Name: Die Behandlung von SCA1 Mäuse, die mit wasserlöslichen Verbindungen zu unspezifisch Erhöhung mitochondriale Funktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Erfahren Sie eine biochemische und verhaltensbiologische Methode zur Behandlung von SCA1-Mäusen mit wasserlöslichen mitochondrialen Aktivatoren wie Bernsteinsäure. Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung therapeutischer Effekte auf zerebelläres Verhalten und Gewebe.

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Wir möchten Dr. Harry Orr von der University of Minnesota für seine großzügige Spende an transgenen Mäusen danken. Wir möchten uns auch bei den folgenden Absolventen des Skidmore College für ihre Arbeit bei der Durchführung der vorangegangenen Experimente bedanken: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson und Cheyanne Slocum. Darüber hinaus möchten wir uns beim Skidmore College für die Finanzierung der Entwicklung dieser Methoden bedanken.

<ol><li>Stucki, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+impairments+contribute+to+Spinocerebellar+ataxia+type+1+progression+and+can+be+ameliorated+by+the+mitochondria-targeted+antioxidant+MitoQ%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ.</a> Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).</li>
<li>Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mitochondrial+dysfunctions+in+the+brain%2C+from+mice+to+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men.</a> J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).</li>
<li>Breuer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+OXPHOS+dysfunction+in+the+development+of+neurologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases.</a> Neurobiol Dis. , (2012).</li>
<li>Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunctions+in+neurodegenerative+diseases%2C+relevance+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease.</a> Biomed Res Int. 2014, 175062(2014).</li>
<li>Burright, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCA1+transgenic+mice%2C+a+model+for+neurodegeneration+caused+by+an+expanded+CAG+trinucleotide+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat.</a> Cell. 82 (6), 937-948 (1995).</li>
<li>Clark, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+expression+of+a+mutant+allele+of+SCA1+in+transgenic+mice+leads+to+disparate+effects+on+motor+behaviors%2C+followed+by+a+progressive+cerebellar+dysfunction+and+histological+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations.</a> J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li>
<li>Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+tempol%2C+a+catalytic+scavenger+of+peroxynitrite-derived+free+radicals%2C+in+a+mouse+traumatic+brain+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).</li>
<li>Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+peroxidation-derived+reactive+aldehydes+directly+and+differentially+impair+spinal+cord+and+brain+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function.</a> J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).</li>
<li>Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+Q10+administration+increases+brain+mitochondrial+concentrations+and+exerts+neuroprotective+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).</li>
<li>Ferrante, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+creatine+in+a+transgenic+mouse+model+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease.</a> J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).</li>
<li>Ferrante, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+coenzyme+Q10+and+remacemide+in+transgenic+mouse+models+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease.</a> J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).</li>
<li>Hersch, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+in+Huntington+disease+is+safe%2C+tolerable%2C+bioavailable+in+brain+and+reduces+serum+8OH2%27dG%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG.</a> Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+with+coenzyme+Q10+and+creatine+produces+additive+neuroprotective+effects+in+models+of+Parkinson%27s+and+Huntington%27s+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases.</a> J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).</li>
<li>Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+Q10+reduces+beta-amyloid+plaque+in+an+APP%2FPS1+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).</li>
<li>Sandhir, R., Mehrotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin+supplementation+is+effective+in+improving+mitochondrial+dysfunctions+induced+by+3-nitropropionic+acid%2C+implications+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).</li>
<li>Ergonul, P. G., Nergiz, C. <a target="_blank" href="http://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/31627.pdf">Determination of organic acids in olive fruit by HPLC.</a> 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).</li>
<li>Jones, B. J., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantiative+measurement+of+motor+inco-ordination+in+naive+mice+using+an+acelerating+rotarod%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod.</a> J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).</li>
<li>Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+motor+balance+and+coordination+in+mice+using+the+balance+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+the+ataxin-1+protein+in+tissues+from+normal+and+spinocerebellar+ataxia+type+1+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals.</a> Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).</li>
<li>Klement, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-1+nuclear+localization+and+aggregation%2C+role+in+polyglutamine-induced+disease+in+SCA1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice.</a> Cell. 95 (1), 41-53 (1998).</li>
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<li>Anjomani Virmouni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+GAA-repeat-expansion-based+mouse+model+of+Friedreich%27s+ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia.</a> Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wenn diese Methoden verwendet werden, wie beschrieben, sind sie in der Lage zu erkennen und Linderung oxidative Phosphorylierung vermittelte mitochondriale Dysfunktion in cerebellar neurodegenerative Krankheit Mäuse-Modellen. Die vereinigten biochemischen und Verhaltenstests sind vielfältig Methoden für das Ausmaß der mitochondrialen Beitrag zur cerebellar neurodegenerative Krankheitspathologie bestimmen. Durch die Mäuse mit Bernsteinsäure Behandlung von Stoffwechsel zu stimulieren und die Funktion der Mitochondrien ste...

Mitochondrien sind die wichtigsten Produzenten von Adenosintriphosphat (ATP), ein essentielles Coenzym für die Zellenergie, mit der Mehrheit der mitochondrialen ATP durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) erzeugt die Elektronentransportkette verwendet wird. Das Gehirn, angesichts der hohen metabolischen Anforderungen und sein Vertrauen auf die oxidative Phosphorylierung für neuronale Aktivität antreibt, ist auf mitochondriale Dysfunktion sehr anfällig. Als Ergebnis wird die mitochondriale Funktionsstörung während des Alterungsprozesses ausgelöst 1 und ist in die Pathogenese mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen 2, 3, 4 gebracht. Daraus folgt, dass Mitochondrien attraktive therapeutische Ziele für die Neurodegeneration sind. In diesem Protokoll haben wir die Verwendung von Spinozerebelläre Ataxie Typ 1 (SCA1) als Modell neurodegenerative Erkrankung zur Untersuchung von Mitochondrien angenommenenl Dysfunktion und die Entwicklung der Mitochondrien zielgerichtete Therapien. SCA1 wird durch eine Polyglutamin (polyQ) Repeat - Expansion Mutation im Ataxin-1 - Genprodukts verursacht , die progressive Degeneration der Purkinje - Neuronen des Kleinhirns löst und Neuronen aus anderen Hirnregionen. Die transgene Mauslinie hier (bezeichnet als SCA1 Maus) verwendet, die eine polyQ-Mutante unter der Kontrolle einer Purkinje-Zelle spezifischer Promotor Ataxin-1 - Transgen exprimiert, ermöglicht die gezielte Analyse der Purkinje-Zellkomponente von SCA1 5. SCA1 Mäuse unterziehen allmähliche Purkinje Zelldegeneration und entwickeln ataxic Gangart 6. Mitochondriale komplexe Dysfunktion und mitochondriale gezielte Wirksamkeit der Behandlung kann mit einer Batterie von molekularen und Verhaltenstests bewertet werden. Mitochondriale komplexe Dysfunktion gemessen ex vivo durch die Atmung Assays , die veränderte Sauerstoffverbrauch innerhalb des Kleinhirns Gewebe erkennen indas Vorhandensein von Elektronentransportkette Substrate und Inhibitoren 7. Respiration Assays mit permeabilisierten Gewebe, mitochondriale Isolate und ganze Gewebe 7, 8, 9 verwendete vorher. Sie ermöglichen eine direkte Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Gegensatz zu morphologischen Methoden der Datenerhebung wie Transmissionselektronenmikroskopie oder Immunfluoreszenzanfärbung. Die Verwendung von ganzen Gewebe anstatt isolierten Mitochondrien verhindert vorgespannte Auswahl an gesunden Mitochondrien , die 7 während des Isolierungsverfahrens auftreten können. Wenn das Protokoll angepasst, wie dargestellt, ist die Atmungs Assay eine wertvolle Methode für mitochondriale Dysfunktion in cerebellar neurodegenerative Krankheitszustände zu detektieren. Die nicht-spezifische Aktivatoren des Stoffwechsels verwendet werden, um die mitochondriale Dysfunktion in transgenen Mäusen Modellen neurodegenerativer diseas ableitene und die Hilfe bei der Entwicklung neuer Therapien. Quercetin, Coenzym Q10 und Kreatin wurden alle neurodegenerative Krankheitspathologie in Patienten und in Tiermodellen für neurodegenerative Krankheits 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 verbessern gezeigt. Hier stellen wir eine neue Stoffwechselaktivator, Bernsteinsäure, den Stoffwechsel zu stimulieren und die Funktion der Mitochondrien bei neurodegenerativen Erkrankung steigern. Um sicherzustellen , dass der Aktivator die Blut - Hirn - Schranke überquert, wurde HPLC verwendet Lieferung an Nervengewebe zu erkennen , in behandelten Mäusen 17. Um die therapeutischen Wirkungen von metabolisch gezielte wasserlösliche Verbindungen, wie Bernsteinsäure, eine Batterie von Verhaltensparadigmen und immunpathologische Studien bewerten können verwendet werden. Due zu den in Kleinhirns neurodegenerative Erkrankung gefunden Defizite der motorischen Koordination, sind der Ausleuchtzone Runway - Assay, Strahl - Assay und Beschleunigung rotierenden Stab - Test verwendet 6 Rettung von Verhaltens Pathologie zu erkennen, 18, 19. Diese Maßnahmen sind mit immunopathologischen Beurteilung cerebellar Zytoarchitektur ergänzt durch molekulare Schichtdicke (definiert als Purkinje Zelle dendritischen Dorn Länge) Beurteilung und Purkinje Zellsoma Zählwerte innerhalb eines definierten lobule von zerebellären Gewebe 6, 20, 21. Hier präsentieren wir mehrere neuropathologischen und Verhaltens Methoden zur Erkennung und Behandlung von mitochondriale Dysfunktion mit metabolisch gezielt wasserlösliche Verbindungen. Wir verwenden ex vivo Analyse der mitochondrialen Atmung mitochondriale Dysfunktion in der SCA1 tran zu analysierensgenic Maus. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Krankheitssymptome und Pathologie durch die wasserlöslichen mitochondrialen Booster Bernsteinsäure verbessert werden, weitere mitochondriale Dysfunktion in SCA1 Krankheitsprogression Verwicklung.

<table><tbody><tr><td>Adenosindiphosphat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2754</td><td>ADP</td></tr><tr><td>Ascorbat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>BSA</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Eselsserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Glutamat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1446600</td><td></td></tr><tr><td>Malat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6994</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumlactobionat</td><td>Bio-Zucker</td><td>69313-67-3</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Bernsteinsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime; -Tetramethyl-p-phenylendiamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7394</td><td>TMPD</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U0631</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedium</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>11NQ Antikörper (Anti-Ataxin-1 )</td><td></td><td></td><td>Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-Maus-Sekundärantikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin Antikörper (Ziege)</td> <td>Santa Cruz</td><td>C-20</td><td></td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontrolle transgener Mäuse</td><td>Harry Orr, Ph.D.</td><td>A02</td><td>Burright, et al. 1997, PMID: 9217978</td></tr><tr><td>SCA1-Mäuse</td><td>Harry Orr, Ph.D.</td><td>B05</td><td>Burright, et al. 1997, PMID: 9217978</td></tr><tr><td>Wildtyp-Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESM-100L Mikrotom</td><td>ERMA</td><td></td><td>Sledge Mikrotom</td></tr><tr><td>Fluoview FV1200 Konfokalmikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerin-Gelatine-Objektträger</td><td>FD Neuro Technologies</td><td>PO101</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze</td><td>Sigma Aldrich</td><td>VCAT 80465</td><td></td></tr><tr><td>OXYT1 Oxytherm Elektrodensteuergerät</td><td>Hansatech Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P.T.F.E. Papier</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-08277-15</td><td></td></tr><tr><td>Rotaillon Rotarod</td><td>PPP& G</td><td></td><td>Kontaktieren Sie den korrespondierenden Autor für Informationen</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 HPLC</td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a></td></tr><tr><td>Cell counter plugin (für ImageJ)</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a></td></tr><tr><td>3P& G Rota-Rod v3.3.3 (Rotarod-Software)</td><td>PPP& G</td><td></td><td>Wenden Sie sich an den korrespondierenden Autor, um Informationen Phidget21.dll zu erhalten</td></tr><tr><td>(erforderlich für Rotarod-Software)</td><td>DLL-Files.com</td><td></td><td><a href="https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html">https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html</a></td></tr></tbody></table>

die behandlung von sca1 mäuse, die mit wasserlöslichen verbindungen zu unspezifisch erhöhung mitochondriale funktion

Treating SCA1 Mice with Water-Soluble Compounds to Non-Specifically Boost Mitochondrial Function

Mitochondriale Dysfunktion spielt eine bedeutende Rolle im Alterungsprozess und bei neurodegenerativen Erkrankungen, darunter mehrere erbliche Spinozerebelläre Ataxie und andere Bewegung durch eine progressive Degeneration des Kleinhirns markierten Störungen. Das Ziel dieses Protokolls ist mitochondriale Dysfunktion in spinozerebelläre Ataxie Typ 1 (SCA1) und Bewertung der Wirksamkeit von pharmakologischen Targeting von Stoffwechselatmung über die wasserlösliche Verbindung Bernsteinsäure zu beurteilen, Fortschreiten der Krankheit zu verlangsamen. Dieser Ansatz ist auf andere cerebellar Krankheiten und kann zu einer Vielzahl von wasserlöslichen Therapien angepasst werden. Ex - vivo - Analyse der mitochondrialen Atmung wird verwendet , um zu erkennen und krankheitsbedingte Veränderungen in der Funktion der Mitochondrien zu quantifizieren. Mit genetischen Beweis (nicht veröffentlichte Daten) und Proteomik Beweise für mitochondriale Dysfunktion in der SCA1 Mausmodell bewerten wir die Wirksamkeit der Behandlung mit dem wasserlöslichen metabolischen Booster succinic Säure durch diese Verbindung direkt in den Käfig Trinkwasser auflösen. Die Fähigkeit des Medikaments, die Blut-Hirn-Schranke passieren kann mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) abgeleitet werden. Die Wirksamkeit dieser Verbindungen können dann mehrere Verhaltensparadigmen einschließlich der Beschleunigungs Rotarod, Schwebebalken Test und Fußabdruck-Analyse unter Verwendung getestet werden. Cytoarchitectural Integrität des Kleinhirns kann mit Immunfluoreszenztests bewertet werden, die Purkinje Zellkerne und Purkinje Zelle Dendriten und soma erkennen. Diese Verfahren sind robust Techniken zur Bestimmung mitochondriale Dysfunktion und die Wirksamkeit der Behandlung mit wasserlöslichen Verbindungen in cerebellar neurodegenerative Erkrankung.

Durch pharmakologische Targeting von zerebellären Mitochondrien mit Bernsteinsäure sind wir mitochondriale Dysfunktion in einem Mausmodell der zerebelläre neurodegenerative Erkrankung SCA1 zu verhindern können. Die kanonische Elektronendonor von Succinat - Dehydrogenase, Bernsteinsäure, wurde einen Monat lang in Käfig Trinkwasser von SCA1 Mäuse gelöst, mit Verhaltensbeurteilung zu Beginn in der zweiten Woche der Behandlung und neuropathologische Beurteilung nach der Behandlung (A...

Wir präsentieren ein biochemisches und verhaltensbezogenes Protokoll zur Bewertung der Wirksamkeit von wasserlöslichen Verbindungen, die auf Mitochondrien abzielen, zur Behandlung von spinozerebellärer Ataxie Typ 1 (SCA1) und anderen zerebellären neurodegenerativen Erkrankungen.

Die Behandlung von SCA1 Mäuse, die mit wasserlöslichen Verbindungen zu unspezifisch Erhöhung mitochondriale Funktion

Mitochondrial dysfunction plays a significant role in the aging process and in neurodegenerative diseases including several hereditary spinocerebellar ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die therapeutischen Effekte von wasserlöslichen mitochondrialen Aktivatoren auf das Kleinhirnverhalten und das Gewebe bei Mäusen mit spinaler zerebellärer Ataxie Typ 1 zu beobachten und zu quantifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der spinalen zerebellären Ataxie zu beantworten, wie z.B. ob mitochondriale Defizite zur Krankheitspathologie beitragen und ob die Krankheit durch einen wasserlöslichen mitochondrialen Aktivator behindert werden könnte. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Bernsteinsäure eine von der FDA zugelassene, kostengünstige wasserlösliche Verbindung ist, die über das Trinkwasser direkt in das Gehirn abgegeben werden kann.Die Implikationen dieser Technik können sich auf eine Therapie anderer neurodegenerativer Erkrankungen erstrecken, da Defizite in den mitochondrialen oxidativen Phosphorylierungskomplexen bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und der Huntington-Krankheit gefunden werden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten mit der anfänglichen Einrichtung der Verhaltensparadigmen haben, die möglicherweise angepasst werden müssen, um konsistente Ergebnisse zu erzielen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von Vorteil, da die Verhaltensschritte aus einem schriftlichen Methodenabschnitt möglicherweise schwer zu reproduzieren sind, aber mit Hilfe einer visuellen Aufzeichnung leicht zu replizieren sind.Um diesen Vorgang zu starten, stellen Sie die Landebahn in einem leichten Winkel nach oben in Richtung der Heimatbox ein, die mit Einstreu und Belohnungsfutter ausgekleidet ist. Legen Sie dann ein weißes Blatt Papier auf den Laufsteg. Lassen Sie die Maus fünf Minuten lang an die Home-Box gewöhnen.Nehmen Sie als Nächstes ein einzelnes Motiv und malen Sie den linken und rechten Hinterfuß mit blauer bzw. roter, ungiftiger Farbe auf Wasserbasis. Platzieren Sie anschließend das Motiv am Anfang des Laufstegs und lassen Sie es zur Home-Box laufen. Sobald das Subjekt die Heimbox erreicht hat, schließen Sie die Falltür und lassen Sie es eine Minute lang in der Heimbox bleiben, bevor es in den jeweiligen Heimkäfig zurückkehrt.Reinigen Sie dann den Laufsteg und die Homebox mit 30 % Ethanol und ersetzen Sie die Einstreu, das Belohnungsfutter und das Laufstegpapier für den nächsten Test. Sammeln Sie gleichzeitig das Start- und Landebahnpapier nach dem Experiment und inspizieren Sie den Versuch. Ein erfolgreicher Fußabdruckversuch ist definiert als mindestens fünf aufeinanderfolgende Fußabdrücke, bei denen der Proband auf die Goldbox zugeht, ohne sich umzudrehen oder anzuhalten.Richten Sie nun die Trägerapparatur nach den Vorgaben des Stabkreuzes mit sechs verschiedenen Balken ein. An einem Ende des Balkens stellte man eine abgedunkelte Heimkiste mit Belohnungsnahrung auf. Um Probanden auf dem Balken zu trainieren, bauen Sie das Gerät mit Balken drei zusammen.Platzieren Sie das Motiv vorsichtig auf dem Ende des Strahls, das der Home-Box gegenüberliegt. Und lassen Sie es über den Balken laufen. Erlauben Sie jedem Probanden bis zu drei zweiminütige Versuche, um einen erfolgreichen Lauf zu erzielen.Dies ist definiert als das Überqueren des Strahls und das Betreten der Home-Box innerhalb von zwei Minuten. Bauen Sie am vierten Tag des Balkentrainings das Gerät mit dem ersten Balken zusammen. Und richten Sie die Home-Box ein.Platzieren Sie eine Videokamera vor dem Gerät und vergewissern Sie sich, dass das Fernlichtgerät deutlich auf Video erfasst werden kann. Lassen Sie die Maus den Strahl durchqueren, indem Sie jeden Versuch auf Video aufzeichnen und die Anzahl der erfolgreichen Versuche pro Proband und Strahl aufzeichnen. In diesem Schritt gewöhnen Sie die Probanden 10 Minuten vor Beginn des Versuchs an ihr Bahnreservoir.Bereiten Sie während dieser Eingewöhnungsphase das Rotarod-Gerät vor, indem Sie jede Spur des Geräts mit 30 % Ethanol reinigen. Öffnen Sie als Nächstes die Rotarod-Software. Stellen Sie die Starteinstellungen auf vier U/min, die Beschleunigungseinstellungen auf fünf Minuten und die Endgeschwindigkeitseinstellungen auf 40 U/min ein, um eine konstante Beschleunigung von vier auf 40 U/min über einen Zeitraum von fünf Minuten zu gewährleisten.Platzieren Sie die Motive nach der Eingewöhnungsphase in ihren jeweiligen Bahnen auf dem Drehspieß, während sich der Stab mit vier Umdrehungen pro Minute dreht. Sobald sich alle Probanden in ihren jeweiligen Bahnen befinden, beginnen Sie mit dem ersten Versuch. Zeichnen Sie die zu sinkende Latenz mit der Gerätesoftware auf.Als Backup kann ein zweiter Timer verwendet werden. Lassen Sie jeden Probanden nach Abschluss des Versuchs 10 Minuten lang in seinen jeweiligen Bahnreservoirs ruhen, bevor Sie zum nächsten Versuch übergehen, um Ermüdung zu vermeiden. Befestigen Sie bei diesem Verfahren den Schlauch der Temperaturregelbox eines Schlittenmikrotoms von der Bühne an einer Spültischarmatur.Verwenden Sie die Temperierbox, um den Mikrotomtisch auf 28 Grad Celsius zu kühlen. Stellen Sie dann den Drehregler für die Schnittdicke auf 50 Mikrometer ein. Als nächstes tupfen Sie eine Cent-große Portion OTC-Lösung auf die Bühne.Bevor das OTC einfriert, positionieren Sie die Hemisphäre mit einer Pinzette so, dass die mittlere sagittale Schnittfläche mit der Vorderseite nach unten auf der OTC-Schicht liegt. Richten Sie das Gewebe schnell und vorsichtig so aus, dass die seitliche Spitze der Halbkugel zur Klinge zeigt. Überlegen über die Bühne.Arbeiten Sie in Schichten, fügen Sie zusätzliches OTC um das Gewebe hinzu und lassen Sie das OTC vollständig einfrieren, bevor Sie die nächste Schicht hinzufügen. Geben Sie dann eine dünne Schicht OTC auf das Tuch und frieren Sie es ein. Anschließend schneiden Sie das Gewebe mit gleichem Körpergewicht, verteilt auf die Schneidklinge.Sammeln Sie die Abschnitte mit einem Pinsel für Künstler. Und legen Sie sie in eine entsprechend beschriftete Well-Platte, die einen XPBS enthält. Setzen Sie die Schnittstärke zwischen den Abschnitten bei Bedarf auf 50 Mikrometer zurück.Ersetzen Sie nach dem Schneiden das PBS in jeder Vertiefung der Platte durch Harnstofflösung. Und lege den Teller auf Eis. Wenn Sie fertig sind, stellen Sie die Platte auf Siedetemperatur in einen Heizblock, um die Abschnitte in Harnstofflösung zu kochen, um die Epitope für die Immunmarkierung zu demaskieren.Kühlen Sie zwischen den einzelnen Siedeschritten die Platte mit den Gewebeabschnitten auf Eis ab. Waschen Sie die Abschnitte nach dem Kochen dreimal, ersetzen Sie die vorhandene Lösung durch eine XPBS und rühren Sie die Abschnitte 10 Minuten lang um. Blockieren Sie dann die Abschnitte mit Eselsserumlösung, indem Sie sie eine Stunde lang unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur im Serum inkubieren.Abschnitte können nun gebeizt werden. Nach der Beschriftung die Abschnitte mit Eindeckmedium auf 2 % gelatinebeschichtete Objektträger aufkleben, um das Photobleichen zu reduzieren. Abdecken, einschieben und über Nacht bei vier Grad Celsius trocknen.Anschließend die Deckgläser mit Nagellack verschließen und bei vier Grad Celsius lagern. Lokalisieren Sie mit einem konfokalen Rastermikroskop die primäre Fissur des Kleinhirns unter dem Hellfeldlicht. Der wichtigste Schritt des Aminoassays besteht darin, das Kleinhirngewebe in den Modulen fünf und sechs A, die die primäre Fissur flankieren, genau zu lokalisieren.Die Analyse von Färbemustern und inkonsistenten Läppchen sorgt für Variabilität in Ihrem Ergebnis. Mit einem 10-fachen Objektiv können Sie DAPI-, Alexa Fluor 488- und Alexa Fluor 594-Kanäle scannen und sequenziell anregen. Unter Verwendung eines 405-Nanometer-Diodenlasers, eines 488-Nanometer-Argon-Gaslasers bzw. eines 559-Nanometer-Diodenlasers in Verbindung mit einem dichroitischen Strahlteiler DM 488559 Nanometer.Trennen und sammeln Sie dann das emittierte Licht mit den Strahlteilern SDM 490 und SDM 560 bzw. einem Bandpassfilter BA 575675. Bernsteinsäure wurde ab einem Alter von 17 Wochen vier Wochen lang im Trinkwasser von SCA1-Mäusen in häuslichen Käfigen gelöst. SCA1-Mäuse beginnen im Alter von fünf Wochen den Ataxie-Phänotyp zu zeigen.Die Verhaltensbewertungen wurden während des Behandlungszeitraums wie folgt durchgeführt. Fußabdruck-Assay in Woche 17. Strahlprobe in Woche 18 und Beschleunigung des Rotarods in Woche 19.Im Alter von 20 Wochen wurden Mäuse getötet und Kleinhirngewebe für Aminopathologie-Assays, HPLC-Assays und Atmungsassays entnommen. Hier sind die repräsentativen Daten aus dem Footprint-Assay, die ein mit Vehikel behandeltes Wildtyp-Gate, ein mit Vehikel behandeltes SCA1-Gate und ein mit Bernsteinsäure behandeltes SCA1-Gate zeigen. Hier zeigen die Daten der Strahlanalyse die Verbesserung der Strahlleistung von SCA1-Mäusen mit Bernsteinsäurebehandlung.Die Bernsteinsäurebehandlung verbessert die Beschleunigung der Rotarod-Leistung von SCA1-Mäusen erheblich, was sich in einer erhöhten Latenz bis zum Sturz zeigt. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, die Technik über mehrere Versuche hinweg konsequent auf jeden Probanden anzuwenden. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die mitochondriale Atmung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Verbesserung der Atmung durch einzelne oxidative Phosphorylierungskomplexe nach der Bernsteinsäureabgabe.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man verhaltensbezogene und neuropathologische Assays durchführt. Diese bewerten die Verbesserung des Kleinhirnverhaltens und der Zytoarchitektur.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

In diesem Video führen wir den Beschleunigungstest mit rotierendem Stab oder Rotarod durch, um die motorische Koordination und das Lernen bei Mäusen zu bewerten.

Der Accelerating Rotating Rod Assay oder Rotarod-Test: Eine Methode zum Testen der motorischen Koordination und des Lernens bei Mäusen

Mitochondriale Dysfunktion ist ein Markenzeichen von Zellalterung. Dieser Aufsatz benutzt nicht-invasive nahen Infrarot (NIR) Behandlung die Mitochondrienfunktion im alternden Maus vestibulären Sinnesepithel verbessern.

Nahes Infrarot (NIR) Licht Erhöht Ausdruck einer Markierung der Funktion der Mitochondrien im Maus Vestibular Sinnesepithel

Modelle von Kolon Entzündung murine Studien haben gezeigt, dass ein kleiner Prozentsatz (1-5 %) von mesenchymalen Stammzellen (MSC) intravenös injiziert oder intraperitoneal beherbergt die entzündeten Darm1,2. Diese Studie zeigt, dass Ultraschall-geführte intrakardiale Injektionen von MSCs erhöhte Lokalisierung in den Darm führen.

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Das Verständnis des Einflusses von Umweltorganochlor-Pestiziden (OCPs) auf die mitochondriale Funktion in Hepatozyten ist wichtig bei der Erforschung des Mechanismus von OCPs, die Stoffwechselstörungen verursachen. In diesem Beitrag werden detaillierte Methoden zum Nachweis der hepatischen mitochondrialen Funktion beschrieben.

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Erforschung des mitochondrialen Energiestoffwechsels einzelner 3D-Mikrogewebesphäroide mittels extrazellulärer Flussanalyse

Hier beschreiben wir die mikropipettengesteuerte Arzneimittelverabreichung (MDA) als eine alternative Methode zur oralen Sonde, die das Versuchstier dazu anregt, Behandlungen ohne weiteres und mit minimalem Stress und Unbehagen einzunehmen.

Verwendung der Mikropipetten-gesteuerten Verabreichung von Medikamenten als alternative Methode zur oralen Sonde in Nagetiermodellen

Hirnorganoide dienen als wertvolles Modell für Studien zu mitochondrialer Enzephalomyopathie, Laktatazidose und schlaganfallähnlichen Episoden (MELAS), indem sie Einblicke in ihre zugrunde liegende Pathophysiologie bieten und eine Plattform für das Wirkstoffscreening bieten. Organoide, die aus Zelllinien mit unterschiedlichem Grad an Heteroplasmie von krankheitsverursachenden Genen stammen, weisen signifikante phänotypische Unterschiede auf.

Modellierung mitochondrialer Erkrankungen anhand von Hirnorganoiden: Ein Fokus auf mitochondriale Enzephalomyopathie, Laktatazidose und schlaganfallähnliche Episoden

Lokale Injektionen einer mitochondrialen Farbstoffbeschriftung terminaler Schwann-Zellmitochondrien in vivo zur konfokalen Mikroskopie. Diese Methode nutzt einen Proof of Concept, der im Skelettgewebe von Mäusen mit gesunden oder kranken Muskeln demonstriert wurde, um eine hochauflösende mitochondriale Visualisierung zu ermöglichen.

Methoden zur In-situ-Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie in Muskel- und terminalen Schwannzellen von Mäusen

Eine nicht-invasive Verfahren zur Endothelfunktion beurteilen wird mit Hilfe des Endo-PAT 2000.

Die Beurteilung Endothelial Vasodilator-Funktion mit der Endo-PAT 2000

Erfahren Sie eine biochemische und verhaltensbiologische Methode zur Behandlung von SCA1-Mäusen mit wasserlöslichen mitochondrialen Aktivatoren wie Bernsteinsäure. Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung therapeutischer Effekte auf zerebelläres Verhalten und Gewebe.

Die Behandlung von SCA1 Mäuse, die mit wasserlöslichen Verbindungen zu unspezifisch Erhöhung mitochondriale Funktion

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