Herstellung von Ratten Oligodendrozyten Vorläuferkulturen und Quantifizierung von Oligodendrogenesis Mit Doppel-Infrarot-Fluoreszenz-Scanning

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Oligodendrozyten-Vorläuferzellen von Ratten zu isolieren und zu kultivieren und die Oligodendrogenese als Reaktion auf experimentelle Faktoren zu quantifizieren. Eine effiziente Oligodendrogenese ist das therapeutische Ziel in zahlreichen Forschungsbereichen, darunter Rückenmarksverletzungen, neonatale Hypoxie und demyelinisierende Erkrankungen wie transversale Myelitis und Multiple Sklerose. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein Protokoll für die Isolierung einer großen Anzahl von OPCs mit einer schnellen und zuverlässigen Methode zur Bestimmung der Oligodendrogenese unter mehreren experimentellen Bedingungen gleichzeitig kombiniert.

Um diesen Vorgang zu starten, sterilisieren Sie alle Dissektionsgeräte mit einem beheizten Bead-Sterilisator. Geben Sie dann 15 bis 20 Milliliter PBS in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie das konische Röhrchen auf Eis und verwenden Sie es, um das gewürfelte Kortexgewebe während der Dissektion zu halten.

Geben Sie als Nächstes kaltes PBS in eine 10 Zentimeter große Petrischale, die zum Sezieren unter dem Lichtmikroskop verwendet wird. Nachdem Sie die Rattenbabys geopfert haben, schneiden Sie die Haut hinter den Ohren entlang der Mittellinie mit einer kleinen Schere auf. Und schäle die Hautklappen zurück.

Als nächstes schneidest du den Schädel entlang der Mittellinie vom Hirnstamm bis zu den Augen. Und achten Sie darauf, nicht zu tief zu schneiden, um die Struktur des darunter liegenden Kortex zu erhalten. Machen Sie danach zwei seitliche Schnitte unterhalb des Kleinhirns, indem Sie eine kleine chirurgische Schere in das Foramen magnum einführen.

Machen Sie einen zusätzlichen Schnitt zwischen den Augen vor den Riechkolben. Schälen Sie vorsichtig jede Hälfte des Schädels zurück. Entnehmen Sie das gesamte Gehirn und legen Sie es in eine 10 Zentimeter große Petrischale, die mit kaltem PBS gefüllt ist.

Entfernen Sie unter einem Präparierlichtmikroskop die Riechkolben und das Kleinhirn mit einer feinen chirurgischen Zange. Drehen Sie das Gehirn so, dass die Bauchfläche sichtbar ist. Führen Sie dann mit einer feinen geraden Pinzette eine stumpfe Dissektion durch, indem Sie geschlossene Pinzettenspitzen zwischen der Rinde und dem Hypothalamus bis zu einer Tiefe von etwa zwei Dritteln des Gehirns platzieren.

Öffnen Sie die Pinzette, sobald sie an Ort und Stelle ist, und wiederholen Sie dann den Vorgang für die andere Hemisphäre. Danach reizen Sie den Kortex aus dem Hypothalamus und der Mittelhirnregion. Entfernen Sie den Hypothalamus, den Thalamus und das Mittelhirn, indem Sie das Mittelhirn an seiner hinteren Oberfläche halten und es zum vorderen Ende des Gehirns hin schälen.

Durchtrennen Sie anschließend die vorderen Verbindungen. Entfernen Sie mit einer fein gebogenen Präparierzange den Hippocampus und durchtrennen Sie seine Verbindung zur Hirnrinde. Entfernen Sie dann das verbleibende Striatum, indem Sie es in einer diagonalen Bewegung nach außen vom darunter liegenden Kortex abkratzen.

Befreien Sie die Blutgefäße und Hirnhäute von der ventralen Oberfläche der Hirnrinde. Drehen Sie als Nächstes das Gehirn um, so dass die dorsale Oberfläche sichtbar ist. Entferne die Hirnhäute von der darunter liegenden Rinde, wo sich der Riechkolben befindet.

Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt drei bis vier Rattenwelpen. Und legen Sie alle präparierten Kortexe in eine Petrischale. Hacken Sie sie mit einer sterilisierten Rasierklinge, bis ein Millimeter mal ein Millimeter große Stücke entstehen.

Sammeln Sie dann die Taschentücher, indem Sie die Schale mit PBS ausspülen, bevor Sie sie wieder auf Eis legen. Dissoziieren Sie nun das Gewebe mit einer Pasteur-Glaspipette, die an einer Pipettierhilfe befestigt ist, mechanisch, indem Sie es zehn- bis fünfzehnmal pipettieren oder bis die Gewebestücke verkleinert sind und die Lösung trüb geworden ist. Geben Sie die Probe anschließend für 15 Minuten mit kontinuierlicher Rotation in den 37 Grad Celsius heißen Gewebekultur-Inkubator zurück.

Geben Sie danach 10 Milliliter PBS zu jeder Probe und filtrieren Sie das Homogenat durch einen 40-Mikrometer-Porenfilter, der über einem 50-Milliliter-Röhrchen platziert ist. Spülen Sie dann den Filter mit weiteren ein bis zwei Millilitern PBS. Fassen Sie alle Homogenatproben in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und erfassen Sie eine Gesamtzellzahl.

Nach der Zellzählung wird das Homogenat gleichmäßig in die konischen 15-Millileter-Röhrchen aufgeteilt und 10 bis 12 Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Grundieren Sie jede LS-Spalte, indem Sie fünf Milliliter Säulenpuffer hinzufügen. Und sammeln Sie den Durchfluss durch ein konisches 15-Milliliter-Rohr.

Sobald der Säulenpuffer die obere Kammer vollständig durchlaufen hat, tragen Sie 1000 Mikroliter der Zellsuspension auf jede Säule auf und lassen Sie die Zellen durch die Schwerkraft durchlaufen. Entfernen Sie dann jede Säule und legen Sie sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie fünf Milliliter Säulenpuffer hinzu und tauchen Sie den Puffer schnell durch die Säule, um die gebundenen Zellen zu lösen und aus der Säule zu lösen.

Um die Zellen zu plattieren, verdünnen Sie sie mit OPC-Proliferationsmedien auf 60.000 Zellen pro Milliliter. Pipettieren Sie 500 Mikroliter Zellen entlang der Seite jeder schwarzen, durchsichtigen Vertiefung einer 24-Well-Platte. Mischen Sie die Zellen, indem Sie die Platte horizontal mit einer Achterbewegung schütteln.

Platzieren Sie bei diesem Verfahren eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze über einer Pasteur-Glaspipette, um sicherzustellen, dass die Vertiefung während der Aspiration nicht beschädigt wird. Aspirieren Sie dann das Medium jeweils eine Behandlungsgruppe aus den Kulturvertiefungen, um ein Austrocknen der Zellen zu vermeiden. Geben Sie danach mit einer Ein-Milliliter-Pipette langsam 500 Mikroliter Mastermix entlang der Seite der Vertiefung

Inkubieren Sie die Kulturen und führen Sie alle zwei bis drei Tage einen vollständigen Medienaustausch mit frischen Behandlungsmedien durch. Am Ende der gewünschten Behandlungsdauer wird das Medium abgesaugt. Geben Sie langsam 400 Mikroliter PFA an die Seite der Vertiefung, um die Zellen zu fixieren.

Und die Platte 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach 20 Minuten aspirieren Sie PFA und fügen Sie langsam 500 Mikroliter steriles D-PBS hinzu, um die Zellen zu waschen. Wiederholen Sie die Wäsche noch zwei Mal und saugen Sie die letzte Wäsche nicht ab.

Bringen Sie nun die Platte auf Raumtemperatur, saugen Sie die Vertiefungen an und fügen Sie 250 Mikroliter D-PBS hinzu, die fünf Prozent NGS und 0,1 Prozent Triton x-100 enthalten. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Orbitalschütteln. Bereiten Sie die primäre Inkubationslösung vor, indem Sie den monoklonalen Anti-MBP-Antikörper der Maus und den polyklonalen Anti-Olig2-Antikörper des Kaninchens in D-PBS verdünnen, das fünf Prozent NGS enthält.

Dann inkubieren Sie die primären Antikörper über Nacht 16 bis 18 Stunden lang bei vier Grad Celsius unter leichtem Orbitalschütteln. Bereiten Sie beim Waschen der Platte die sekundäre Inkubationslösung vor, indem Sie die Anti-Maus-Antikörper 680 und die Anti-Kaninchen-800-Antikörper in D-PBS verdünnen, die fünf Prozent NGS enthalten. Als nächstes aspirieren Sie die letzte Wäsche und fügen Sie 250 Mikroliter sekundäre Inkubationslösung hinzu.

Schützen Sie die Platte vor Licht und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schwingen. Scannen Sie danach die Platte mit einem bildgebenden System, das Fluoreszenzemissionen von 700 Nanometern und 800 Nanometern nachweisen kann. Legen Sie als Ausgangspunkt den Fokusversatz auf drei und die Sensitivitäten auf eins Komma fünf für MBP, fünf Komma Null für Aktin und drei Komma fünf für olig2 fest.

Passen Sie die Empfindlichkeitswerte nach Bedarf an, um eine Überbelichtung des Signals zu vermeiden. In diesem Schema beginnt der DIFS-Assay mit frisch isolierten A2B5-positiven Ratten-OPCs, die auf PLL-kodierten Kulturgefäßen plattiert werden. Diese Kulturen werden drei Tage lang in Gegenwart von 20 Nanogramm pro Milliliter PDGFAA proliferiert und dann am Tag Null mit experimentellen Faktoren in frischen PDGF-freien Medien behandelt.

Das Behandlungsmedium wird am zweiten Tag vollständig aufgefüllt. Und die Zellen werden am vierten Tag mit 4 Prozent Paraformaldehyd fixiert. Hier wurde die Immunzytochemie für Olig2 und MBP an den repräsentativen Kulturen am Tag Null und am vierten Tag unter Verwendung von Dapi als nukleärer Gegenfärbung durchgeführt.

Diese Kulturen weisen an den Tagen null und vier eine konstitutive Färbung für den Zellmarker der Pan-Oligodendrozytenlinie, Olig2, auf. Während die Färbung für reife Oligodendrozytenmarker MBP erst am vierten Tag offensichtlich war. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie A2B5-positive OPCs an der Ratte gereinigt, kultiviert und differenziert werden können, um die Wirkung experimenteller Faktoren auf die Oligodendrogenese zu quantifizieren.

Die Identifizierung von Faktoren, die die Oligodenrogenese begünstigen, ist von besonderer Bedeutung für die Erforschung von demyelinisierenden Erkrankungen wie Multipler Sklerose. Einmal gemeistert, können die hier beschriebenen Techniken dazu beitragen, solche Faktoren zu identifizieren und letztendlich bessere Therapeutika zu entwickeln.