Name: 在小鼠气管插管快速的改进方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学习小鼠气管插管快速给药技术，用于肺损伤与纤维化研究。该方法操作简便、无需专用设备、恢复期短，可有效减少周围组织损伤，适用于急性肺损伤等肺部疾病机制探索。

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作者感谢华盛顿大学组织学与影像核心实验室的 Brian Johnson 在三色染色及分析方面提供的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）基金 HL098067 和 HL089455 资助。

华盛顿大学和西达斯-西奈医学中心的机构动物护理和使用委员会（IACUC）已批准开展这些研究所需的动物实验工作。
1. 准备
<ol>
	<li>使用高压灭菌器对钝头镊子和压舌板进行灭菌。</li>
	<li>在生物安全柜中，将博来霉素（BLM）冻干粉用磷酸盐缓冲液（PBS）配制成工作浓度溶液。&#160; 将溶液在35 kHz条件下超声处理10分钟，以确保充分混匀。 
	注意：建议总体积控制在30至45 µl之间，以避免低体积移液误差，同时防止体积过大导致窒息。</li>
	<li>准备一个清洁的工作区域，其中操作区域面积约为1 m2，并设置术前和术后动物笼具的指定放置位置。</li>
	<li>将操作板底座固定在研究人员正前方的实验台上，方法是用2至3条实验室胶带横跨板底和台面进行固定。有关制作操作板的详细规格，请参见图1。</li>
	<li>在操作板的两个定位螺钉之间系上一段4.0号缝合线。</li>
	<li>通过移除并丢弃三个1 ml注射器的活塞，并在每个注射器筒顶部加入60 µl PBS以形成气密密封，从而制作一个临时的呼吸测量装置。将导管接头松松地固定在一个注射器上，并将其放置在操作板的一侧。</li>
	<li>用一个1 ml注射器吸取300 µl空气，并将其放置在操作板的一侧。</li>
	<li>另剪一段长约6英寸的胶带，放置在操作板一侧备用，将在步骤2.4中用于固定动物。</li>
	<li>设置异氟烷麻醉舱。将氧气（O2）、异氟烷和负压分别连接至暴露舱和排空负压装置的相应接口。或者，可在兼容异氟烷的生物安全柜中给予麻醉。</li>
</ol>
2. 插管
<ol>
	<li>将小鼠放入异氟烷麻醉舱中进行麻醉，直至其失去意识且呼吸频率减慢至适当水平。通常的麻醉条件为4%异氟烷和2% O2，持续3至4分钟，理想麻醉效果可持续2至2.5分钟。此时呼吸频率约为每2秒1次呼吸。</li>
	<li>在等待麻醉起效期间，用移液器吸取30至45 µl博来霉素（BLM），并放置一旁备用。</li>
	<li>准备就绪后，将麻醉后的小鼠以上门齿悬挂于操作平台定位螺钉所连接的线绳上。确保动物背部紧贴平台表面，保持平直。</li>
	<li>注意避免限制通气，在膈肌上方的胸腔下部（尾侧）轻轻贴上一条胶带。胶带应足够紧以维持操作过程中的正确位置，但不可过紧而限制呼吸。</li>
	<li>打开照明灯，将亮度调至80%至100%，并调整鹅颈管位置，使其距离皮肤表面1至2 cm，靠近太阳神经丛区域。定期检查鹅颈管尖端温度，确保不会烫伤小鼠。</li>
	<li>站在操作平台后方，使用无菌钝头镊子找到舌头。小心避开下门齿，轻柔夹住并拉出口腔外。</li>
	<li>用另一只手插入压舌板，将舌头压平于口腔底部。松开镊子，但保持压舌板在原位，以便进行接下来的两个步骤。</li>
	<li>调整光源位置，通过从太阳神经丛水平向近端移动鹅颈管，直至到达主支气管水平，使气管清晰可见。 
	注意：气管可通过呼吸运动加以识别，呼吸会导致透射光强度发生波动。当光源位置正确时，该结构在轴向平面上表现为口腔内中央一条明亮的光点，且口腔本身环境光最少。</li>
	<li>调整注射器角度，使其沿气管自然走向行进，将连接有液滴的22号导管尖端垂直插入气管腔内。若插入成功，PBS气泡将随每次呼吸上下移动。 
	注意：由于深度镇静，此现象可能延迟数秒出现。</li>
	<li>再将导管向前推进5 mm。移除压舌板。</li>
	<li>将注射器换至另一只手，握住导管接头，轻柔地取下注射器。</li>
	<li>将30至45 µl博来霉素（BLM）滴加至导管接头内部中央，连接第二个注射器并向接头内注入300 µl空气。</li>
	<li>将第二个注射器更换为最初含有PBS气泡的第一个注射器。若操作成功，气泡将继续随呼吸上下移动。</li>
</ol>
3. 术后护理
<ol>
	<li>移除导管和胶带，将动物置于干燥温暖的地方，直至其恢复意识——通常在几分钟内即可恢复。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

当由于试剂供应有限、安全性或成本原因导致气溶胶化给药不切实际时，直接气管给药是将外源性物质递送至肺部的更优方法。16 经气管灌注已被广泛用于实现这一目的；然而，与所有外科干预操作一样，该方法本身也可能引发并发症，而这些并发症并非一定由所灌注的物质引起。13 正因如此，通过插管将物质直接注入气管的方法近年来日益普遍。16,17,18,19,20 然而，这些方法同样存在局限性，包括因使用氯胺酮/赛拉嗪等强效镇静剂而导致的恢复时间延长、导管位置不确定（即，可能误入食管而非气管）、对口腔内组织造成不必要的操作，以及需要购置耳镜/喉镜等专用器械所带来的成本问题。
一旦建立，本文所述方法相较于其他插管方案具有多项显著优势。首先，使用异氟烷可减少每只小鼠操作所需的总时间。这主要归因于异氟烷麻醉后动物恢复意识所需时间明显缩短，相较于氯胺酮等管制药物（约5分钟，而后者有时超过3小时）具有显著优势14。此外，自制的呼吸测量装置可通过观察PBS液滴的振荡情况，使研究...

尽管存在一些解剖学和生理学上的差异1，小鼠模型在模拟人类生物学和疾病发生机制方面仍然具有不可估量的价值2。从饲养角度来看，小鼠易于操作，繁殖周期短，寿命较短，且饲养成本相对较低。随着多种遗传品系和策略（例如，条件性基因敲除、报告基因小鼠、谱系示踪方法等）的发展，以及大量可用试剂（例如，抗体、重组蛋白、抑制剂等）的出现，小鼠已成为揭示人类稳态及疾病过程不可或缺的模式脊椎动物3。
小鼠在研究肺部疾病（包括急性肺损伤（ALI）和肺纤维化）方面具有特别重要的价值。4 人类的ALI可由创伤、损伤或败血症引起，其特征是上皮和内皮渗漏（即水肿）、炎症以及早期纤维化。在许多患者中，ALI会发展为其严重形式——急性呼吸窘迫综合征（ARDS），常因呼吸衰竭导致纤维化和死亡。5,6 肺纤维化是一种进行性致死性疾病，其特征是细胞外基质过度沉积，尤其是I型胶原，从而导致肺功能受损。7,8 博来霉素（BLM）给药是目前在实验动物中诱导ALI和纤维化应用最广泛且研究最充分的模型。9 尽管啮齿类动物中BLM诱导的肺纤维化并不能完全模拟人类纤维化表型，10 但利用该模型开展的小鼠研究已帮助发现了许多影响疾病发生与进展的重要因素。11
尽管博来霉素（BLM）诱导纤维化的确切机制尚不明确，但初始损伤被认为源于BLM与传导气道和肺泡内衬上皮细胞（尤其是I型肺泡细胞）直接接触所导致的DNA链断裂12。BLM必须与肺上皮细胞直接接触这一特性，突显了建立可靠递送途径的重要性；这一问题对于多种靶向远端气道的治疗手段同样关键，包括重组蛋白、抗体、siRNA、病毒、细菌、颗粒物等。为实现这一目的，经口咽部吸入（OPA）已被广泛使用13，但OPA的主要缺陷在于部分给药物质可能被吞咽进入胃肠道，从而导致实际给药剂量不准确。另一种常用方法是经气管灌注，该方法需在深度麻醉下进行气管切开术以暴露气管，随后将药物直接注入呼吸道14。然而，这种方法不仅因侵入性强而可能不理想，而且操作耗时、需要较多技术训练，并会对呼吸道造成显著损伤15,16。已有若干无需手术干预即可将药物直接送入气管的方案被开发出来16,17,18,19,20，但这些方法仍存在使用强效麻醉剂导致恢复时间延长、依赖昂贵设备（i.e., 耳镜/喉镜、商用操作板、光纤导丝等）、口腔内操作过多以及剂量不确定性等问题。
本文介绍了一种通过插管给药的相对简便方法，该方法可使研究人员快速、经济且可靠地将试剂注入小鼠肺部，同时对周围组织造成残留损伤的风险较低。

<table><tbody><tr><td>注射用博来霉素，每瓶30单位</td><td>APP Pharmaceuticals, LLC</td><td>103720</td><td>为获得最佳效果，应将BLM悬浮于PBS中，分装后以单次使用量的冻干粉形式保存</td></tr><tr><td>钝头镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>压舌板（例如弯曲的Valleylab刀片电极，2.4&quot;）&amp;nbsp;</td><td>Covidien</td><td>E1551G</td><td>使用前，应在刀片尖端1.5 cm&amp;nbsp;处弯成45度角。也可使用任何尺寸相似的金属工具制作合适的压舌板。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Exel Safelet导管 22G × 1&quot;</td><td>Exel International</td><td>26746</td><td></td></tr><tr><td>1 ml滑动式针头一次性结核菌素注射器（每包200支，每箱1600支）</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml移液器及滤芯吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite照明系统。型号181-1：型号180主机配标准双蛇形管照明器</td><td>Dolan Jenner Industries, Inc.</td><td>181-1</td><td>不推荐使用输出较低的LED照明器，因其无法充分照亮气管。</td></tr><tr><td>插管板</td><td></td><td></td><td>参见图1。</td></tr><tr><td>彩色标签胶带：0.5&amp;nbsp;英寸宽</td><td>Fisherbrand</td><td>15-901-15A</td><td></td></tr><tr><td>氧气&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，1×</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>产品应为无菌</td></tr><tr><td>非无菌黑色编织丝线缝合线卷，91.4 m，4-0规格</td><td>Harvard Apparatus</td><td>517698</td><td></td></tr><tr><td>台式异氟烷麻醉机</td><td>Highland Medical Equipment</td><td></td><td>http://www.highlandmedical.net/</td></tr><tr><td>滑盖式小鼠异氟烷诱导麻醉舱</td><td>MIP / Anesthesia Technologies</td><td>AS-01-0530-SM</td><td></td></tr><tr><td>FORANE（异氟烷，USP）吸入用液体 100 mL&amp;nbsp;</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Nanozoomer数字病理系统</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IgM ELISA定量检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E90-101</td><td></td></tr></tbody></table>

一种改进的小鼠气管快速插管方法

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

尽管存在一些解剖学和生理学上的差异，小鼠模型仍然是研究人类肺部疾病的重要工具。博来霉素毒性是一种常用于研究急性肺损伤和肺纤维化的模型，目前已开发出多种将博来霉素（及其他毒性物质）递送至肺部的方法。然而，这些方法中的许多（例如经气管灌注）存在固有缺陷，包括需要使用强效麻醉剂以及进行可存活的外科手术。本文报道了一种快速、可重复的经气管插管方法，该方法采用轻度吸入麻醉，直接观察气管，并利用替代式呼吸计量装置确认给药暴露。作为概念验证，对8至12周龄的C57BL/6小鼠给予2.0 U/kg的博来霉素或等体积的PBS，并在暴露后检测了肺组织损伤和纤维化相关指标。该操作方法使研究人员能够在相对较短的时间内以较低成本处理大量小鼠，且术后护理需求极少。

经插管的小鼠每日监测体重减轻和痛苦情况，并于4天、10天或17天后通过腹腔注射2.5% 2,2,2-三溴乙醇. 支气管肺泡 支气管肺泡灌洗液（BAL）按先前所述方法，用三份PBS洗涤收集 21，右肺由华盛顿大学组织学与影像学核心实验室用10%甲醛固定，石蜡包埋，并采用Masson三色染色法染色 22.
与已有数据一致，博来霉素（BLM）处理的小鼠在暴露后第7至10天出现体重下降的峰值23 （图2A）。此外，处死的BLM处理小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）中IgM水平升高，表明肺部通透性显著增加，且呈时间依赖性，提示存在上皮和/或内皮屏障功能障碍（图2B）。
采用马松三...

本文介绍了一种通过插管将博来霉素直接注入小鼠气管的快速简便方法。该方法的主要优点在于具有高度可重复性、易于掌握，且无需特殊设备或漫长的恢复时间。

尽管存在一些解剖学和生理学上的差异，小鼠模型仍然是研究人类肺部疾病的重要工具。博来霉素毒性……

本实验的总体目标是通过插管方式，快速、简便且可靠地将试剂递送至小鼠肺部。该方法还可最大限度地降低对周围组织造成残留损伤的风险，且成本低廉。该方法有助于回答基础肺生物学及疾病机制研究领域中的一些关键问题。例如急性肺损伤和纤维化形成。该技术的主要优点是可重复性高、易于掌握、无需特殊设备且恢复时间短。操作必须使用无菌器械进行。因此，将平头镊子和压舌板一起进行高压灭菌。在无菌操作台中，准备用于经气管给药的试剂工作液，推荐给药体积为30至45微升。将溶液在 35 千赫兹条件下超声处理 10 分钟，以确保混合均匀。现在准备实验区域。为实验区域本身预留至少一平方米的空间。动物在手术前后均需置于不同的指定位置。现在，准备一个手术操作板。该定制模型由铝板切割而成，并用T型支架加固。类似的商用操作板也可获得。使用几条胶带将操作板的底座固定在实验台上，使其位于实验者正前方。然后将一段4.0号缝合线系在操作板的两个定位螺钉之间。接下来，构建一个肺量计。从三个1毫升注射器中取出活塞。然后将最多60微升的PBS加入每个注射器筒的顶部。将这三个注射器中的一个松散地固定在导管的接头处。使用时，从气管逸出的气流会导致注射器筒内的PBS液面上升和下降。将此装置放置在操作台旁。将另外两个备用注射器放在触手可及的位置。接着，用第四个注射器吸取300微升空气，并将其放置在板的一侧。同时准备几段六英寸长的胶带，用于将动物固定在板上。如有需要，设置异氟烷麻醉舱。将氧气、异氟烷和真空管路连接到麻醉舱和排空真空装置的相应接口。开始对小鼠进行麻醉。重要的是，由于动物的年龄、体重和健康状况等因素均可能影响其对麻醉剂的反应，因此每个实验室都应优化异氟烷的暴露条件以满足自身需求。等待期间，将试剂的推注剂量吸入移液枪头中，并放置一旁备用。当小鼠进入镇静状态后，将其上切牙悬挂于手术平台的线绳上，使动物的背部紧贴平台表面并保持平整。现在，注意不要妨碍通气，用胶带松松地将胸腔下部（位于膈肌上方）固定在平台上，以确保动物在操作过程中保持对齐。接下来，将鹅颈式照明灯调节至80%到100%的亮度，将光源置于靠近太阳神经丛的皮肤表面1至2厘米处，并定期检查是否导致皮肤过热。从平台后方使用钝头镊子找到舌头。然后小心避开下门齿，轻柔地夹住并拉出口腔内的舌头。在固定舌头的同时，用非优势手使用压舌板将其压平，使镊子可以松开。现在，将鹅颈管光源从剑突部位引导至主支气管，以照亮气管。气管还可通过呼吸运动轻松辨识，呼吸会导致光线在离开气管时强度发生波动。当位置正确时，气管呈现为中央一束集中的光线，口腔内周围光线极少。在未获得理想的气管视野之前，导管不应进入口腔。气管无法通过调节光源或压舌板的位置而显露。研究人员应松开舌头，重新尝试该操作。随后，调整注射器角度，使其沿气管的自然走向推进。将连接有PBS注射器的22号导管尖端直接插入管腔。随后，再将导管向前推进5毫米，并移除压舌板。若导管位置正确，注射器筒内的PBS液泡将随着每次呼吸上下移动。寻找该指标时需保持耐心，因为深度和轻度镇静均可能改变呼吸频率。然后将注射器换至非优势手，在握紧导管接头的同时，轻柔地取下注射器，保留导管在原位。从惯用手将已准备好的试剂团块直接注入导管接头的中心。然后连接第二支含有300 µL空气的注射器，并将空气注入接头内。这有助于确保试剂团块在肺部充分分布。现在，取下注射器，换上一支含有 PBS 气泡的注射器。如果操作成功，气泡会持续上升和下降。随后，移除导管和胶带。将动物置于干燥温暖处，直至其恢复意识，通常在几分钟内即可。对插管小鼠每日监测体重减轻情况。小鼠在经气管插管注入博来霉素后第4、10和17天被处死取材。采集这些小鼠肺组织的支气管肺泡灌洗液并进行分析。结果显示IgM水平升高，表明肺通透性显著随时间增加，提示存在上皮和/或内皮屏障功能障碍。右肺经固定后用马松三色染色法染色，并对纤维化反应（一种公认的总胶原含量标志物）进行定量分析。组织学切片显示，肺间质的增厚程度与纤维化病灶的增加均依赖于治疗情况。一旦掌握，若操作得当，该技术可在一分钟内完成。在进行此操作时，必须牢记：无需也不建议对气管周围软组织进行任何牵拉或处理，因为这可能既影响动物的健康，又破坏实验的完整性。

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