Konstrukten oder Morpholinos, wie beschrieben. 15,16 </li><li> Embryonen erhöhen. Sammeln Embryonen und Inkubation bei 28,5 ° C in Gegenwart von 0,003% 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) Pigmentierung zu blockieren, wie beschrieben. 17 </su<html> p&gt; </li><li> Fix. Wenn Embryonen den gewünschten Entwicklungsstadium erreicht haben, 18, &#160; betäuben die Embryonen mit MESAB, entfernen Sie so viel Wasser wie möglich System und fügen Sie frisch 4% PFA / PBS für 3-4 Stunden bei Raumtemperatur. HINWEIS: In Zeiten von weniger als 20 Stunden nach der Befruchtung (HPF), fix vor dechorionation. Manchmal nach 20 HPF, dechorionate vor der Fixierung mit zwei Paaren von feinen Spitze einer Pinzette unter einem Binokular. </li><li> Ändern Lösungen. Transfer-Embryonen eine breite Bohrung Pipette, wie beschrieben. 17 Lösungen wechseln in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Kappe bedeckt, einfach, indem Embryonen durch die Schwerkraft ohne Zentrifugation zu begleichen. </li><li> Post-Fixierungs Nach 3 -. 4 Stunden, entfernen PFA / PBS, ersetzen mit 100% Methanol und bei -20 ° C für mindestens 48 Stunden. HINWEIS: Für maximale P-CaMK-II-Immunreaktivität, begrenzen Gesamt Methanol Lagerzeit bis zu einer Woche. </li></ol>&quot;&gt; 3. Die Immunfärbung Ganze Embryonen <ol><li> Setzen Sie ein Minimum von 10 Embryonen für jede Versuchsbedingung in verschlossenen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, und beschriften. </li><li> Lassen Sie die Embryonen zu regeln. Entfernen und entsorgen Methanol und rehydratisieren mit progressiven wäscht mit 0,5 ml Ethanol-Konzentrationen abnimmt, wie im nächsten Schritt angegeben. Jeder Schritt ist ein 5 min Waschen mit Schaukel. </li><li> Progressiv mit diesen 5 Lösungen rehydriert: 66% Ethanol / 33% PBTx, 33% Ethanol / 66% PBTx 100% PBTx 100% PBTx (dies ist die erste Wiederholung PBTx), 100% PBTx (dies ist die zweite Wiederholung von PBTx). </li><li> Entfernen letzten PBTx waschen. 0,5 ml 10% NGS / PBTx. mindestens 1 Stunde bei RT inkubieren unter leichtem Schütteln und dann entfernen und Lösung verwerfen. </li><li> Bereiten primären Antikörperlösung durch in 10% NGS / PBTx verdünnen. Wenn Co-Immunfärbung verwenden höhere Affinität Antikörper zuerst. 500: mit der Maus anti-acetylierten Antikörper Tubulin monoklonalen verdünnt 1 Für diese Studie inkubiert. für example, wenn 10 Proben sind, kombinieren 6 ul der Stammantikörperlösung mit 3 ml 10% NGS / PBTx und dann 0,3 ml davon in jedes Röhrchen verteilt. </li><li> Hinzufügen 0,2-0,5 ml der verdünnten primären Antikörpers zu jedem Röhrchen alle Embryonen einzutauchen. Inkubieren unter leichtem O / N bei RT zu schaukeln. </li><li> Am Morgen, zu entfernen und Antikörperlösung zu verwerfen. 0,5 ml 2% NGS / PBTx überschüssigen primären Antikörpers weg zu waschen. Sanft für 5 min schaukeln. Entfernen und entsorgen Lösung. Zweimal wiederholen. </li><li> Dim Lampen oder verdünnen Sie den entsprechenden fluoreszenz konjugierten sekundären Antikörper in 10% NGS / PBTx so dass jeder Zustand mindestens 0,5 ml enthält. Mit der Maus-Anti-acetyliertes Tubulin primärer Antikörper, verwenden Sie die grün-fluoreszierenden Farbstoff Ziegen-Anti-Maus-IgG bei einer 1: 500-Verdünnung. </li><li> Inkubieren sekundären Antikörper für 4 Stunden unter leichtem im Dunkeln bei RT Schaukel. Von nun an Verfahren die Proben unter gedämpftem Licht und in einem dunklen Behälter brüten oder in Alufolie wickeln. </li><li>Am Ende der Inkubation entfernt und die sekundäre Antikörperlösung verwerfen. 0,5 ml 2% NGS / PBTx zu waschen. Sanft für 5 min schaukeln. Entfernen und entsorgen Lösung. Zweimal wiederholen. </li><li> Wenn Co-Immunfärbung, erhalten den zweiten primären Antikörper von einer anderen Spezies als der ersten primären Antikörper. In diesen Studien, folgen Sie dem Kaninchen-Anti-phospho CaMK-II-Antikörper von der rot-fluoreszierenden Farbstoff-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörpers. </li><li> Verdünnen Kaninchen-Anti-phospho CaMK-II-Antikörper 1.20. Für jedes Röhrchen von Embryonen, in 0,3 ml 10% NGS / PBTx aussetzen, dann 15 ul der Stammantikörperlösung hinzuzufügen. </li><li> Stellen Sie sicher, dass Embryonen werden eingetaucht und Lichter gedimmt werden. Inkubieren unter leichtem O / N bei RT im Dunkeln zu schaukeln. </li><li> Am Morgen unter der gedämpften Beleuchtung entfernen und Antikörperlösung zu verwerfen. 0,5 ml 2% NGS / PBTx. Sanft für 5 min schaukeln. Entfernen und entsorgen Lösung. Zweimal wiederholen. </li><li> Halten Overhead Lichter dimmen und verdünnen genug von dem entsprechenden fluoreszenz conjugated sekundären Antikörper, so dass jeder Zustand mindestens 0,5 ml. In dieser Studie wurden die verdünnten roten Fluoreszenzfarbstoff-konjugiertes Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper (roter Kanal) 1: 500 in 10% NGS / PBTx. </li><li> Inkubieren zweiten sekundären Antikörper für 4 Stunden mit sanften im Dunkeln bei RT zu schaukeln. </li><li> Am Ende dieser Inkubation und unter der gedämpften Beleuchtung ist zu entfernen und die sekundäre Antikörperlösung zu verwerfen. 0,5 ml PBTx. Sanft für 5 min schaukeln. Entfernen und entsorgen Lösung. Zweimal wiederholen. Speicher in entweder PBTx oder 50% Glycerin / PBS in Abhängigkeit von dem Bildgebungsverfahren. </li></ol> 4. Die konfokale Fassung und -verarbeitung <ol><li> Berg Embryonen für die Bildgebung. Zeigen 1-5 Embryonen auf einem Glasträger. Erstellen einer Kammer zwischen dem Hauptdeckglas und dem Objektträger unter Verwendung von Deckglas-Fragmente auf jeder Seite der Kammer. Typischerweise werden vier # 1 Deckgläser verwendet, um diese Abstandshalter Stapel zu machen, ohne zu verkleben. HINWEIS: Keine Montage Medium notwendig. </li><li> Verwenden Sie eine 100X ÖlimmersionZiel einzigen Embryo in den Fokus Durchlicht zu bringen. Schalten Sie Licht. Schalten Sie konfokalen Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass geeignete Laser (grün und / oder rot) eingeschaltet sind und Remote-Fokus Mithelfer eingreift. </li><li> Schalten Sie den konfokalen Programm. In der &quot;Acquire Bar&quot;, die richtige Ziel wählen. In der &quot;XY Basic&quot; Bar, setzen die Bildgröße auf 1.024 von den 1.024 Button. </li><li> In der &quot;Laser und Detektor&quot; Leiste klicken Sie auf den roten 488-Box und dem grünen 568 Feld Laser und Detektor für jeden Kanal zu schalten. Stellen Pinhole bis mittelgroß und passen Sie die Verstärkung in der &quot;Gain&quot; Bar jeder Kanal zu visualisieren. </li><li> Im &quot;Einstellungen Acquire&quot; Leiste auf &quot;Live&quot; Erfassung von Bildern zu beginnen. In der &quot;Einstellungen anzeigen&quot; Bar, deaktivieren Sie die &quot;Force Integral Zoom&quot; Box-Center in der &quot;Live&quot; -Fenster. </li><li> In der &quot;Einstellungen abrufen&quot; bar unter dem &quot;Z&quot; Registerkarte Schritt durch die Schichten des Bildes. Nach der Auswahl der number optischer Schnitte in das Bild zu übernehmen, in der &quot;Mitte&quot; der z-Ebene bis zu einem gewissen Punkt. </li><li> Im Rahmen der &quot;Z&quot;, klicken Sie das kleine rote &quot;Reference&quot; ein. Dadurch wird die RFA an dem Punkt Null, wenn die &quot;Mitte&quot; gewählt. Im Feld &quot;Schrittweite&quot; bezeichnet, wählen Sie die Dicke der Schichten (zwischen 0,25 &amp; mgr; m und 2,0 &amp; mgr; m ist ideal). Achten Sie auf das &quot;File Size&quot; ein und versuchen zu 1 GB zu begrenzen. HINWEIS: In der Regel bis zu 40 optische Schnitte von 0,5 bis 1,0 &amp; mgr; m erhalten werden, aber die Anzahl der Abschnitte können empirisch bestimmt werden. </li><li> Um die oben extreme des Bildes zu finden, klicken Sie auf den Kreis neben &quot;Top&quot; und bewegen sich durch die z-Schichten. Jetzt den Kreis klicken Sie neben &quot;Unten&quot;, nimmt der Computer das Bild wieder in der Schicht als Zentrum. bewegen wieder durch die Schichten der unteren extremen des Bildes zu finden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Live&quot; wieder in den &quot;Einstellungen abrufen&quot; Feld des Lasers zu stoppenErwerb. In diesem Fenster klicken Sie auf die roten Kisten etikettiert Durchschnitt und Z-Stapel. Diese Boxen wird grün. </li><li> In der &quot;Einstellungen abrufen&quot; ein, klicken Sie auf &quot;Single&quot; das ganze Reihe von Bildern zu erwerben. Sie können den Fortschritt überwachen, da es in beiden Kanälen durchsucht und durch die gesamte Z-Stapel. </li><li> Zu speichern, klicken Sie auf das Fenstervolumen und klicken Sie auf &quot;Speichern unter&quot; und den Dateinamen. Speichern als &quot;.ids&quot; -Datei. Um die Lautstärke zu machen, die Datei während der Z-Stapel noch geöffnet ist, wählen Sie das Menü Daten nach unten ziehen und klicken Sie auf &quot;Volumen machen&quot;. Speichern Sie die gerenderte Datei als TIFF-Datei. Dies ist das projizierte Bild, das in dieser Veröffentlichung dargestellt sind. </li></ol>

<ol><li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling during embryonic development.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).</li>
<li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+signalling+and+early+embryonic+patterning+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).</li>
<li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+at+fertilization+and+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium at fertilization and in early development.</a> Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).</li>
<li>Yuen, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Ca%282%2B%29+signaling+in+the+external+yolk+syncytial+layer+during+the+late+blastula+and+early+gastrula+periods+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).</li>
<li>Tombes, R. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+free+calcium+and+mitosis+in+mammalian+cells%3A+anaphase+onset+is+calcium+modulated%2C+but+is+not+triggered+by+a+brief+transient%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient.</a> J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).</li>
<li>Hudmon, A., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Ca2%2B%2FCalmodulin-Dependent+Protein+Kinase+II%3A+The+Role+of+Structure+and+Autoregulation+in+Cellular+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).</li>
<li>Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+Evolution+of+Multifunctional+Ca2%2B%2FCaM-dependent+Protein+Kinase+%28CaMK-II%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II).</a> Gene. 322, 17-31 (2003).</li>
<li>Braun, A. P., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Multifunctional+Calcium%2FCalmodulin-Dependent+Protein+Kinase%3A+From+Form+to+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function.</a> Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).</li>
<li>Rich, R. C., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-directed+function+of+calmodulin+in+autophosphorylation+of+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II.</a> J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).</li>
<li>Rothschild, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx5-mediated+expression+of+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II+is+necessary+for+zebrafish+cardiac+and+pectoral+fin+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis.</a> Dev Biol. 330, 175-184 (2009).</li>
<li>Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+CaMK-II+genes+during+early+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis.</a> Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).</li>
<li>Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activation+of+membrane+targeted+CaMK-II+in+the+zebrafish+Kupffer%27s+vesicle+is+required+for+left-right+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry.</a> Development. 137, 2753-2762 (2010).</li>
<li>Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMK-II+is+a+PKD2+target+that+promotes+pronephric+kidney+development+and+stabilizes+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia.</a> Development. 138, 3387-3397 (2011).</li>
<li>Rothschild, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMK-II+activation+is+essential+for+zebrafish+inner+ear+development+and+acts+through+Delta-Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling.</a> Dev Biol. 381, 179-188 (2013).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , e1113(2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. , e1115(2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio)</a>. , University of Oregon Press. (1993).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Obara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystin-2+immunolocalization+and+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+whole+mount+in+situ+hybridization+within+zebrafish+embryos+to+study+gene+expression+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function.</a> J Vis Exp. , e50644(2013).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature. 3, 59-69 (2008).</li>
<li>Harris, P., Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+tubulin-containing+structures+in+the+egg+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus+from+fertilization+through+first+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage.</a> J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die PFA / Methanol-Verfahren wurde in diesem Labor mit dem vorrangigen Ziel der Optimierung der Immun des Phospho-T 287 -CaMK-II-Epitop während Zebrabärblingentwicklung entwickelt. Diese Methode erfolgreich P-CaMK-II bei der Bildung von mehreren ciliated Organe, einschließlich Zebrafisch KV, 12 Innenohr 14 und Niere. 13 besonders am KV Stufe diese Technik notwendig war, lokalisiert. Der Erfolg dieses Verfahrens ist wahrscheinlich auf eine Kombination von a) Minimierung von Aut...

Die hier beschriebenen Techniken sind das Ergebnis von Studien, die versucht haben, nachgelagerte Ziele von Ca2+-Signalen während Ereignissen zu definieren, die während der frühen Entwicklung auftreten, einschließlich Befruchtung, Gastrulation, Somitogenese und Rumpf-, Augen-, Gehirn- und Organbildung. 1-3 Die ursprünglichen Entdeckungen der embryonalen Ca2+-Signalgebung hingen von der Verwendung natürlicher und manipulierter Ca2+-Indikatoren wie Aequorin4 und Fura-2 ab. 5 Selbst mit dem derzeitigen Stand der Technik erfordert die Detektion von transienten Erhöhungen von Ca2+ umständliche Analysewerkzeuge und verrät nicht die Ziele solcher Ca2+-Signale. 
Dieses Labor untersucht Ca2+-Signale, die über die Ca2+/Calmodulin-abhängige (multifunktionale) Proteinkinase wirken, die als CaMK-II bekannt ist, ein Enzym, das im Zentralnervensystem angereichert ist und ursprünglich als Regulator der Langzeitpotenzierung identifiziert wurde. 6 CaMK-II ist nicht gehirnspezifisch, wird weit verbreitet exprimiert und ist über die gesamte Lebensspanne und den Körper von Arten im gesamten Tierreich, einschließlich wirbelloser Tiere, hochkonserviert. 7,8 CaMK-II hat die einzigartige Fähigkeit, seine eigene Aktivität auch dann aufrechtzuerhalten, wenn der Ca2+-Spiegel aufgrund seiner Fähigkeit, bei Thr287 zu autophosphorylieren, abgenommen hat. In diesem autophosphorylierten Zustand bleibt CaMK-II in einer Ca2+/CaM-unabhängigen Weise aktiv, bis es dephosphoryliert ist. 6 Somit kann die Lokalisation von phosphoryliertem CaMK-II (Thr287) Zellen identifizieren, in denen natürliche, relevante Ca2+-Erhöhungen aufgetreten sind. 
Ein Antikörper gegen autophosphoryliertes (P-Thr287) Säugetier-CaMK-II wurde gut charakterisiert und ursprünglich zur Lokalisierung von aktiviertem CaMK-II im Hirngewebe verwendet. 9 Zebrafische (Danio rerio) besitzen sieben CaMK-II-Gene10,11, deren Proteinprodukte in dieser Region eine Sequenz von MHRQE[pT287]VECLK enthalten. 10,11 Diese Sequenz ist dem Phosphopeptid-Antigen, das zur Herstellung dieses polyklonalen Kaninchen-Antikörpers (MHRQE[pT]VDCLK; Upstate/Millipore) und daher war es nicht völlig überraschend, dass dieser Antikörper mit dem Zebrafisch CaMK-II kreuzreagierte. In diesem Labor konnte gezeigt werden, dass dieser Antikörper mit Zebrafisch CaMK-II proportional zur Autophosphorylierung und Ca2+/CaM-unabhängigen Aktivität reagiert. 12 Es wurde auch gezeigt, dass zusätzliche pan-spezifische CaMK-II-Antikörper mit Zebrafisch-CaMK-II kreuzreagieren. 13
Dieser Antikörper wurde verwendet, um zu zeigen, dass Zebrafisch-CaMK-II bevorzugt in Zellen auf einer Seite des Zebrafisch-Kupffer-Vesikels (KV) aktiviert wird, dem Flimmerorgan, das für die Etablierung der Links/Rechts-Asymmetrie notwendig ist. 12 Dieser Antikörper wurde verwendet, um zu zeigen, dass CaMK-II in vier benachbarten Zellen auf der linken Seite des KV während genau derselben Entwicklungsphase, in der die Organpositionierung bestimmt wird, vorübergehend aktiviert wird. 12 Zusätzlich zum Kupffer-Vesikel (KV) befand sich autophosphoryliertes (P-T287) auch an spezifischen intrazellulären Stellen in anderen Flimmergeweben wie der Niere, den Neuromasten und dem Innenohr. 12,13 In der Zebrafischniere istP-T 287-CaMK-II entlang der apikalen Grenze der Flimmerdrüsenzellen und innerhalb der kloakalen Flimmerhärchen angereichert, wo es deren Anordnung beeinflusst. 13 Schließlich ist P-T 287-CaMK-II im sich entwickelnden Innenohr stark an der Basis der Zilien konzentriert und beeinflusst die Zelldifferenzierung über den Delta-Notch-Signalweg. 14 Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Nachweis von aktiviertem CaMK-II die Stellen der intrazellulären Ca2+-Freisetzung lokalisiert und potentiell neue Signalwege beleuchtet hat.
Diese Entdeckungen hingen vollständig von der Entwicklung einer sensitiven und genauen Methode zur Lokalisierung von aktiviertem (P-T 287-autophosphoryliertem) CaMK-II ab. Es werden die Methoden zur Fixierung und Immunfärbung des Zebrafisch-KV, der Niere und des Innenohrs beschrieben. Auch die Grenzen dieser Technik werden beschrieben. Diese Techniken sollten für jeden Forscher nützlich sein, der während der frühen Entwicklung von Wirbeltieren hochauflösende Bilder in zwei Fluoreszenzkanälen nicht nur von Phospho-Epitopen, sondern von jedem Epitop erhalten möchte.

<table><tbody><tr><td>1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P-7629</td><td>0,12 % Stammlösung. 1:40 in Systemwasser verdünnen</td></tr><tr><td>Alexa488 Anti-Maus IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>Ziege polyklonal, verwenden bei 1:500</td></tr><tr><td>Alexa488 Anti-Kaninchen IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>Ziege polyklonal, verwenden bei 1:500</td></tr><tr><td>Alexa488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td>Bindet bevorzugt an F-Aktin</td></tr><tr><td>Alexa568 Anti-Maus IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11004</td><td>Ziegenpolyklonal, verwenden bei 1:500</td></tr><tr><td>Alexa568 anti-Kaninchen IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>Ziege polyklonal, verwenden bei 1:500</td></tr><tr><td>anti-acetyliert &#945;-Tubulin</td><td>Sigma</td><td>T7451</td><td>Maus monoklonal, verwenden bei 1:500</td></tr><tr><td>anti-phospho-T287 CaMK-II</td><td>EMD Millipore</td><td>06-881</td><td>Kaninchen polyklonal, verwenden bei 1:20</td></tr><tr><td>anti-gesamt CaMK-II</td><td>BD Biosciences</td><td>611292</td><td>Maus monoklonal, Verwendung bei 1:20</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>S96857</td><td>Laborqualität, 95% denaturiert</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Glasdeckgläser</td><td>VWR</td><td>16004-330</td><td>#1&nbsp; Dicke</td></tr><tr><td>Glasobjektträger</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>Standard Glasobjektträger</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A411</td><td>Im Gefrierschrank aufbewahren</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td>Röhrchen mit Deckel, nicht steril</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td>Aliquot 1 ml Röhrchen, im Gefrierschrank</td></tr><tr><td>aufbewahren Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P-6148</td><td>Reagenzqualität, kristallin</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Qualität Biologisch</td><td>119-069-131</td><td>10x Stammlösung oder im Labor hergestellt</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>BP-151</td><td>10% ige Lösung in Wasser, lagern bei RT</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Life Technologies</td><td>85113</td><td>10% ige Lösung in Wasser, lagern bei RT</td></tr><tr><td>Verbundmikroskop</td><td>Nikon</td><td>E-600</td><td>Halterung auf vibrationsfreiem Tisch</td></tr><tr><td>C1 Plus Zwei-Laser-Scanning konfokal</td><td>Nikon</td><td>C1 Plus</td><td>Läuft durch das EZ-C1-Programm, aber Upgrades verwenden " Elemente"</td></tr></tbody></table>

immunfärbung phospho-epitope in ciliated organe ganze berge zebrafischembryonen

Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

Die schnelle Proliferation von Zellen, die gewebespezifische Expression von Genen und die Entstehung von Signalisierungsnetze charakterisieren frühen embryonalen Entwicklung aller Wirbeltiere. Die Kinetik und die Lage der Signale - auch innerhalb einzelner Zellen - in den sich entwickelnden Embryo ergänzt die Identifizierung wichtiger Entwicklungsgene. Immunfärbung Techniken beschrieben, die die Kinetik der intrazellulären und ganzen Tier Signalen in Strukturen so klein wie primäre Zilien definieren abgebildet wurden. Die Techniken zur Fixierung, Imaging und Bearbeitung von Bildern mit einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskops verwendet, kann in nur 36 Stunden abgeschlossen sein. Zebrafisch (Danio rerio) ist eine wünschenswerte Organismus für Forscher, die versuchen, Studien in einem Wirbeltierarten durchzuführen, die erschwinglich und relevant für die menschliche Krankheit. Genetic Knockouts oder Niederschlägen muss durch den Verlust der tatsächlichen Proteinprodukt bestätigt. Eine solche Bestätigung von Proteinverlustwerden können unter Verwendung der hier beschriebenen Techniken erreicht. Clues der Signalwege kann auch durch Verwendung von Antikörpern entschlüsselt werden, der mit Proteinen reaktiv sind, die durch Phosphorylierung posttranslational modifiziert wurden. Die Erhaltung und die phosphorylierten Zustand eines Epitops Optimierung ist daher entscheidend für diese Bestimmung und wird von diesem Protokoll erreicht. Diese Studie beschreibt Techniken Embryonen während der ersten 72 Stunden der Entwicklung und zu beheben eine Vielzahl von relevanten Epitope mit Zilien in das Vesikel (KV), die Nieren und das Innenohr des Kupffer co-lokalisieren. Diese Verfahren sind einfach, nicht Dissektion erforderlich und kann in einer relativ kurzen Zeitspanne abgeschlossen werden. Projizieren konfokale Bildstapel zu einem einzigen Bild ist ein nützliches Mittel, um diese Daten zu präsentieren.

Optimale Bedingungen für die Visualisierung von Phospho-Epitope Methoden, um die Immun von Protein-Epitope in Zebrafischembryonen beschrieben haben relativ spärlich gewesen im Vergleich zu denen für mRNAs über in-situ-Hybridisierung zu lokalisieren. Fixiermittel bei der Lokalisierung von Protein-Epitope in Geißelzellen des Zebrafischembryonen verwendet haben 4% PFA / PBS und Dent Fixierungsmittel enth...

Es sind Techniken beschrieben Phospho-Epitope in ganz Zebrafischembryonen zu Immunfärbung und dann leiten zweifarbige Leuchtstoff konfokalen Lokalisierung in zellularen Strukturen so klein wie primäre Zilien. Die Techniken zur Fixierung und Bildgebung können die Position und die Kinetik des Erscheinens oder Aktivierung spezifischer Proteine ​​definieren.

Immunfärbung Phospho-Epitope in Ciliated Organe Ganze Berge Zebrafischembryonen

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Proteine im Zebrafischembryo zu immunlokalisieren, die aktiviert sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Entwicklungs- und Zellbiologie zu beantworten, beispielsweise nach der Lokalisation und Aktivierung phosphorylierter Proteine im gesamten Embryo. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass man calciumabhängige Signalwege im gesamten Embryo durch Immunfärbung von durch Calcium aktivierte Proteine lokalisieren kann.Nachdem wilde oder transgene Embryonen gemäß dem Textprotokoll gewonnen wurden, 0,003 % PTU zu den Embryonen im Systemwasser hinzufügen, um die Pigmentierung zu blockieren, und bis zum gewünschten Entwicklungsstadium inkubieren. Wenn die Embryonen das richtige Stadium erreicht haben, MESAB der Schale zugeben, um die Fische zu betäuben. Sobald die Fische betäubt sind, so viel Systemwasser wie möglich entfernen und anschließend frisches 4 % PFA in PBS hinzufügen und drei bis vier Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.Nach der Inkubation das PFA entfernen und es durch 100 % Methanol ersetzen. Anschließend die Embryonen für mindestens 48 Stunden bei minus 20 Grad Celsius lagern. Um di

immunostaining-phospho-epitopes-ciliated-organs-whole-mount-zebrafish

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Whole mount in situ Hybridisierung ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken in der Entwicklungsbiologie. Hier präsentieren wir ein hochauflösendes Doppel-Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung Protokoll zur Analyse der genauen Expressionsmuster eines einzelnen Gens und zur Bestimmung der Überlappung der Ausdruck Domains von zwei Genen. Wir gehören eine Propidiumiodid nukleare Gegenfärbung des Gewebes Organisation hervorzuheben.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Eine schnelle Weg zur Immunfärbung von Zebrafisch-Embryonen Herzen Verhalten beschrieben wird. Im Vergleich zu der ganze Berg Immunfärbung Ansatz, diese Methode drastisch erhöht die Penetration der Antikörper, die die Erzielung einer hohen Auflösung, dass zelluläre / subzelluläre Strukturen offenbaren sich im Herzen innerhalb von einer deutlich reduzierten Bearbeitungszeit ermöglicht.

Immunfärbung von Dissected Zebrafisch embryonale Herz

Immunolabeling Methoden für die unterschiedliche Populationen von Mikrotubuli in das sich entwickelnde Gehirn Zebrafisch Analyse werden hier beschrieben, die sind breit anwendbar auf andere Gewebe. Das erste Protokoll beschreibt eine optimierte Methode für Immunolabeling stabile und dynamische Mikrotubuli. Das zweite Protokoll stellt eine Methode zum Bild und speziell im Entstehen begriffenen Mikrotubuli zu quantifizieren.

Verwendung von Immunolabeling, stabilen, dynamischen und im Entstehen begriffene Mikrotubuli in Zebrafish Embryos zu analysieren

Zilien Entwicklung ist wichtig, richtige Organogenese. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zum Beschriften und ciliated Zellen der Zebrafisch zu visualisieren.

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

Präsentiert sind hier Protokolle für die immunhistochemische Charakterisierung und Lokalisierung von Orexin-Peptid, Orexin-Rezeptoren, und Endocannabinoid-Rezeptoren im Darm und Gehirn von normalen und Diät-induzierten Adipositas (DIO) erwachsene Zebrafisch-Modelle mit Immunperixidase und Doppelimmunfluoreszenzmethoden.

Identifizierung von Orexin- und Endocannabinoidrezeptoren bei erwachsenen Zebrafischen mit Immunoperoxidase und Immunfluoreszenzmethoden

Dieses Protokoll demonstriert sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an Kryosektionen von Zebrafischembryonen im Frühstadium, die präzise Kolokalisierungsanalysen in bestimmten Zellpopulationen ermöglichen.

Sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an kryosektionierten Zebrafisch-Embryonen

Hier stellen wir ein Protokoll zum fluoreszierenden Antikörper-vermittelten Nachweis von Proteinen in ganzen Präparaten von Zebrafischembryonen und Larven vor.

Ganzer Berg Immunhistochemie in Zebrafisch Embryonen und Larven

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bilder durch die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie von Zebrafisch-Embryonalschnitten erhalten werden können. Vor der Kryosektion wurde eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von einer Antikörperfärbung. Es ist nützlich, die Expressionsmuster zweier Gene im Zebrafisch nachzuweisen, wenn ein Mangel an Antikörpern vorliegt.

In situ Hybridisierung kombiniert mit Immunhistochemie in kryogeschnittenen Zebrafischembryonen

Wir stellen die Technik vor, um Zink-Isotopenverhältnisse in Mausorganen mit hoher Präzision zu messen.

High Precision Zink Isotopenmessungen an Maus-Orgeln Angewandte

Phosphoinositiden signalisieren Lipide, deren relative Häufigkeit schnell ändert als Reaktion auf verschiedene Reize. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um die Fülle der Phosphoinositiden Messung durch metabolisch Markierung von Zellen mit 3 H-myo-Inositol, gefolgt von Extraktion und Deacylierung. Extrahiert glycero-inositides werden dann durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie getrennt und durch Strömungs Szintillations quantifiziert.

Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla

Lernen Sie die Immunfärbung von Phospho-Epitopen in ganzen Zebrafisch-Embryonen für die Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht die Lokalisierung calciumabhängiger Signalwege in vivo.

Immunfärbung Phospho-Epitope in Ciliated Organe Ganze Berge Zebrafischembryonen

Weitere Videos entdecken