Name: Herstellung von Ratten Oligodendrozyten Vorläuferkulturen und Quantifizierung von Oligodendrogenesis Mit Doppel-Infrarot-Fluoreszenz-Scanning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Kultivierung von Ratten-Oligodendrozyten-Vorläuferzellen sowie die Quantifizierung der Oligodendrogenese. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Untersuchungen zur Myelinisierung.

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<li>Deshmukh, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regenerative+approach+to+the+treatment+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis.</a> Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-based+modulation+of+endogenous+stem+cells+promotes+functional+remyelination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo.</a> Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).</li>
<li>Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+glial+cells+during+CNS+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Defining glial cells during CNS development.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).</li>
<li>O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+enriched+oligodendrocyte+cultures+and+oligodendrocyte%2Fneuron+myelinating+co-cultures+from+post-natal+murine+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Dugas, J. C., Emery, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+oligodendrocyte+precursor+cells+from+rat+cortices+by+immunopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).</li>
<li>Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+multiple+sclerosis+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das Protokoll hier vorgestellte beschreibt ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Isolierung von Ratten-OPCs und in vitro oligodendrogenesis in Reaktion auf experimentelle Faktoren zu quantifizieren. Mit positiven Selektion, hohe Ausbeuten an lebensfähig und rein OPCs werden direkt zu Versuchszwecken verwendet. Dieses Verfahren vereinfacht die Isolierung, Kultivierung und Differenzierung Schritte in 1-wöchige Zeitrahmen und fixierten Zellen können bequem bei 4 ° C über mehrere Wochen ohne Verlust an Assa...

Efficient Nervenleitung in der Säugetiere Zentralnervensystem (ZNS) erfordert Myelinisierung von Axonen durch Oligodendrozyten. Während der Entwicklung entstehen Oligodendrozyten aus einem Pool von Oligodendrozyten-Progenitorzellen (OPC), die gedacht werden, von den ventrikulären Zonen der Entwicklung des Vorderhirns und Neuralrohr 1 zu migrieren. Nach der Migration OPCs zu reifen unterscheiden, myelinisierenden Oligodendrozyten, die nicht nur effizient Impulsausbreitung zu erleichtern, sondern auch Axone mit trophischen Unterstützung 2 liefern. Die adulten ZNS unterhält eine reichliche Population von OPCs, die während der grauen und weißen Substanz dispergiert sind, die ungefähr 5-8% aller Zellen 3. Nach einer demyelinisierenden Beleidigung, wandern OPCs zu der Stelle der Verletzung, vermehren und differenzieren verlorenen oder beschädigten Myelinscheiden an exponierten Axone zu ersetzen. Doch in einigen Krankheit / Verletzung Einstellungen wird dieses Verfahren ineffizient zu sein oder ganz ausfallen 4 gefunden. Währendchronische Demyelinisierung wird gedacht, um die Krankheitslast, effiziente oligodendrogenesis und Remyelinisierung kostenlos in fünf Symptome zu lindern. Es ist daher von Interesse gewesen OPCs in vitro zu studieren die Wirkung der experimentellen Faktoren auf oligodendrogenesis zu bestimmen. Einblick in die verschiedenen Phasen der Oligodendrozyten-Differenzierung wurde durch die Identifizierung von Stufe spezifische Zellmarker ermöglicht worden. Selbst erneuernden frühen Vorläuferzellen durch ihre Expression von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor-Rezeptor alpha (PDGFRα), neuronalen / Glia-Antigen 2 (NG2) und A2B5 6 definiert sind - 8. Als OPC ihre Differenzierungsprogramm und ziehen sich aus dem Zellzyklus einleiten, herunterregulieren sie Expression dieser Marker und beginnen Proteine ​​zu exprimieren bezeichnend für Oligodendrozyten mit zyklisch-Nukleotid-3&#39;-Phosphodiesterase (CNPase) und O4 premyelinating. Schließlich deren Differenzierung in reiferen oligodendrocytes wird durch die Expression von Myelin-assoziierten Proteine, einschließlich Myelin-assoziiertes Glykoprotein (MAG), Proteolipidprotein (PLP) und basisches Myelinprotein (MBP) aus. MBP ist ein intrazelluläres peripheren Membranprotein und ein Hauptbestandteil der Myelinscheide. Mäuse entwickeln fehlt MBP einen schweren Phänotyp, in dem CNS Myelinisierung deutlich zu Zittern verringert führt, ist, Krämpfe und frühen Tod 9,10. Diese wichtige Rolle der MBP in Myelinisierung hat zu seiner Verwendung als ein Marker für Oligodendrozyten Differenzierung führte sowohl in vitro als auch in vivo 11. Quantifizierung von MBP kann mit verschiedenen Methoden erreicht werden. RT-PCR und Western Blot-Analyse ermöglichen eine Quantifizierung der MBP-Niveaus unter verschiedenen Behandlungsschemata. Immunzytochemie ist eine gemeinsame qualitative Ansatz, der auch quantitativ sein können, wenn die Kamera-basierte Mikroskopie Ansätze verwendet werden. Obwohl diese Systeme sind zuverlässig und grundlegenddas Studium der Oligodendrozyten-Differenzierung, sie haben jeweils ihre eigenen Nachteile, die ihre Verwendung in Arzneimittel-Screening begrenzen. Erstens, die Menge der primären OPCs, die für RT-PCR und Western Blot-Analyse erforderlich sind, reduziert die Anzahl der Variablen, die gleichzeitig untersucht werden können. Während die Zelle Voraussetzung für Immunzytochemie viel niedriger ist, müssen erhebliche Zeit zu jedem Experiment gewidmet werden, wenn die Quantifizierung ist das Ziel. Zahlreiche Bilder müssen experimentelle Analyse zu erleichtern eingefangen und dann quantifiziert werden. Diese Einschränkungen werden wichtige Hindernisse für Studien zu berücksichtigen, die einen hohen Durchsatz Beurteilung erfordern. Hier beschreiben wir eine Methode, die grundlegenden Aspekte von nutzt sowohl der Immunzytochemie und Western Blot Methoden zur Quantifizierung Myelin, während erheblich sowohl die Anzahl von Zellen erforderlich ist und die Zeit zu reduzieren quantitative Analyse durchzuführen.

<table><tbody><tr><td>Dissection Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS ohne Ca2+ und Mg2+</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>10 cm Petrischalen aus Polystyrol</td><td>Fisherbrand</td><td>0857512</td><td></td></tr><tr><td>Light Dissektionsmikroskop</td><td></td><td>Motic SM2-168</td><td></td></tr><tr><td>Dissoziation Materialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube Rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>Dissoziationsrohr Rotator</td></tr><tr><td>Neuralgewebe Dissoziationskit (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td>Enzymatisches Dissoziationskit</td></tr><tr><td>PBS mit Ca2+ und Mg2+</td><td>Corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>40 &mu; m Zellsieb</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>A2B5 Säulenreinigung&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-A2B5 Mikrokügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-864</td><td>Bead Bound A2B5 Antikörper</td></tr><tr><td>LS Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Magnetische Selektionssäulen</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>PBS mit Ca2+ und Mg2+</td><td>Corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>0,50 %</td></tr><tr><td><stark>Kulturmaterialien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-13A</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Hybri-Max 100 ml</td></tr><tr><td>Trijodthyronin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td>45 nM</td></tr><tr><td>Clemastinfumaratsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0445-100MG</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>Quetiapin Hemifumarat Salz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q3638-10MG</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165 5</td><td>&mu; g/ml</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>60 ng/ml</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td>10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Putrecin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7505 16</td><td>&mu; g/ml</td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td>40 ng/ml</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0135</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>d-Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634 5</td><td>&mu; g/ml</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td>100 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4161</td><td>100 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Spurenelemente B</td><td>Corning</td><td>25-022-Cl</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>B-27 Ergänzung</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>24-Well-Schwarze Visiplate mit Deckel</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-605</td><td>Gewebekulturqualität</td></tr><tr><td><stark>Immunzytochemie und Quantifizierung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100-13A</td><td>4%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78787</td><td>0,10%</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>005-000-121</td><td>5 %</td></tr><tr><td>monoklonales Anti-MBP für Maus</td><td>Biolegend</td><td>SMI-99P</td><td>1:1.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Kaninchen polyklonales Anti-Aktin</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>SC-7210</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Kaninchen polyklonal anti-Olig2</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>1:1.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus 680RD</td><td>Licor</td><td>926-68070</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen 800CW</td><td>Licor</td><td>926-32211</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Ziege Anti-Maus</td><td>Life Technologies</td><td>A11032</td><td>1:1.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>1:1.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifading mit DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>DPBS mit Ca2+ und Mg2+</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Licor Odyssey Clx Infared Imaging System</td><td>Licor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von ratten oligodendrozyten vorläuferkulturen und quantifizierung von oligodendrogenesis mit doppel-infrarot-fluoreszenz-scanning

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

Effiziente Oligodendrogenese ist das therapeutische Ziel einer Reihe von Forschungsbereichen, einschließlich Rückenmarksverletzungen, neonataler Hypoxie und demyelinisierender Krankheiten wie Multiple Sklerose und transversale Myelitis. Die Myelinisierung ist nicht nur erforderlich, um eine schnelle Impulsausbreitung innerhalb des Zentralnervensystems zu ermöglichen, sondern auch, um die darunter liegenden Axone trophisch zu unterstützen. Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) können in vitro untersucht werden, um Faktoren zu identifizieren, die die Differenzierung von Oligodendrozyten fördern oder hemmen können. Bisher waren viele der verfügbaren Methoden zur Bewertung dieses Prozesses entweder für eine große Anzahl von Zellen erforderlich, was die Anzahl der gleichzeitig zu untersuchenden Bedingungen einschränkte, oder für arbeitsintensive Methoden der Quantifizierung. Darin beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung einer großen Anzahl hochreiner OPCs zusammen mit einer schnellen und zuverlässigen Methode zur Bestimmung der Oligodendrogenese aus mehreren Bedingungen gleichzeitig. OPCs werden aus P5-P7 neonatalen Rattenkortiken isoliert und vor der Differenzierung drei Tage lang in vitro gezüchtet. Vier Tage nach der Differenzierung wird die Oligodendrogenese mit einem Dual-Infrarot-Fluoreszenz-Scanning-Assay bewertet, um die Expression des Myelinproteins zu bestimmen.

A2B5-positiven OPCs werden durch positiven Zellselektion isoliert eine magnetische Trennsäule System. Vor dem Isolierungsverfahren wird das gesamte Gehirn von Rattenjungen entfernt, die zwischen P5 und P7 sind. Sobald das gesamte Gehirn erfolgreich vom Schädel gelöst wird, werden die Riechkolben und Kleinhirn unter Verwendung von feinen chirurgischen Pinzette (1A) entfernt. Um sich durch sorgfältige Dissektion (1B) ausgeschnitten Gehirnrindengewebe der H...

Oligodendrozyten sind die myelinisierenden Zellen des Zentralnervensystems. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung ihrer Vorläufer, der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, aus der Rattenrinde sowie eine schnelle und zuverlässige quantitative Methode zur Bewertung der Oligodendrogenese in vitro als Reaktion auf experimentelle Faktoren.

Herstellung von Ratten Oligodendrozyten Vorläuferkulturen und Quantifizierung von Oligodendrogenesis Mit Doppel-Infrarot-Fluoreszenz-Scanning

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Vorläuferzellen oligodendrozytärer Zellen aus Ratten zu isolieren und zu kultivieren sowie die Oligodendrozytogenese als Reaktion auf experimentelle Faktoren zu quantifizieren. Eine effiziente Oligodendrozytogenese ist das therapeutische Ziel in zahlreichen Forschungsbereichen, darunter Rückenmarksverletzungen, neonatale Hypoxie und demyelinisierende Erkrankungen wie die transverse Myelitis und Multiple Sklerose. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein Protokoll zur Isolierung großer Zahlen von OPCs mit einer schnellen und zuverlässigen Methode kombiniert, um die Oligodendrozytogenese unter mehreren experimentellen Bedingungen gleichzeitig zu bestimmen.Um dieses Verfahren zu beginnen, sterilisieren Sie alle Dissektionsgeräte mit einem erhitzten Perlen-Sterilisator. Geben Sie anschließend 15 bis 20 Milliliter PBS in ein 50-Milliliter-Konischgefäß. Stellen Sie das Konischgefäß auf Eis und verwenden Sie es, um das zerkleinerte kortikale Gewebe während der Dissektion aufzubewahren.Fügen Sie anschließend kaltes PBS einer 10 cm großen Petrischale hinzu, die für die Dissektion unter dem Lichtmikroskop verwendet wird. Nachdem die Rattenwelpen getötet wurden, schneiden Sie mit einer kleinen Schere entlang der Mittellinie die Haut hinter den Ohren auf und klappen Sie die Hautlappen zurück.Als Nächstes schneiden Sie den Schädel entlang der Mittellinie vom Hirnstamm bis zu den Augen auf. Achten Sie darauf, nicht zu tief zu schneiden, um die Struktur der darunterliegenden Großhirnrinde zu erhalten. Danach führen Sie zwei seitliche Schnitte unterhalb des Kleinhirns aus, indem Sie kleine chirurgische Scheren in das Foramen magnum einführen.Führen Sie einen zusätzlichen Schnitt zwischen den Augen vor den Riechkugeln durch. Klappen Sie vorsichtig jede Hälfte des Schädels nach hinten zurück. Entfernen Sie das gesamte Gehirn und legen Sie es in eine 10 cm große Petrischale, die mit kaltem PBS gefüllt ist.Entfernen Sie unter einem Stereomikroskop mit feinen chirurgischen Pinzetten die Riechkolben und das Kleinhirn. Drehen Sie das Gehirn um, sodass die ventrale Fläche sichtbar ist. Führen Sie dann mit einer feinen geraden Pinzette eine stumpfe Dissektion durch, indem Sie die geschlossenen Pinzettenspitzen zwischen Kortex und Hypothalamus bis zu einer Tiefe von etwa zwei Dritteln des Gehirns einführen.Öffnen Sie die Pinzette, sobald sie richtig positioniert ist, und wiederholen Sie den Vorgang dann für die andere Hemisphäre. Danach lösen Sie die Großhirnrinde vorsichtig von den Regionen des Hypothalamus und Mittelhirns. Entfernen Sie den Hypothalamus, Thalamus und das Mittelhirn, indem Sie das Mittelhirn an seiner hinteren Oberfläche festhalten und es in Richtung des vorderen Endes des Gehirns abziehen.Schneiden Sie anschließend die vorderen Verbindungen durch. Entfernen Sie mit feinen gebogenen Präparationspinzetten das Hippocampus und trennen Sie dessen Verbindung zur Hirnrinde. Entfernen Sie dann den verbleibenden Striatum, indem Sie ihn in einer schrägen, nach außen gerichteten Bewegung von der darunterliegenden Hirnrinde abkratzen.Entfernen Sie die Blutgefäße und Hirnhäute von der ventralen Oberfläche der Großhirnrinde. Drehen Sie anschließend das Gehirn um, sodass die dorsale Oberfläche sichtbar ist. Lösen Sie die Hirnhäute von der darunterliegenden Großhirnrinde im Bereich, in dem der Riechkolben liegt.Wiederholen Sie die Verfahren insgesamt für drei bis vier Rattenwelpen. Legen Sie alle isolierten Cortexgewebe in eine Petrischale. Zerkleinern Sie sie mit einer sterilisierten Rasierklinge, bis Stücke von jeweils einem Millimeter mal einem Millimeter erreicht sind.Anschließend sammeln Sie das Gewebe, indem Sie die Schale mit PBS spülen, bevor Sie sie wieder auf Eis stellen. Zerlegen Sie nun das Gewebe mechanisch, indem Sie es mit einer an einen Pipettierhilfe angeschlossenen Glas-Pasteur-Pipette zehn bis fünfzehn Mal auf- und abpipettieren oder bis die Gewebestücke kleiner geworden sind und die Lösung trüb geworden ist. Danach bringen Sie die Probe für 15 Minuten in den 37 Grad Celsius warmen Zellkultur-Inkubator zurück, wobei eine kontinuierliche Rotation aufrechterhalten wird.Danach 10 Milliliter PBS zu jeder Probe hinzufügen und das Homogenat durch einen 40-Mikrometer-Filter, der über einem 50-Milliliter-Röhrchen platziert ist, filtrieren. Anschließend den Filter mit zusätzlichen ein bis zwei Millilitern PBS spülen. Alle Homogenatproben in einem 50-Milliliter-Konischglas sammeln und eine Gesamtzellzahl bestimmen.Nach der Zellzählung das Homogenat gleichmäßig auf die 15-Milliliter-Kegelröhrchen aufteilen und 10 bis 12 Minuten bei 300 × g zentrifugieren. Jede LS-Säule durch Zugabe von fünf Milliliter Säulenpuffer vorbereiten und den Durchlauf in einem 15-Milliliter-Kegelröhrchen auffangen.Sobald der Säulenpuffer vollständig durch die obere Kammer gelaufen ist, pipettieren Sie 1000 Mikroliter der Zellsuspension auf jede Säule und lassen Sie die Zellen durch Schwerkraft durchlaufen. Entfernen Sie danach jede Säule und stellen Sie sie in ein 15-Milliliter-Konischglas. Geben Sie fünf Milliliter Säulenpuffer hinzu und durchlaufen Sie den Puffer schnell durch die Säule, um die gebundenen Zellen zu lösen und aus der Säule freizusetzen.Um die Zellen auszuplatzieren, verdünnen Sie diese mit OPC-Proliferationsmedium auf 60.000 Zellen pro Milliliter. Pipettieren Sie 500 Mikroliter der Zellsuspension entlang der Seite jedes schwarzen, klaren Bodens jedes Wells einer 24-Well-Platte. Mischen Sie die Zellen, indem Sie die Platte horizontal schütteln, wobei Sie eine Acht-Bewegung verwenden.Legen Sie bei diesem Verfahren eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze über eine Glas-Pasteur-Pipette, um sicherzustellen, dass die Vertiefung während der Aspiration nicht beschädigt wird. Danach saugen Sie das Medium aus den Kulturvertiefungen, eine Behandlungsgruppe nach der anderen, um ein Austrocknen der Zellen zu vermeiden. Fügen Sie anschließend langsam 500 Mikroliter der Behandlungsmastermix entlang der Seite der Vertiefung mit einer Ein-Milliliter-Pipette hinzu.Inkubieren Sie die Kulturen und führen Sie alle zwei bis drei Tage einen kompletten Mediumwechsel mit frischem Behandlungsmedium durch. Am Ende des gewünschten Behandlungszeitraums saugen Sie das Medium ab. Geben Sie langsam 400 Mikroliter PFA an die Seite der Vertiefung, um die Zellen zu fixieren.Und inkubieren Sie die Platte 20 Minuten bei Raumtemperatur. Nach 20 Minuten saugen Sie die PFA ab und geben langsam 500 Mikroliter sterile D-PBS zu, um die Zellen zu waschen. Wiederholen Sie den Waschschritt noch zweimal und saugen Sie den letzten Waschschritt nicht ab.Bringen Sie nun die Platte auf Raumtemperatur, aspirieren Sie die Wells und geben Sie 250 µL D-PBS mit fünf Prozent NGS und 0,1 Prozent Triton X-100 hinzu. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur mit sanftem orbitalem Schütteln. Bereiten Sie die primäre Inkubationslösung vor, indem Sie den mausmonoklonalen anti-MBP-Antikörper und den kaninchpolyklonalen anti-Olig2-Antikörper in D-PBS mit fünf Prozent NGS verdünnen.Anschließend inkubieren Sie die primären Antikörper bei vier Grad Celsius über Nacht für 16 bis 18 Stunden mit sanftem Rotationsschütteln. Während des Waschens der Platte bereiten Sie die Sekundärinkubationslösung vor, indem Sie die Antimaus-680- und die Antikaninchen-800-Antikörper in D-PBS mit fünf Prozent NGS verdünnen. Danach aspirations Sie die letzte Waschlösung ab und geben 250 Mikroliter der Sekundärinkubationslösung hinzu.Schützen Sie die Platte vor Licht und inkubieren Sie sie eine Stunde bei Raumtemperatur mit sanftem Rotationsschütteln. Danach scannen Sie die Platte mit einem bildgebenden System, das in der Lage ist, Fluoreszenzemissionen bei 700 Nanometer und 800 Nanometer zu detektieren. Als Ausgangspunkt stellen Sie den Fokusabstand auf drei und die Empfindlichkeiten auf eins Komma fünf für MBP, fünf Komma null für Aktin und drei Komma fünf für Olig2 ein.Passen Sie die Empfindlichkeitswerte nach Bedarf an, um eine Signalüberbelichtung zu vermeiden. In diesem Schema beginnt der DIFS-Assay mit frisch isolierten A2B5-positiven Ratten-OPCs, die auf mit PLL beschichteten Kulturgefäßen ausgesät werden. Diese Kulturen werden drei Tage lang in Gegenwart von 20 Nanogramm pro Milliliter PDGFAA vermehrt und anschließend am Tag null mit experimentellen Faktoren in frischem, PDGF-freiem Medium behandelt.Das Behandlungsmedium wird am zweiten Tag vollständig erneuert. Am vierten Tag werden die Zellen mit 4 Prozent Paraformaldehyd fixiert. Hier wurde an repräsentativen Kulturen am nullten und vierten Tag eine Immunzytochemie für Olig2 und MBP unter Verwendung von Dapi als Kerngegenfärbung durchgeführt.Diese Kulturen zeigen an Tag null und Tag vier eine konstitutive Färbung für den allgemeinen Marker für Zellen der Oligodendrozyten-Linie, Olig2. Dagegen war die Färbung für den Marker des reifen Oligodendrozyten MBP erst am vierten Tag deutlich sichtbar. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man A2B5-positive OPCs der Ratte reinigt, kultiviert und differenziert, um den Einfluss experimenteller Faktoren auf die Oligodendrozytogenese zu quantifizieren.Die Identifizierung von Faktoren, die die Oligodendrogenese fördern, ist von besonderer Bedeutung für die Erforschung demyelinisierender Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose. Sobald die hier beschriebenen Techniken beherrscht werden, können sie helfen, solche Faktoren zu identifizieren und letztendlich bessere Therapeutika zu entwickeln.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Ableitung von angereicherten Populationen von murinen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) in primären Kultur, die, um zu reifen Oligodendrozyten (OLS) produzieren differenzieren. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht Techniken zur Herstellung murine myelinisierenden Co-Kulturen durch Impfen Maus OPCs auf einen Neuriten Bett Maus Spinalganglien Neuronen (DRGNs).

Ableitung von Enriched Oligodendrozyten Kulturen und Oligodendrozyten / Neuron myelinisierenden Co-Kulturen von Post-Natal Mausgeweben

Primary, vermehren humanen fötalen brain-derived, multipotente...

Progenitor-abgeleiteten Oligodendrozyten Culture System von Human Fetal Gehirn

Dieses Video zeigt das Verfahren, retinale Ganglienneuronen (RGNs) aus der Netzhaut einer Ratte zu isolieren und sie mit olfaktorischen Encascaping-Gliazellen (OEG) zu kokulturieren. Diese Methode ermöglicht es, das neuroregenerative Potenzial von OEGs nach neuronalen Verletzungen zu untersuchen.

Kokulturierung von retinalen Ganglienneuronen mit olfaktorischen Encaping-Gliazellen

Das Video demonstriert ein Protokoll zur Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) in Oligodendrozyten und zur Induktion der Myelinisierung in einer Co-Kultur mit Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG). Die OPCs werden mit lentiviralen Vektoren transduziert, die für ein Signalprotein kodieren, das die Myelinisierung reguliert. Die transduzierten OPCs werden mit DRG-Neuronen co-kultiviert, um die Differenzierung in Oligodendrozyten und die Signalprotein-induzierte...

Ein in vitro Transduktions-induzierter Myelinisierungsassay für Oligodendrozyten-Vorläuferzellen

Quelle: Schott, J. T., et al. Herstellung von Oligodendrozyten-Vorläuferkulturen der Ratte und Quantifizierung der Oligodendrogenese mittels Dual-Infrarot-Fluoreszenz-Scanning. J. Vis. Exp. (2016).  Dieses Video zeigt die Verwendung von Dual-Fluoreszenz-Bildgebung zur Bewertung der Differenzierung von Oligodendrozyten aus Vorläuferzellen (OPCs), die aus dem Gehirn eines Rattenwelpen isoliert wurden. Der Prozess umfasst die Fixierung der Zellen, die Markierung spezifischer Marker mit primären...

Duale Fluoreszenzbildgebung zur Identifizierung differenzierter Oligodendrozyten

Quelle: Portela-Lomba, M., et. al. Kokultur von axotomisierten retinalen Ganglienneuronen der Ratte mit olfaktorischer Enclosing-Glia, als In-vitro-Modell der axonalen Regeneration bei Erwachsenen. J. Vis. exp. (2020). Dieses Video zeigt die Bildgebung und Quantifizierung der axonalen Regeneration in axotomisierten retinalen Ganglienneuronen (RGNs) der Ratte, die mit immortalisierten menschlichen olfaktorischen Gliazellen kokultiviert wurden. RGNs sind immunmarkiert, mit roten Somas und grünen...

Bildgebung und Quantifizierung der axonalen Regeneration in axotomisierten retinalen Ganglienneuronen von Ratten

Wir beschreiben die Immunomagnetic Isolierung der primäre Maustaste Oligodendrozyten, ermöglicht die schnelle und spezielle Isolierung der Zellen für in-vitro- Kultur.

Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das nahezu infrarote Farbstoffe in Verbindung mit Immunhistochemie und hochauflösendem Scannen verwendet, um Proteine in Hirnregionen zu untersuchen.

Einsatz von Infrarot-Fluoreszenz und hochauflösendem Scannen zur Messung des Protein-Expression im Rodentrains

Hierin zeigen wir eine effiziente Methode zur Reinigung von Oligodendrozyten und zur Herstellung von Oligodendrozyten-konditionierten Medien, die für Kokulturexperimente verwendet werden können.

Generation von Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Konditionierten Mediums für Co-Kultur-Experimente

Wir präsentieren ein In-vitro-Modell zur Beurteilung der olfaktorischen Ensheathing Glia (OEG) neuroregenerativen Kapazität, nach neuronalen Verletzungen. Es basiert auf einer Kokultur von axotomisierten adulten retinalen Ganglion neuronen (RGN) auf OEG-Monolayer und anschließende Studie der axonalen Regeneration, durch die Analyse von RGN axonalen und somatodendritischen Markern.

Cokultur von Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons mit olfactory Ensheathing Glia, als In-Vitro-Modell der erwachsenen axonalen Regeneration

Eine Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus dem Gehirn lebender Ratten wird hier experimentell detailliert vorgestellt. Es ermöglicht die mehrfache Entnahme dieser Zellen von denselben Tieren, ohne ihr Wohlbefinden zu beeinträchtigen.

Die "Brain Milking"-Methode zur Isolierung von neuralen Stammzellen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus lebenden Ratten

Lernen Sie die Isolierung und Kultivierung von Ratten-Oligodendrozyten-Vorläuferzellen sowie die Quantifizierung der Oligodendrogenese. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Untersuchungen zur Myelinisierung.

Herstellung von Ratten Oligodendrozyten Vorläuferkulturen und Quantifizierung von Oligodendrogenesis Mit Doppel-Infrarot-Fluoreszenz-Scanning (Video) | JoVE Journal

Herstellung von Ratten Oligodendrozyten Vorläuferkulturen und Quantifizierung von Oligodendrogenesis Mit Doppel-Infrarot-Fluoreszenz-Scanning

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