Immunfärbung Phospho-Epitope in Ciliated Organe Ganze Berge Zebrafischembryonen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Proteine zu immunlokalisieren, die im Zebrafischembryo aktiviert werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Entwicklungs- und Zellbiologie zu beantworten, wie z.B. die Lokalisierung und Aktivierung von phosphorylierten Proteinen in einem ganzen Embryo. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass man die kalziumabhängige Signalübertragung in einem ganzen Embryo lokalisieren kann, indem man Proteine immunfärbt, die durch Kalzium aktiviert werden.

Nach der Gewinnung von Wildtyp- oder transgenen Embryonen gemäß dem Textprotokoll fügen Sie den Embryonen 0,003%PTU in Systemwasser hinzu, um die Pigmentierung zu blockieren und bis zum gewünschten Entwicklungsstadium zu inkubieren. Wenn die Embryonen das richtige Stadium erreicht haben, fügen Sie MESAB in die Schüssel hinzu, um den Fisch zu betäuben. Sobald die Fische betäubt sind, entfernen Sie so viel Systemwasser wie möglich, fügen Sie dann frisches 4%PFA und PBS hinzu und inkubieren Sie drei bis vier Stunden lang bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie nach der Inkubation das PFA und verwenden Sie 100 % Methanol, um es zu ersetzen. Lagern Sie die Embryonen dann mindestens 48 Stunden lang bei minus 20 Grad Celsius. Um eine Immunfärbung durchzuführen, legen Sie mindestens 10 Embryonen für jede Versuchsbedingung in markierte 1,5-Millimeter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Wenn sich die Embryonen am Boden des Röhrchens abgesetzt haben, entfernen und verwerfen Sie das Methanol und verwenden Sie progressive Waschungen mit abnehmenden Ethanolkonzentrationen in PBTx, um die Embryonen zu rehydrieren. Entfernen Sie die letzte PBTx-Wäsche und fügen Sie 0,5 Milliliter 10% normales Ziegenserum oder NGS in PBTx hinzu. Dann mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln inkubieren.

Als nächstes entfernen Sie die Lösung und fügen Sie 0,2 bis 0,5 Milliliter einer Verdünnung von 1 zu 5 des monoklonalen Anti-Acetyl-Tubulin-Antikörpers der Maus und 10 % NGS und PBTx hinzu. Inkubieren Sie die Embryonen unter leichtem Schaukeln bei Raumtemperatur über Nacht. Entfernen und entsorgen Sie morgens den Antikörper und führen Sie drei Waschgänge mit 0,5 Millilitern 2%NGS und PBTx durch, wobei Sie jeweils fünf Minuten lang leicht geschaukelt werden.

Dimmen Sie die Deckenlampen und fügen Sie 500 Mikroliter zu jeder Probe einer Verdünnung von 1 zu 500 fluoreszierend konjugierten Sekundärantikörpern in 10 %NGS und PBTx hinzu. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für vier Stunden unter leichtem Schaukeln. Waschen Sie die Embryonen nach der Inkubation dreimal.

Zur Co-Immunfärbung fügen Sie eine Verdünnung von 1 zu 20 Anti-Phospho-CaMKII-Antikörper hinzu. Inkubieren Sie im Dunkeln mit leichtem Schaukeln über Nacht. Am nächsten Morgen, nachdem Sie die Embryonen dreimal mit 2%NGS und PBTx gewaschen haben, fügen Sie eine 1:5-Verdünnung von rotem 568 fluoreszierendem konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG und 10%NGS und PBTx hinzu.

Nach einer vierstündigen Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur waschen Sie die Embryonen dreimal und lagern Sie sie je nach bildgebendem Verfahren in PBTx oder 50%igem Glycerin in PBS. Um die Embryonen für die Bildgebung zu montieren, legen Sie ein bis fünf Embryonen auf einen Objektträger. Verwenden Sie vier gestapelte Deckglasfragmente auf beiden Seiten des Fisches, um eine Kammer zu schaffen.

Und legen Sie ein Deckglas darauf. Mit der 100-fachen Öl-Immersionslinse und Durchlicht bringen Sie einen einzelnen Embryo in den Fokus. Schalten Sie das Licht aus.

Schalten Sie das Konfokalmikroskop mit den entsprechenden Lasern ein und aktivieren Sie den Fernfokus. Öffnen Sie das konfokale Programm und wählen Sie in der Erfassungsleiste das richtige Ziel aus. Klicken Sie dann in der XY-Basisleiste auf die Schaltfläche 1024, um die Bildgröße einzustellen.

Klicken Sie in der Laser- und Detektorleiste auf die roten Felder 488 und 568, um den Laserdetektor für jeden Kanal einzuschalten und die Lochblende auf mittel zu stellen. Passen Sie dann in der Verstärkungsleiste die Verstärkung für jeden Kanal an, um ihn zu visualisieren. Klicken Sie anschließend in der Leiste für die Erfassungseinstellungen auf Live, um mit der Aufnahme von Bildern zu beginnen.

Deaktivieren Sie in der Ansichtseinstellungsleiste das Kontrollkästchen Integrierten Zoom erzwingen, um ihn im Live-Fenster zu zentrieren. Durchlaufen Sie in der Leiste für die Erfassungseinstellungen auf der Registerkarte Z die Ebenen des Bildes. Nachdem Sie die Anzahl der Ebenen ausgewählt haben, die in das Bild integriert werden sollen, bewegen Sie sich zu einem Punkt in der Mitte der Z-Ebene.

Klicken Sie auf der Registerkarte Z auf das kleine rote Referenzfeld. Dadurch wird die RFA an dem Punkt, der als Mittelpunkt ausgewählt wurde, auf Null gesetzt. Wählen Sie im Feld mit der Bezeichnung Schrittweite die Dicke der Ebenen aus.

Achten Sie auf das Feld für die Dateigröße und versuchen Sie, die Dateien auf ein Gigabyte zu begrenzen. Um das obere Ende des Bildes zu finden, klicken Sie auf den Kreis neben dem oberen Rand und bewegen Sie sich durch die Z-Ebenen. Klicken Sie nun auf den Kreis neben unten und der Computer nimmt das Bild zurück in die Mitte der Ebene.

Klicken Sie dann im Feld für die Erfassungseinstellungen erneut auf Live, um die Lasererfassung zu stoppen. Klicken Sie in diesem Bereich auf die roten Felder mit der Bezeichnung "Durchschnitt" und "Z-Stapel". Diese Felder werden grün.

Klicken Sie im Feld "Einstellungen erfassen" auf "Einzeln", um die gesamte Bildserie zu erfassen. Überwachen Sie den Fortschritt beim Scannen in beiden Kanälen und über den gesamten Z-Stack. Klicken Sie zum Speichern auf das Volume-Fenster und dann auf Speichern unter und benennen Sie die Datei.

Um die Datei zu rendern, während der Z-Stapel noch geöffnet ist, wählen Sie das Daten-Pulldown-Menü aus und klicken Sie auf Volumen-Rendering. Speichern Sie die gerenderte Datei als Punkt-TIF-Datei. Diese Abbildung zeigt die Immunfärbung von P-CaMKII und acetyliertem Tubulin, das ein Standardmarker für Zilien im Kuppfer-Vesikel oder KV des Zebrafisches ist. Die Fütterung primärer Zilien erzeugt einen zirkulären Flüssigkeitsfluss, der zu einer Erhöhung des Kalziumspiegels in den Flimmerzellen, die das KV auskleiden, und zur Aktivierung von CaMKII an diskreten Stellen führt, wie hier zu sehen.

Diese Abbildungen zeigen P-CaMKII, wie es auf der apikalen Oberfläche von Flimmerzellen erscheint, die bestimmte Regionen der perinephrischen Gänge zwischen 24 und 72 Stunden nach der Befruchtung oder HPF auskleiden. An einem Tag der Entwicklung behält das embryonale Ohr des Zebrafisches, das mit PFA und Methanol fixiert ist, seine Strukturen bei und ermöglicht den Nachweis von CaMKII-Färbungen an der Basis und entlang der Länge des Kinocilums. Bei 72 HPF wurde das Innenohr mit Alexa 488 Phalloidin und anti-acetyliertes Tubulin mit Alexa 568 gegengefärbt.

Die PFA-Methanol-Fixierung konservierte sowohl F-Aktin als auch Tubulin. Dieser 30 HPF-Fisch exprimierte ein membrangesteuertes GFP, das bei der Methanolfixierung verloren gehen würde. Die PFA-Fixierung führte zu einem verminderten P-CaMKII-Signal im Vergleich zur Fixierung mit PFA und Methanol.

In diesem Entwicklungsstadium ist das Signal jedoch stark genug, um ohne Methanol nachgewiesen zu werden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, frische Embryonen und frische freie Wirkstoffe zu verwenden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Phosphoproteine in Zebrafischembryonen lokalisiert.