Name: Analyse von LINE-1-Retrotransposition im Einzel Nucleus Ebene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Erfahren Sie die Analyse von LINE-1-Retrotransposition auf Einzelzellebene in HepG2-Zellen mittels FISH. Diese Methode ermöglicht präzise Bewertungen von Retrotranspositionsraten und Mustern.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse des National Institute of Environmental Health Sciences (ES014443 und ES017274) und AstraZeneca an KSR unterstützt.

HINWEIS: Alle Schritte sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden, wenn nicht anders angegeben. Bitte beachten Sie Reagenzien für Details auf, wie einzelne Reagenzien herzustellen. 1. Kennzeichnung L1 Probes HINWEIS: Die Sonden können durch chemische oder PCR-Kennzeichnung versehen werden. <ol><li> chemische Markierung <ol><li> Machen 0,7-1% Agarosegel in Tris-Acetat-EDTA (TAE) -Puffer, Wärme in einer Mikrowelle, bis sie geschmolzen, erlauben das Gel abkühlen, und fügen Ethidiumbromid (0,5 ug / ml). Gießen Sie in Gelträger, fügen Sie Kämme und lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur zu verfestigen. </li><li> Beschriften der Sneo Sonde (1-2 ug) mit CY3 oder FITC bei 37 ° C für 1 Stunde nach dem Protokoll des Herstellers. HINWEIS: Sneo bezeichnet die S nach einem vollen Zyklus der Retrotransposition ausgedrückt Neo mycin Gen pliced. Die Sonde ist ~ 1000 bp groß. Sneo kann PCR von jedem Vektor verstärkt werden oder von genomic-DNA. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen über Streptavidin-Cy3 / FITC-Markierungsreagenzien. </li><li> Mischen Sie die markierten Sneo Sondenlösung mit 1x DNA-Ladepuffer, Last in jede Vertiefung und laufen bei 75-100 Volt für 15-20 min. </li><li> Visualisieren Sie die Sonde Band eine Ultraviolett (UV) Illuminator verwenden. Man beachte , dass die Größe der Sneo Sonde eingestellt werden kann , und dass Lock - Kerne Säure (LNA) können ebenfalls hinzugefügt werden (Abbildung 2). </li><li> Cut Sneo Sonde aus dem Gel mit einem sauberen Messer markiert, löslich zu machen und die Sneo Sonde aus dem Gel unter Verwendung eines PCR-Clean-Up-Kit reinigen dem Protokoll des Herstellers nach. VORSICHT: Abdeckung jeder exponierten Teil des Körpers mit Schutzschilden (dh Laborkittel und UV - Klargesichtsmaske) beim Betrachten und das Gel zu schneiden. Siehe Tabelle Material- und Reagenzien für die Informationen zu Gel reinigen PCR-Produkte. </li><li> Re-run 5 ul Sneo markierten Sonde mit einem nicht-markierten Sneo Sonde auf einem 0,7% Agarose-Gel (siehe 1.1.1) conUnternehmensgröße zu erhöhen und Verlust der Signalintensität (Abbildung 2). </li><li> Quantifizierung der Menge an markiertem Sneo Sonde durch die Absorption bei 260 nm zu messen und verdünnt das Sneo Sonde 10 ng / &amp; mgr; l Aliquots in Nuklease freiem H 2 O. Store Aliquots bei -20 ° C. </li></ol></li><li> PCR - Labeling (Alternatives Verfahren zur Sondenmarkierung) <ol><li> Kombinieren Sie Sneo spezifische Primer (5&#39;-ggatagcattgggagatatacct-3 &#39;und 5&#39;-attgaacaagatg gattgcacgc-3&#39;) mit PCR - Reagenzien in einem einzigen Rohr: 13,6 ul nukleasefreiem H 2 O; 0,1 ul dATP, dCTP, dGTP (10 nM); 0,05 ul dTTP (10 nM); 0,05 &amp; mgr; l dUTP-Biotin / dUTP-FITC / CY3 (10 nM); 4 ul gehen Tag 5x Puffer; 0,4 ul gehen Tag Polymerase; 1 ul Sneo-Vorlage (10 ng). Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen über die PCR-Reagenzien. </li><li> Stellen Sie die Menge jedes Reagens durch durch die Gesamtzahl der Proben multipliziert wird. </li><li> Verwenden Sie das folgende PCR-Zyklen Parameters zu amplifizieren und Etiketten Sneo Sonden: 95 ° C für 2 min; 35 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 62 ° C für 30 sec, 72 ° C für 60 sec; 72 ° C für 2 min; Halten bei 4 ° C auf unbestimmte Zeit. HINWEIS: Die Glühtemperatur eingestellt werden kann oder Gradienten PCR kann optimal Glühtemperaturen für andere Sonden zu bestimmen, durchgeführt werden. </li><li> Machen Sie 0,7-1% Gel, wie in Abschnitt 1.1.1, Last und visualisieren die Sonde Band, wie in Abschnitt 1.1.4. </li><li> Schneiden Sie und reinigen die markierten Sneo Sonde, wie in Abschnitt 1.1.5. </li><li> Re-run 5 ul Sneo markierten Sonde mit un-markierten Sneo Sonde Größenzunahme und Verlust der Signalintensität zu bestätigen (siehe Abbildung 2). </li><li> Quantifizierung der Menge an markiertem Sneo Sonde durch Messung der Absorption bei 260 nm und verdünnter Sneo Sonde 10 ng / &amp; mgr; l Aliquots in Nuklease freiem H 2 O. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung Chromosome Aufstriche <ol><li> Generieren stabile Klone Vektorgerüst exprimieren (control) oder Retrotransposition zuständigen L1 unter Verwendung von Standardauswahlmethoden. 12,16 Während nicht-episomale Reporter wurden verwendet , um Ergebnisse mit Studien der Transkription, episomale Vektoren können auch verwendet werden zu korrelieren. Wachsen Zellen stabil exprimieren Kontrolle oder L1 - Vektor (1 x 10 6 Zellen pro 10 cm Platte, mit Anpassungen in Plattengröße hergestellt nach Bedarf) in komplettem Wachstumsmedium. Für HepG2-Zellen verwenden RPMI-1600, 10% FBS und 200 &amp; mgr; g / ml Hygromycin. Wachsen Kulturen zu 70% Konfluenz bei 37 ° C und 5% CO 2. HINWEIS: Die Wahl des Wachstumsmediums ist abhängig vom Zelltyp. Da die Plasmide tragen hier Selektionskassetten sowohl für Hygromycin und Neomycin, stabile Selektion von Klonen verwendet, könnte auch mit Neomycin nach Selektion auf Hygromycin durchgeführt werden, aber die Menge an Neomycin muss optimiert werden Toleranzwerte für jeden Zelltyp herzustellen. </li><li> In Colcemid (0,4 ug / ml) zu Kulturmedium und Inkubation für 90 min Zellen bei Metaph zu verhaftenase. Wenn verschiedene Zelltypen verwendet, bestimmen die optimale Konzentration von Colcemid und Zeit der Belichtung (60, 90 und 120 min) für eine optimale Verhaftung Metaphase empirisch. </li><li> Wasche die Zellen 2x mit 10 ml 1x Dulbecco-PBS (DPBS), trypsinize von 3-5 ml Zugabe von 0,25% Trypsin-Lösung zu den Zellen und inkubiere für 5 min, um die Zellen zu lösen. Inaktivieren Trypsin mit einer gleichen Menge an Medium 10% FBS enthielt. </li><li> Zentrifugation der Zellen für 2 min bei 1.000 × g bei 4 ° C absaugen Medium vom Zellpellet und wasche die Zellen mit DPBS. Absaugen alle DPBS, so dass 200 ul DPBS, um die Zellen erneut zu suspendieren. Stellen Sie sicher, Zellen sind gut gemischt, und dass alle Klumpen verteilt sind. Verwenden Sie Flackern oder vorsichtiges Pipettieren zu mischen und zu verteilen Klumpen und vermeiden Verwirbelung. </li><li> 5 ml hypotonischer Lösung (dh 75 mM KCl), die auf 37 ° C tropfenweise , während das Drehen des 15 - ml - Röhrchen horizontal und inkubieren bei 37 ° C für 20 min vorgewärmt wird. Siehe Tabelle der Materialien und Reagents für Informationen darüber, wie zu erhalten und hypotonischen Lösung zu machen. </li><li> Zentrifugen Zellen bei 120 xg für 5 min bei 4 ° C und wiederholen Sie die Schritte 2,4-2,5 3x etwa 200 ul hypotonischen Lösung verlassen, die Zellen nach jeder Wäsche zu resuspendieren. Stellen Sie sicher, dass das Pellet sichtbar ist weiß und geschwollen am Ende der 3 Wäschen. </li><li> Re-suspend das Pellet in 200 ul Carnoy Fixativ Lösung und machen 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1.16 Verdünnungen in Carnoy Fixativ Lösung. Drop-10 &amp; mgr; l jeder Verdünnung auf einem trockenen, sauberen Objektträger von etwa 1 cm über und sofort die Ausbreitung freien Seite zu heißen Dampf aus Wasser für 30 Sekunden aus siedendem. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen darüber, wie Carnoy Fixativ Lösung zu machen. </li><li> Trocknen Sie die Spreads bei Raumtemperatur, Fleck mit 0,1 ug / ml Hoechst-33342 durch Eintauchen für 15-20 min in Coplin Jar und waschen 3x mit DPBS. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen darüber, wie die Hoechst-33342-Lösung zu machen. </li> &lt;li&gt; Ansicht verbreitet sich auf Fluoreszenz / Phasenkontrast-Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung. Nach Ausbreitung Vorbereitung zu optimieren, braucht nicht Spreads mit Hoechst-33342 gefärbt werden. Ansicht breitet sich auf Phasenkontrast - Mikroskop bei 10 - facher Vergrößerung Ausbreitung Qualität und Trennung , um zu bestimmen , wie im Abschnitt Ergebnisse umrissen (siehe Abbildung 3). </li><li> Wählen und umkreisen gute Spreads mit einem Diamond Point Markierung auf der gegenüberliegenden Seite des Schiebers (dh verteilt freie Seite). </li><li> Store spreizt bei -20 ° C für bis zu einem Monat. Vermeiden Sie die Einwirkung von Feuchtigkeit. </li></ol> 3. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) <ol><li> Stabilisierende und Entwässern Spreads HINWEIS: Äquilibrieren Metaphasechromosom breitet sich auf Raumtemperatur gelagert, wenn bei -20 ° C. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen darüber, wie Reagenzien zu erhalten und zu machen. <ol><li> Inkubieren Metaphasechromosom verbreitet mit 200 &amp; mgr; l RNase A für1 h bei 37 ° C. </li><li> Wasch gleitet in 2x SSC-Puffer zweimal für jeweils 5 min, gefolgt von 10 mM HCl-Lösung gespült wird. </li><li> Inkubieren Spreads mit 1% Pepsin für 10 min bei 37 ° C, Spülen mit VE - H 2 O und wäscht zweimal mit 2x-SSC - Puffer für jeweils 5 Minuten. </li><li> Inkubieren Spreads mit 4% Paraformaldehyd für 10 Minuten und waschen in 2x SSC-Puffer zweimal für jeweils 5 Minuten. </li><li> Dehydrieren verbreiten, indem sie für 2 Minuten in Ethanol Serie Inkubation: 70%, 80% und 95% Ethanol. </li><li> Lufttrockener Rutschen. </li></ol></li><li> Hybridization Spreads mit L1 -markierten Sonden Retrotransposition (dh Sneo) ACHTUNG: Für den direkten markierten Sonden, halten weg von Licht zu allen Zeiten. Siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für die Informationen darüber, wie Reagenzien zu erhalten und zu machen. <ol><li> Werden 30 ng von Sneo zu Hybridisierungspuffer, Hitze bei 72 ° C für 10 min und kühl für 2 min bei Raumtemperatur. </li><li> In 30 ul Sneo Sondenlösung bis eACH Ausbreitung, Deckel mit Deckglas und die Ränder mit Gummi-Zement. Achten Sie darauf, keine Blasenbildung. </li><li> Erhitzen Sie die Folie bei 72 ° C für 5 min auf einem Wärmeblock, die Temperatur allmählich auf 37 ° C fallen, und Inkubation über Nacht in einer dunklen feuchten Kammer bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Waschen und Anzeigen (oder Addition von sekundären Antikörper) ACHTUNG: Für den direkten markierten Sonden, halten weg von Licht zu allen Zeiten. HINWEIS: Siehe Tabelle von Materialien und Reagenzien für Informationen darüber, wie vorzubereiten. Die Verwendung von genügend Volumen, um die gesamte Chromosomenspreitung abdecken wird empfohlen. Denken Sie daran, dass überschüssiges Volumen verloren gehen, wenn Deck hinzugefügt wird. <ol><li> Tauchen Sie Dias in 2x SSC-Puffer Deckgläser zu entfernen. </li><li> Waschen Folien durch Eintauchen in 2 × SSC-Puffer bei 45 ° C für 5 min. </li><li> Waschen Folien durch Eintauchen in Waschpuffer bei 45 ° C für 5 min, 2x. </li><li> Waschen Folien durch Eintauchen in 0,1 x SSC-Puffer bei 45 ° C für 10 min. </li><li>Waschen Folien durch Eintauchen in 2 × SSC-Puffer bei 45 ° C für 10 min. HINWEIS: Einen Coplin Jar enthält empfohlenen Puffer in einem Wasserbad, justieren Temperatur auf 45 ° C. </li><li> Kühlen Folien auf Raumtemperatur äquilibrieren und gleitet in Detektionspuffer. </li><li> Für die direkte markierten Sonden, überspringen 3.4.10 Schritt. </li><li> Für die indirekte markierten Sonden, Blockpuffer für 20-30 min in Blockieren und Waschen 3x in DPBS. </li><li> Inkubieren mit 50 &amp; mgr; l sekundärem Antikörper (beispielsweise 5 &amp; mgr; g / ml Streptavidin-FITC oder αCY3 in Blocking - Puffer) für 1 Stunde. </li><li> Waschen Sie Folien in 2 × SSC für 5 min zweimal. </li><li> Gegenfärbung mit Hoechst-33342-Lösung (0,1 ug / ml) für 10 min. HINWEIS: Diese Färbung erfolgt Chromosomen für die Co-Lokalisation mit der Sonde zu färben. </li><li> Waschen Sie in DPBS 3x, fügen Sie einen Tropfen Eindeckmedium, legen Sie ein Deckglas und die Ränder mit Nagellack. </li><li> Analysieren L1 Retrotransposition unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskop bei 40facher magnification. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, keine potenziellen Interessenkonflikte.

Methodiken wie Sequenzierung ganzer Genome, inverse PCR und Southern - Blotting wurden zu studieren L1 Retrotransposition eingesetzt. Obwohl diese Methoden äußerst wertvoll sind , bei der Suche nach dem L1 Einfügungen treten innerhalb von Genomen, eine verwirrende Herausforderung für alle von ihnen ist die Notwendigkeit für die In-silico - Programmierung zu Sequenzen wieder zusammen. Die FISH - Methodik hier beschrieben entwickelt , um diese Methoden zu ergänzen, insbesondere im Fall von Studi...

Menschliche Lange streute Kern Element-1 (Linie-1 oder L1) ist eine autonome mobile Element , das durch eine im Genom ausbreitet &quot;Kopieren und Einfügen&quot; Retrotransposition Mechanismus. Ein typisches menschliches L1 ~ 6 kb lang und besteht aus einer 5&#39; - UTR (untranslatierte Region), die als Promotor dient, zwei offene Leserahmen (ORFs): L1 -ORF1 und L1 -ORF2 und eine 3&#39;UTR mit einem polyA . Schwanz L1 -ORF1 Protein hat drei verschiedene Bereiche: eine Spule-Coil - Domäne, RNA - Erkennungsmotiv und C-terminale Domäne, während L1 -ORF2 Protein Endonuklease hat, reverse Transkriptase und Cystein reiche Domänen 1.2.3.4.5. L1 -ORF1 zeigt Nukleinsäure Chaperon - Aktivitäten, während L1 -ORF2 enzymatischen Aktivitäten bietet, wobei beide für Retrotransposition benötigten Proteine ​​1,2,6. Ein Zyklus von L1 Retrotransposition beginnt mit der Transkription von der 5&#39;UTR von L1 </em&gt; bicistronischen mRNA durch RNA-Polymerase II, Translokation in das Cytoplasma und Translation. Im Zytoplasma, L1 -ORF1 weist entweder cis -Bindung , wo es seine eigene RNA oder trans -Bindung Pakete , wo es andere RNAs Pakete (dh Sinus- / SVAS / pseudogenes) 7 ein Ribonukleoprotein Partikel (RNP) mit L1 -ORF2p zu bilden, 8. RNPs Translokation in den Zellkern , wo die Endonuklease - Aktivität von L1 -ORF2p Scharten genomische DNA (gDNA) eine OH zu belichten - Gruppe 9, die wiederum durch die reverse Transkriptase zu primen verwendet wird und synthesize RNA zu DNA vom 3&#39; - Ende umzukehren. Während der Rückwärts Synthese wird der zweite DNA - Strang 7-20 bp von der ursprünglichen nick Website geklaut zu versetzten Pausen schaffen , die die Signatur L1 Insertionssequenzen (zB TTTTAA) genannt Zielstelle Vervielfältigungen (TSD) 9,10 zu bilden , gefüllt sind. Dieser Vorgang wird als Ziel prime reverse Transkription (TPRT) bekannt und führt zu insertiauf der vollständigen oder abgeschnittene Kopien von L1 / andere DNAs mit TSD an beiden Enden der eingefügten Sequenz. L1 Retrotransposition auch durch TPRT artigen nicht-homologe end-joining in einigen Zelltypen 11 vermittelt zu werden hat sich gezeigt. Der L1 - Vektor Retrotransposition in unseren Studien verwendeten nicht-episomale und besteht aus getaggt L1 -ORF1 &amp; 2p angetrieben durch kombinierte CMV-Promotoren L1-5&#39;UTR (Abbildung 1) 12. Frühere Versionen dieses Konstrukts wurden 13,14,15 in Studien unter Verwendung von Hefe und menschlichen Zellkulturen beschrieben. Zwei verschiedene CMV-Promotoren in der 5 &#39;angeordnet und 3&#39;-Enden des Vektors, mit dem 3&#39;-Ende in umgekehrter Ausrichtung angeordnet Expression von Neomycin nach dem Spleißen und Integration zu fahren. Der Retrotransposition Indikator Kassette an dem 3&#39; - Ende besteht aus einem Neomycin - Gen insertiert Antisense zu L1 -ORFs und durch eine glob inaktiver durch Trennung in zwei Hälften gemachtin Intron mit gespleißten Donor (SD) und gespleißt Akzeptor (SA) -Stellen (Abbildung 1). Bei der Integration in ein Chromosom, wird L1 von dem gemeinsamen Promotor transkribiert , um eine mRNA produzieren , die von einer bicistronischen mRNA und inaktive Neomycin mRNA besteht. Während RNA Verarbeitung wird das Globin-Intron aus dem Neomycin-Gen gespleißt eine voll funktionsfähige Neomycin-Gen wiederherzustellen. Die Hybrid - mRNA wird in ein RNP in cis verpackt und in den Zellkern transloziert , wo es in das Genom entweder in voller Länge oder abgeschnittene Einfügungen Verwendung TPRT integriert ist. Hier beschreiben wir eine Methode , die Fluoreszenz - in - situ - Hybridisierung (FISH) mit Sonden verwendet speziell auf die gespleißten Neomycin - Gen gerichtet (Sneo) an der einzigen Kern Ebene L1 -retrotransposiition Muster und Einbringungsraten zu verfolgen. Die Effizienz und Spezifität des Nachweises wurde unter Verwendung von Retrotransposition kompetenten und inkompetenten Konstrukte und Sonden bestätigt detect Sneo oder das Neomycin und Intron - Übergang Globin - 16. Diese Methodologie macht einige der Mängel der Zellkultur-Assays Retrotransposition, beispielsweise mehrere Einfügungen, kolonieBeständigkeit und günstige clone Expansion.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Markierungssonden</td></tr><tr><td>Go Tag DNA-Polymerase</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>GO Tag 10x farbloser Puffer</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>Individual dNTP</td><td>Sigma</td><td>DNTP10</td><td>Passen Sie die Konzentration von dATP, dGTP, dCTP auf 2&nbsp; mM und dTTP bis 1,5&nbsp; mM in nukleasefreiem Wasser.</td></tr><tr><td>dUTP-16-Biotin (0,5&nbsp; mM)</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-FITC (0,5&nbsp; mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0101</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-CY3 (0,5&nbsp; mM)</td><td>Sigma</td><td>GEPA53022</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH Markierungskit</td><td>MIRUS</td><td>MIR3625</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH Markierungskit</td><td>MIRUS</td><td>MIR3225</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin PCR Clean-Up Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1410/0030</td><td>Jedes PCR-Reinreagenz kann anstelle des NucleoSpin PCR Clean Up Kit</td></tr><tr><td>PCR-Geräts</td><td></td><td></td><td>verwendet werden. Jedes Thermocycler-Gerät kann zur Amplifikation des Etikettenprodukts verwendet werden.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Vorbereitung von Chromosomen-Spreads</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15212-012</td><td>Colcemid direkt zu Wachstumsmedien bis zu einer Endkonzentration von 0,4 μ2 zugeben; &Mikro; g/ml</td></tr><tr><td>1&nbsp; M KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Verdünnung 1&nbsp; M KCl-Lösung bis 75&nbsp; mM Lösung zur Herstellung der hypotonischen Lösung</td></tr><tr><td>Carnoy Fixierlösung</td><td></td><td></td><td>Mischen Sie 3 Volumen Methanol und 1 Volumen Essigsäure, um die Carnoy Fixierlösung herzustellen. Machen Sie es jedes Mal frisch.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Lösen Sie Hoechst-33342 in PBS bis zu einer Endkonzentration von 1&nbsp; mg/ml.</td></tr><tr><td>Diamant-Punktmarkierer</td><td>Thermo Scientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>2951-001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>R001100</td><td>Um Zellen zu detechnieren, inkubieren Sie die Zelle 5 Minuten lang in Trypsin und inaktiv mit dem gleichen Volumen des vollständigen Mediums.</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Dosen</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Wärmeblock</td><td></td><td></td> Jeder <td>Wärmeblock kann für diesen Zweck verwendet werden, obwohl Blöcke empfohlen werden, die für Heizobjektträger geeignet sind.</td></tr><tr><td>Becher (600&nbsp; ml)</td><td>Sigma</td><td>CLS1003600</td><td>Füllen Sie das Becherglas mit Wasser, erhitzen Sie es zum Kochen, verwenden Sie den heißen Dampf, um die Chromosomen zum Platzen zu bringen.</td></tr><tr><td>Nikon Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>125690</td><td>Jedes Mikroskop kann verwendet werden, um die Spread-Qualität zu betrachten.</td></tr><tr><td colspan="4">Reagenzien und Materialien für FISH</td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Chroride</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>F1379</td><td></td></tr><tr><td>Detran Sulfat</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Lachs Sperma DNA</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>HCl (N)</td><td>Sigma</td><td>38283</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Hoechst-33342 in PBS auflösen bis zu einer Endkonzentration von 1&nbsp; mg/ml.</td></tr><tr><td>Gummizement/Cytobond-Dichtstoff&nbsp;</td><td></td><td>1.00.2020</td><td></td></tr><tr><td>Seven Coplin Gläser</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>Dunkle Befeuchtete Kammer</td><td>Sigma</td><td>CLS2551</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Dry Digital Heat Block</td><td>VWR</td><td>13259</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x Kochsalz-Natriumcitrat (20x SSC)</td><td></td><td></td><td>Kombinieren Sie 175 g NaCl und 88,2 μμl; g Trinatriumcitrat mit 800 ml H2O. Unter Einstellung auf pH 7 umrühren. Sobald sich alle Salze aufgelöst haben, stellen Sie das Volumen auf 1 l ein und filtern Sie durch 0,22 & Mikro; m Filterpapier. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>1&nbsp; mg/ml Rnase A</td><td></td><td></td><td>20x SSC-Puffer auf 2x SSC-Puffer verdünnen. RNase A in 2x SSC-Puffer auf eine Endkonzentration von 1&nbsp; mg/ml. Stellen Sie jedes Mal eine frische Lösung her.</td></tr><tr><td>1% Pepsin Pepsin</td><td></td><td></td><td>(W/V) in 10 mM HCl bis zu einer Endkonzentration von 1% iger Lösung auflösen. Jedes Mal frisch machen.</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd (4% PFA)</td><td></td><td></td><td>4,0 g PFA im Abzug abwiegen, 50 ml 1xPBS zugeben, auf 60&nbsp; erhitzen; &deg; C unter Rühren und stellen Sie den pH-Wert mit Tropfen NaOH ein, bis sich das gesamte PFA aufgelöst hat und die Lösung klar wird. Stellen Sie die Lautstärke auf 100&nbsp; ein ml, Filter durch 0,22 &Mikro; m Filtern Sie das Papier und lagern Sie 5 ml Aliquots bei -20&nbsp; &deg;C. Auftauen aliquot von PFA bei 37 &deg; C für 10-15 min für spätere Anwendungen. Passen Sie die Filtergröße in Abhängigkeit von der Menge an Paraformaldehyd an.</td></tr><tr><td>Wash Buffer</td><td></td><td></td><td>Kombinieren Sie 100 ml Formamid (20%) mit 2,5 ml 20x SSC, stellen Sie es mit 1,0 M HCl auf pH 7 ein und bringen Sie das Volumen auf 500 ml mit H2O.</td></tr><tr><td>Hybridisierungspuffer</td><td></td><td></td><td>Kombinieren Sie 50 % Formamid, 10 % Dextransulfat, 0,1 % SDS und 300 ng/ml Lachsspermien-DNA in 2x SSC-Puffer. Die Menge an Formamid bestimmt, wie fokussiert die Chromatiden sind; Titrieren Sie den Betrag.</td></tr><tr><td>Nachweispuffer</td><td></td><td></td><td>Verdünnen Sie den 20-fachen SSC-Puffer auf das 4-fache und fügen Sie 0,2 % Tween-20 hinzu, um einen Nachweispuffer herzustellen.</td></tr><tr><td>Kombinieren</td><td></td><td></td><td>Sie 5 % Rinderserumalbumin (BSA) mit 0,2 % Tween-20 in 4x SSC-Puffer.</td></tr><tr><td>Dehydratisierungslösung</td><td></td><td></td><td>Stellen Sie 70 %, 80 % und 95 % ige Ethanollösungen her.</td></tr></tbody></table>

analyse von line-1-retrotransposition im einzel nucleus ebene

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Lange eingestreutes Kernelement-1 (Linie-1 oder L1) macht etwa 17% der im menschlichen Genom vorhandenen DNA aus. Während die Mehrheit der L1s aufgrund von 5'-Trunkierungen inaktiv ist, bleiben ~80-100 dieser Elemente retrotranspositionskompetent und vermehren sich über RNA-Zwischenprodukte an verschiedene Stellen im Genom. Während man davon ausgeht, dass ältere L1-Moleküle auf AT-reiche Regionen des Genoms abzielen, sind die chromosomalen Ziele neuer, aktiverer L1-Moleküle nach wie vor schlecht definiert. Hier beschreiben wir die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmethode (FISH), die verwendet werden kann, um Muster der L1-Insertion und die Raten des ektopischen L1-Einbaus auf Einzelkernebene zu verfolgen. In diesen Experimenten wurden Fluorescein-Isothiocyanat/Cyanin-3 (FITC/CY3)-markierte Neomycin-Sonden verwendet, um die L1-Retrotransposition in vitro in HepG2-Zellen zu verfolgen, die ektopisches L1 stabil exprimieren. Diese Methodik verhindert Fehler bei der Schätzung der durch Toxizität verursachten Retrotranspositionsraten und berücksichtigt das Auftreten mehrerer Insertionen in einen einzigen Zellkern.

Ein schematisches Diagramm des L1 Retrotransposition Vektors ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Vektor besteht aus einem Neomycin - Gen in Antisense - Orientierung zu L1 ORFs , die durch ein Globin - Intron in Sense - Orientierung und sandwichartig von SD und SA Seiten unterbrochen ist. Wenn stabil in ein Chromosom integriert ist L1 mRNA aus dem kombinierten CMV transkribiert und L1-5&#39;UTR Promotor (Abbildung 1). Während RN...

Hier beschäftigen wir FISH - Methodik LINE-1 - Retrotransposition an der einzelnen Kerne Ebene in Chromosom Spreads von HepG2 - Zelllinien stabil synthetischen LINE-1 exprimieren , zu verfolgen.

Analyse von LINE-1-Retrotransposition im Einzel Nucleus Ebene

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, L-1-Retrotranspositionsraten und -muster auf Ebene des einzelnen Zellkerns mithilfe der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) sichtbar zu machen und zu analysieren. Der wesentliche Vorteil dieser Methodik liegt darin, dass sie es dem Experimentator ermöglicht, Über- oder Unterschätzungen von Retrotranspositionsraten und -mustern zu vermeiden, und in Kombination mit anderen Methoden die Untersuchung der L-1-Retrotransposition auf Ebene einzelner Zellkerne erlaubt. Durchgeführt wird dieses Verfahren heute von Dr. Pasano Bojang, einem leitenden Wissenschaftler im Labor. Als Erstes nach dem Vorbereiten eines 0,7 % bis 1 %igen Agarosegels in TAE-Puffer gemäß dem Textprotokoll die SNeo-Sonde mit CY3 oder FITC markieren und gemäß Herstellerprotokoll eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die markierte SNeo-Sondelösung mit 1× DNA-Ladepuffer mischen und in die Vertiefungen des Agarosegels auftragen. Anschließend das Gel 15 bis 20 Minuten lang bei 75 bis 100 Volt laufen lassen.Unter Verwendung eines UV-Strahlers die Probenbande sichtbar machen. Mit einer sauberen Klinge die markierte SNeo-Sonde aus dem Gel schneiden. Anschließend einen PCR-Reinigungskit gemäß Herstellerprotokoll verwenden, um die SNeo-Sonde aufzulösen und zu reinigen.Nach der Reinigung erneut fünf Mikroliter SNeo-markierten Probe zusammen mit einer unmarkierten SNeo-Probe auf einem 0,7 %igen Agarosegel laufen lassen, um die Größenzunahme und die Signalintensitätsabnahme zu bestätigen. Zur Quantifizierung der markierten SNeo-Probe die Absorption bei 260 Nanometern messen und die SNeo-Probe in nukleasefreiem Wasser auf 10 Nanogramm pro Mikroliter Aliquote verdünnen. Die Aliquote bei minus 20 Grad Celsius lagern.Nach der Erzeugung stabiler Klone, die retrotranspositionsfähiges L-1 oder das Vektor-Grundgerüst exprimieren, HepG2-Zellen, die stabil den Kontroll- oder L-1-Vektor exprimieren, kultivieren. 0,4 Mikrogramm pro Milliliter Colcemid dem Kulturmedium hinzufügen und 90 Minuten lang inkubieren, um die Zellen in der Metaphase anzuhalten.Verwenden Sie 10 Milliliter 1X Dulbecco's PBS oder DPBS, um die Zellen zwei Mal zu waschen. Anschließend 0,25 %iges Trypsin-Lösung hinzufügen und fünf Minuten lang inkubieren. Medium, das 10 % FBS enthielt, wurde zugegeben, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen.Überführen Sie die Zellen anschließend in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 1.000 ×g und vier Grad Celsius für zwei Minuten. Anschließend das Medium vom Zellpellet abpipettieren und die Zellen mit DPBS waschen. Entfernen Sie alles bis auf 200 Mikroliter DPBS und verwenden Sie diesen Rest, um die Zellen durch vorsichtiges Schwenken oder sanftes Pipettieren wieder aufzuschwemmen, wobei sichergestellt werden muss, dass die Zellen gut vermischt sind und keine Klumpen enthalten.Unter gleichzeitigem horizontalem Schwenken des Rohrs tropfenweise fünf Milliliter vorgewärmte hypotonische Lösung hinzufügen und 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Zellen bei 120 G und vier Grad Celsius fünf Minuten lang zentrifugieren. Anschließend die hypotonische Lösung bis auf 200 Mikroliter entfernen.Spülen Sie dreimal mit Fixierungslösung, wobei zwischen den Spülgängen jeweils etwa 200 Mikroliter Fixierungslösung in den Zellen verbleiben sollten. Nach den drei Spülvorgängen überprüfen Sie, ob das Pellet sichtbar weiß und geschwollen ist. Anschließend resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern Carnoy-Fixierungslösung und verwenden die Fixierungslösung, um die folgenden Verdünnungen der resuspendierten Zellen herzustellen.Tröpfeln Sie jeweils 10 Mikroliter jeder Verdünnung aus etwa einem Zentimeter Höhe auf einen trockenen, sauberen Objektträger und setzen Sie die Seite ohne Tropfen sofort 30 Sekunden lang heißem Wasserdampf aus. Nach dem Trocknen der Aufträge bei Raumtemperatur färben Sie mit einem Montagemedium, das DAPI enthält, und bringen eine Deckglasabdeckung an. Nach der Inkubation waschen Sie die Objektträger dreimal mit DPBS. Um die Präparationen zu betrachten, verwenden Sie ein fluoreszenzbasiertes Kontrastmikroskop mit 40-facher Vergrößerung. Nach der Optimierung der Präparationsherstellung ist es nicht notwendig, diese zu färben. Um gute Präparationen zu markieren, verwenden Sie einen Diamantschreiber auf der gegenüberliegenden Seite des Objektträgers.Um die Metaphase-Chromosomenpräparate zu stabilisieren und zu dehydrieren, 200 Mikroliter RNase A zu den Proben geben und eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Objektträger zwei Mal je fünf Minuten mit 2X SSC waschen und die Proben anschließend mit 10 Millimolar HCl spülen. Danach 1 % Pepsin zu den Präparaten hinzufügen und 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.Nachdem die Objektträger mit entionisiertem Wasser gespült wurden, die Proben zwei Mal je fünf Minuten mit 2X SSC waschen. Anschließend 4 % Paraformaldehyd zu den Ausstrichen geben und 10 Minuten inkubieren, bevor zwei weitere Waschungen mit 2X SSC-Puffer durchgeführt werden. Nach den SSC-Waschungen die Ausstriche durch zweiminütige Inkubation der Proben in der folgenden Ethanolreihe dehydrieren.Fügen Sie 30 Nanogramm SNeo zum Hybridisierungspuffer hinzu und erhitzen Sie ihn 10 Minuten lang auf 72 Grad Celsius, bevor Sie zwei Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Danach pipettieren Sie 30 Mikroliter der SNeo-Sonde auf jeden Objektträger und decken die Probe mit einem Deckglas ab. Versiegeln Sie die Ränder mit Kautschukzement, wobei sicherzustellen ist, dass keine Blasenbildung auftritt.Den Objektträger fünf Minuten lang auf einem Heizblock bei 72 Grad Celsius belassen. Dann die Temperatur schrittweise auf 37 Grad Celsius senken. Über Nacht im Dunkeln in einer befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius inkubieren.Um einen sekundären Antikörper aufzutragen, beginnen Sie damit, die Objektträger in 2X SSC-Puffer zu tauchen, um die Deckgläser zu entfernen. Tauchen Sie die Objektträger anschließend zur Wäsche fünf Minuten lang in 2X SSC bei 45 Grad Celsius ein und überführen Sie die Proben danach in Waschpuffer, wo sie zweimal je fünf Minuten bei 45 Grad Celsius gewaschen werden. Danach tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in 0.1X SSC-Puffer bei 45 Grad Celsius ein.Anschließend die Objektträger 10 Minuten lang bei 45 Grad Celsius in 2X SSC-Puffer waschen. Nach dem Abkühlen der Objektträger auf Raumtemperatur die Objektträger für direkt markierte Sonden zwei Mal je fünf Minuten mit 2X SSC waschen. Die Objektträger 10 Minuten lang bei RT in Detektionspuffer äquilibrieren. Danach Eindeckmedium mit DAPI zugeben und die Proben 10 Minuten lang gegenfärben.Bringen Sie einen Deckglaser auf und versiegeln Sie die Ränder mit Nagellack. Analysieren Sie abschließend die L-1-Retrotransposition mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 40facher Vergrößerung. Wie hier gezeigt, wurde die Dichte der Metaphase-Chromosomenpräparate bestimmt, indem Verdünnungen hergestellt und jedes Präparat hinsichtlich Dichte, Verteilung und Abstand der Ausbreitung vom Zellkern bewertet wurde.Anspreitungen mit geringer Dichte und gleichmäßiger Verteilung wurden für die anschließende Analyse ausgewählt. Diese Bilder zeigen Chromosomenpräparate, die mit dem Hoechst-Farbstoff DAPI angefärbt wurden, und die Qualität der Präparate wurde anhand der Chromosomenlänge, der Rundheit der Präparate und des Abstands zwischen den Chromosomen beurteilt. Wurden die Zellen für einen kurzen Zeitraum in hypotonischer Lösung inkubiert, so wurden die Chromosomenpräparate stark verknotet und einzelne Chromosomen waren schwer zu erkennen.Jedoch führte eine längere Inkubation in hypotonischer Lösung zum Bruch der Zellkerne, zur Streuung der Chromosomen und/oder zum Verlust von Chromosomen. Längere Inkubationen in Colcemid erhöhten die Anzahl der Zellen in Metaphase, führten jedoch zu einer Verdichtung der Chromosomen. Wie hier veranschaulicht, erwiesen sich eine 90-minütige Inkubation in Colcemid, 20 Minuten in hypotonischer Lösung bei 37 Grad Celsius sowie die Verwendung von heißem Dampf zum Aufplatzen der Zellen als optimale Bedingungen für die Erzeugung hochwertiger Präparationen.In diesem Experiment wurden Chromosomenpräparate für die L-1-Retrotransposition mit Sonden angefärbt, die SNeo gezielt ansprechen. Die Sonde wurde sowohl mit FITC als auch mit CY3 markiert, um zu zeigen, dass in beiden Fällen die L-1-Retrotransposition nur in Zellen nachweisbar ist, die das wildtypische L-1 exprimieren. Sobald die Methode beherrscht ist, kann dieses Experiment tatsächlich in sechs bis acht Stunden durchgeführt werden, insbesondere wenn die Hybridisierungszeiten von zwei bis vier Stunden betragen und die Technik ordnungsgemäß durchgeführt wird.Während der Durchführung der Technik ist es wichtig, gründlich zu waschen, die Hybridisierungszeiten zu optimieren und die dNTP-Sonden chemisch zu markieren, um Kontaminationen zu vermeiden. Um zusätzliche Fragen wie die chromosomale Lokalisation der Insertion zu beantworten, können zusätzliche Technologien wie die L-1-Sequenzierung und die G-Bandenanalyse durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die L-1-Sonden markiert, chromosomale Ausstriche herstellt und Muster sowie Raten der L-1-Retrotransposition mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechnologie misst.Diese Technologie hat den Weg für die Untersuchung von Mustern der L-1-Retrotransposition sowie von L-1-Einfügestellen geebnet. Es ist wichtig zu bedenken, dass beim Arbeiten mit toxischen Substanzen, biologischen Reagenzien sowie ultraviolettem Licht Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Schutzausrüstung unerlässlich sind.

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