Name: Isolierung von CD146 + Resident Lung mesenchymalen Stromazellen aus Rattenlungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von CD146+ residenten mesenchymalen Stromazellen aus Rattenlungen mittels enzymatischer Verdauung, Dichtegradiententrennung und Magnetbead-Sortierung. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht Studien zur Immunmodulation und Geweberegeneration.

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JJPC wird durch ein Postdoktorandenstipendium der Canadian Institutes of Health Research (CIHR) unterstützt. MAM erhält ein Leistungsstipendium der Studienstiftung des Deutschen Volkes und wird durch ein Stipendium der EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant) unterstützt. BT wird unterstützt von CIHR, der Canadian Lung Association, dem Stem Cell Network und dem Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute.

Alle Verfahren wurden von der Animal Care Committee der University of Ottawa (Tierethik Protokoll Ohri-1696) zugelassen. Tierbetreuung wurde gemäß den Richtlinien des Instituts durchgeführt. 1. Isolierung von Lung mesenchymalen Stromazellen <ol><li> Bereiten Sie die Enzymmischung in einer 50 ml Tube: wiegen 30 U neutrale Protease, 2.500 U Kollagenase I und 500 U DNAse I. ausreichen Diese Beträge für die Lunge eines erwachsenen Maus oder Ratte Welpen. Bereiten Sie am Tag der Isolierung und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Opfer Rattenjungen am Tag 13 durch eine intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium (0,2 ml, 65 mg / ml). Verwenden Sie die Zehe Prise Reflex Bewusstlosigkeit zu etablieren. Tod des Tieres wird durch Öffnen des Brustgewährleistet, wie weiter unten beschrieben. </li><li> Desinfizieren Sie die Haut durch das Tier mit 70% Ethanol Spritzen und vorsichtig öffnen den Brustkorb chirurgische Schere, bei der Membran ausgehend und in Richtung der rostralen Seitenschneider, sehr aufpassen, nichtdie Lunge zu beschädigen. Verbreiten Sie den Brustkorb geöffnet blutstillende Schellen, oder alternativ den Brustkorb aufgeschnitten Zugriff auf den Brustkorb zu schaffen. </li><li> Exsanguinate das Tier durch das Herz zu entfernen. Um das Herz zu entfernen, fassen Sie die Thymusdrüse und Herzen mit kleinen Pinzette und schneiden Sie diese mit chirurgische Schere entfernt. Unmittelbar danach nehmen das Blut mit einer Gaze, bis kein Blut mehr aus der abgetrennten Aorta und Lungenarterie kommt. </li><li> Entfernen Sie die Lungen aus dem Thorax wie folgt: Halten Sie die Luftröhre mit kleinen Zange, dann trennen die Luftröhre mit chirurgischer Schere auf dem rostralen Seite. Während sanft die Lunge Paket aus dem Brustkorb ziehen, geschnitten entlang der Brustkorb in die Lunge frei, jede Bindegewebe auf der Rückenseite entfernt. </li><li> Sever die Lungen von der Aorta und der Speiseröhre, mit chirurgische Scheren entlang der Membran zu schneiden. Nun, da die Lungen aus dem Thorax völlig frei nehmen Sie verbleibendes Blut vorsichtig mit einem Gaze. </li><li> Entfernen Sie die Luftröhre und Bronchien mit surgische Schere und sorgfältig die Lungenlappen zu einer 50-ml-Röhrchen übertragen haltige Kalt 35 ml 30% Citrat-Phosphat-Dextrose-Adenin (CPDA-1) Antikoagulans (26,30 g Trinatriumcitratdihydrat, 3,27 g Ascorbinsäure Monohydrat, 2,22 g Natriumhydrogenphosphat, 31,80 g D-Glucose, 0,275 g Adenin in 1 L gereinigtem H 2 O; Sterilfilter die Lösung ein 0,22 um Membranfilter vor der Verwendung) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Blut und Trümmer zu entfernen verwenden. </li><li> Nach 5 min Spülen in 30% CPDA-1 / PBS, übertragen die Lunge auf eine neue 50-ml-Röhrchen 35 ml sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (RT) enthält, vorsichtig umdrehen Citrat zu entfernen. Transfer in ein Rohr 35 ml Dulbeccos PBS + Natrium-Pyruvat + Glucose (DPBS ++) (RT) enthält. Jeder Waschschritt sollte ungefähr 5 Minuten dauern. Hinweis: DPBS ++ Handel bestellt werden kann oder sich wie folgt zusammen 21: Calciumchloriddihydrat 132,4 mg, Magnesiumchlorid-Hexahydrat 100 mg, Kaliumchlorid (wasserfrei) 200 mg, monobasisches Kaliumphosphat (wasserfrei) 200 mg, Natriumchlorid (wasserfrei) 8,000 mg, dibasisches Natriumphosphat (wasserfrei) betragen mit 1.144,5 mg, D-Glucose 1000 mg, Natriumpyruvat 36 mg in 1 L gereinigtem H 2 O, pH 7,3. Sterilfilter die Lösung einen 0,22 um Membranfilter vor dem Gebrauch verwenden. </li><li> Man löst das Enzymgemisch durch Zugabe von 10 ml DPBS ++ (vorgewärmt auf 37 ° C) und dem invertierenden sanft bis gelöst. </li><li> Übertragen Sie die Lunge zu einem neuen 50-ml-Tube und hacken die Lunge an der Wand der Röhre mit einem Skalpell, bis fein gehackt. In der Enzymmischung auf das Gewebe (10 ml Enzymmischung / pro Erwachsener Maus / Rattenjungen Lunge), schließen Sie das Rohr fest und Inkubation bei 38 ° C unter leichtem Schütteln (entweder in einem Thermomischer, einem Schüttelwasserbad, oder ein Wasser Bad mit regelmäßiger manueller Bewegung). Die Dauer hängt von der Art des Gewebes: fetalen Gewebes 60 min, juvenile / erwachsenem Gewebe 90-120 min, fibrotische erwachsenem Gewebe 120-150 min. </li><li> Stoppen Sie die Verdauung von Chela die zweiwertigen Kationen with 200 &amp; mgr; l Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 0,15 M, pH 7,4. Sterilfilter die Lösung ein 0,22 um Membranfilter vor der Verwendung verwendet wird). </li><li> 20 ml 5% fötalem Rinderserum (FBS) / PBS und die gesamte Suspension durch 100 &amp; mgr; m Zelle Sieb in eine neue 50-ml-Röhrchen übergeben. Spülen Sie das Rohr und Zellsieb mit 10 ml 5% FBS / PBS, um das Gesamtvolumen auf 40 ml zu bringen. </li><li> Zentrifugieren Sie für 5 min bei 500 · g, RT. </li><li> Entfernen Sie den Überstand (Pellet sollte gut sichtbar sein), Resuspension in 40 ml 5% FBS / PBS und wiederholen Zentrifugation Schritt 1.13. </li><li> Resuspendieren in 4 ml 5% FBS / PBS (RT) und 14 vorsichtig auf 3 ml Dichtegradientenmedien (1,073 g / cm 3) in einem 15 ml Rohrschicht. Um eine gute Interphase erhalten, ist es entscheidend, dass die Schichtung der Einzelzellsuspension bei einer auftritt&gt; 45 ° Winkel mit sehr geringer Geschwindigkeit. </li><li> Zentrifuge 20 min bei 900 · g, Medium (5/10) Beschleunigung, keine Verzögerung, 19 ° C. </li><li> Sammeln Sie die Zellen, die in der interphase und resuspendieren sie in 10 ml sterilem PBS. </li><li> Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 × g, 21 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 10 ml vorgewärmten abgeschlossen L-MSC-Kulturmedium (Minimum Essential Medium Eagle alpha-Modifikation (&amp; agr; MEM), ergänzt mit 2 mmol L-Glutamin pro 500 ml &amp; agr; MEM, 20% vol / vol FBS und 1% vol / vol Penicillin / Streptomycin / Amphotericin B. </li><li> Wiederholen Zentrifugationsschritt 1,18. Anschließend entfernen Überstand und resuspendieren in 10 ml vorgewärmten frisches Kulturmedium. </li><li> Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer oder automatische Zellzähler und Platte mit einer hohen Dichte, da die Mehrzahl der Zellen in diesem Stadium sind nicht aus Kunststoff anhaftenden. Die genaue Beschichtungsdichte hängt von der Tierart und Alter, zB werden die Zellen eines erwachsenen Mauslunge bei 10 5 Zellen / cm 2, wohingegen Zellen, die aus einer Lungenrattenjungen ausreichend dicht sind bei einer Aussaatdichte von 1-2 x 10 4 Zellen / cm 2 </sup&gt;. Verwenden Sie 0,2 ml L-MSC Kulturmedium / cm 2. </li><li> Kultur L-MSCs in einer befeuchteten 5% O 2, 5% CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C. </li><li> Ändern Medium 24 Stunden nach der ersten Aussaat und danach alle 3 Tage, nachdem er einmal mit PBS spülen. Zellen werden, bis 80-90% Konfluenz kultiviert werden, die in Abhängigkeit von dem Tier Ursprungs 3-5 Tage im Durchschnitt dauert. Höhere Zusammenfluss wird die Differenzierung in Fibroblasten fördern. </li></ol> 2. Auswahl der CD146 + Lung mesenchymalen Stromazellen <ol><li> Beschichtung von Magnetic Beads mit sekundärem Antikörper <ol><li> Beschichten der magnetischen Kügelchen mit biotinyliertem sekundärem Antikörper, bei einem Verhältnis von 10 ug sekundären Antikörper / 100 ul magnetischen Perlen in einem Rundboden sterile 2 ml Kryoröhrchen in sterilen Bedingungen. Verwenden Sie 10 ul sekundären Antikörper pro erwartet 0,5 x 10 6 Zellen, und mit einem Minimum von 100 ul magnetische Perlen und 10 ug Antikörper. Hinweis: das Verhältnis einestibodies pro Volumen der Kugeln verwendet wird, kann von Hersteller zu Hersteller unterscheiden, sollten Sie die Anweisungen des Herstellers für die Perlen der Wahl beraten. Aus diesem Protokoll finden Sie in Tabelle 1 für die Perlen und Antikörper, die bei der Optimierung von diesem Protokoll verwendet wurden. </li><li> Inkubieren in einem rotierenden Probenmischer für 30 Minuten bei 30 Umdrehungen / min (rpm), bei RT. </li><li> Resuspendieren der Kügelchen in 1,5 ml steriler 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) / PBS und Transfer zu einem 3 ml Rundbodenrohr (Durchflusszytometrie Rohr). Spülen Sie die Kryoröhrchen mit einer zusätzlichen 1,5 ml 0,1% BSA / PBS und Transfer zum 3-ml-Tube. </li><li> Das Röhrchen wird auf einem geeigneten Magnet und warten 2 Minuten, bis alle Perlen an der Rückwand der Röhre befestigt sind, und die Lösung bleibt klar. Entfernen Abfluss und wiederholen Waschen mit 3 ml 0,1% BSA / PBS zweimal. </li><li> Resuspendieren der Kügelchen in 3 ml 0,1% BSA / PBS und lagern bei 4 ° C, vor Licht geschützt. Verwenden Sie innerhalb von 5 Tagen. </li></ol></li><li> Kennzeichnung CD146 + L-MSCs<ol><li> Ernten Sie die mesenchymalen Zellen nach Spülen mit PBS eine sanfte nicht-Trypsin-Lösung. Anmerkung: Volumes hängen von der Größe der Kulturflasche (0,2 ml / cm 2 Medium oder PBS). <ol><li> Kulturmedium entfernen und spülen Zellen dreimal mit sterilem PBS. </li><li> Fügen Sie den entsprechenden Volumen von sanften Nicht-Trypsin-Lösung (siehe Tabelle 1). Im Brutschrank bei 37 ° C inkubieren, bis die Zellen abgelöst, etwa 10 min, wenn die Lösung in Tabelle 1 verwendet wird. </li><li> Inaktivierung des Enzyms durch L-MSC Kulturmedium zugibt und Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g. </li></ol></li><li> Überstand entfernen, resuspendieren Zellen in 0,1% BSA / PBS und die Zellen mit einem Hämozytometer oder automatische Zellzähler zählen. Hinweis: Das Volumen der 0,1% BSA / PBS auf die Größe der Kulturflasche abhängt: Ziel für 5 oder 10 ml 0,1% BSA / PBS. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.2.2 und resuspendieren engagierten Menge an Zellen in 3 ml 0,1% BSA / PBS (Blöcke unspezifischen Bindungsstellen und hält die Zellen am Leben). Halten Zellen auf Eis. </li><li> Bereiten Sie eine 3 ml-Rundbodenröhrchen mit dem primären anti-CD146-Antikörper, und halten Sie auf dem Eis. Anmerkung: Die Konzentration an primären Antikörper, der an die spezielle Menge an Zellen hinzugefügt wird, hängt auf dem Antikörper, der verwendet wird. Für einen empfohlenen Anti-Ratten CD146-Antikörper siehe Tabelle 1. </li><li> Hinzufügen des Gesamtvolumens der Zellen aus Schritt 2.2.3 auf das Rohr mit dem primären Antikörper. Dicht schließen und 4 ° C bei 15 rpm, 30 min auf einer rotierenden Probe Mischer inkubiert. </li><li> Zentrifuge Zellen 5 min bei 500 × g, 4 ° C, Überstand und resuspendieren Zellpellet in 3 ml 0,1% BSA / PBS entfernen. Wiederholen Zentrifugenschritt. </li><li> Resuspendieren der Zellen in der Lösung 3 ml sekundärem Antikörper beschichteten Kügelchen enthält, die 2,1 nach den Anweisungen in Abschnitt wurde hergestellt und inkubiert 30 min auf einer rotierenden Probe Mischer bei 15 Upm, 4 ° C. </li></ol></li><li> Auswählen von CD146 + L-MSCs<ol><li> Das Röhrchen wird das markierte CD146 + L-MSCs auf den Magnet enthält. Die positiven Zellen werden an der Rückseite des Rohres gezogen werden. Ohne das Rohr zu bewegen oder um die Perlen zu berühren, ernten den Überstand mit den negativen Zellen langsam mit einer sterilen Pasteurpipette (diese entweder auf der Grundlage der experimentellen Design gesammelt oder verworfen werden kann). </li><li> Entfernen des Rohres aus dem Magneten und Resuspendieren der Zellen in 3 ml 10% BSA / PBS. Wiederholen Sie den Auswahlverfahrens beschrieben in Schritt 2.3.1. vier weitere Male (Σ 5 Stufen des Auswahlverfahrens). </li><li> Resuspendieren CD146 + L-MSCs in vorgewärmte L-MSC Kulturmedium und zurück zum Magneten. </li><li> Überstand entfernen, resuspendieren in L-MSC Kulturmedium und die Platte in einem passenden Kulturflasche (0,2 ml / cm 2). Als Faustregel gilt, aus denen Zellen Platte in derselben Größe Kulturflasche wurden die Zellen vor der Wulst-Auswahl aufgehoben. Die Zahl der CD146 + L-MSCs und damit die Beschichtungs-Dichte, wirdabhängig vom Alter, Art und Stamm des Quell Tier. Immer streben eine Plattierungsdichte von ~ 5.000 Zellen / cm 2. Hinweis: Die Perlen werden nicht das Zellwachstum stören und wird nach und nach verschwinden, wenn die Zellen vermehren. </li></ol></li></ol> 3. Gefrierzellen <ol><li> Verwenden Sie das folgende Gefriermittel: 60% Pentastärke-Lösung (10% Pentastärke in 0,9% NaCl), 20% FBS, 12,5% CPDA-1, 2,5% NaCl (0,9%), 5% Dimethylsulfoxid (DMSO) 22. Hinweis: Wenn nicht alle Zutaten vorhanden sind, ist eine Lösung, die 5% DMSO, 30% FBS und 65% &amp; agr; MEM ist eine gute Alternative. </li><li> Die Zellen in 0,5 x 10 6 Zellen / ml aliquoten in Kryoröhrchen von jeweils 1 ml und O / N bei -80 ° C unter Verwendung eines Gefrierbehälters einfrieren. </li><li> Transfer zu einem Flüssigstickstofflagertank am nächsten Tag. </li></ol> 4. Auftauen Cells <ol><li> Auftauen eine Ampulle von Zellen in einem 37 ° C Wasserbad für 5 min. </li><li> Die Zellen in 10 mlvorgewärmtes Kulturmedium und Zentrifuge für 5 min bei 500 × g, 21 ° C. </li><li> Überstand entfernen und Zellpellet in 10 ml Kulturmedium. Samenzellen in einem belüfteten Kappe Zellkultur behandelt Kolben bei 5.000 Zellen / cm 2 in 0,2 ml / cm2 Medien (zB 15 ml für einen 75 cm 2 Kolben). </li><li> Kulturzellen in 5% O 2, 5% CO 2, bis 80-90% konfluent zum Ernten und / oder experimentelle Verwendung. Über Konfluenz wird die Differenzierung induzieren. Wenn bei 5.000 Zellen Aussaat / cm 2, L-MSCs werden 80-90% Konfluenz innerhalb von 3-4 Tagen Kultur erreichen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Isolierung und Kultur von Primär L-MSCs stellt eine Chance zu einer besseren ihre Funktion und ihre Wechselwirkung mit anderen Zellpopulationen auf zellulärer Ebene zu verstehen und ihre Rolle in der Lungenentwicklung, Gesundheit und Krankheit. Dies ist besonders wichtig, da der Mangel an einem bestimmten einzigen Markierung dieser Zellen macht es nahezu unmöglich, diese Zellen in situ zu untersuchen. Wie bei allen primären Zellpopulationen, sollte man im Hinterkopf behalten, dass diese Zellen eher auf ihre...

Mesenchymalen Stromazellen (MSCs) werden zunehmend für ihr therapeutisches Potential in einem weiten Bereich von Krankheiten erkannt, einschließlich Lungenerkrankungen. Neben der Verwendung von Knochenmark und Nabelschnurblut MSCs für exogene Zelltherapie wird auch ein zunehmendes Interesse an der Reparatur und regenerative Potenzial ansässig Gewebe MSCs. Während der Entwicklung, unter anderem in der Lunge ist das Mesenchym eine wichtige Quelle für Entwicklungsanzeichen und Bewohner MSCs sind ein aussichtsreicher Kandidat in der Mitte davon zu sein. Darüber hinaus wird immer mehr Anzeichen dafür, dass die Bewohner MSCs bei erwachsenen Krankheiten gestört werden, einschließlich Krebs 1,2 und Fibrose 3. Die größte Hürde für das Studium dieser ansässig Gewebe MSCs ist das Fehlen einer klaren Marker für die Isolierung und Identifizierung dieser Zellen 4. Stammzell-Antigen-1 (Sca-1) wurde in Mäusen als Marker für eine Vielzahl von Gewebestammzellen identifiziert und können für die Isolierung von L-MSCs 5 verwendet werden, hat aber leider6 Orthologe in anderen Spezies nicht bekannt. Forscher haben eine Vielzahl von verschiedenen Isolationsverfahren für die Isolierung von L-MSCs entweder von Lungengewebe oder Flüssigkeit berichtet. Diese reichen von Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) basierte Verfahren für CD31 Auswahl - / CD45 - / CD90 + Zellen 7, CD31 - / CD45 - / epithelialen Zelladhäsionsmolekül (EpCAM) - / Sca-1 + Zellen 8, Multidrug-Resistenz-Transporter ATP-Bindungskassette G (ABCG2) positive Zellen 9 oder Hoechst 33342 Farbstoff Auslauf 10, Kunststoffadhärenz 11,12 und Migration von zerkleinerten Gewebes 13. Die Vorteile der hier vorgestellten Verfahren sind mehrfach. Durch die Verwendung von 14 eine sanfte enzymatische Verdauung und Dichtegradienten erhält man alle Zellen des Dichtebereichs, die MSCs gehören, epithelialen oder endothelialen Zellen auszuschließen. Die anschließende Kunststoffadhärenz Schritt stellt sicher, dass nur die mesenchymal Zellen anhaften und in der Kultur bleiben, Leukozyten zu beseitigen. Vor allem aber erlaubt die CD146 + Selektionsschritt zur Beseitigung von Fibroblasten, da diese Zellen nicht CD146 exprimieren. Die Expression des Zelladhäsionsmolekül CD146 positiv mit Multipotenz korreliert, und ist daher eine gute Markierung Fibroblasten aus einer mesenchymalen Zellpopulation 15-19 auszusondern. Dies ist ein Vorteil gegenüber CD90 als Selektionsmarker verwendet, da sie nicht nur in MSCs exprimiert wird, sondern auch in lipofibroblasts 5,20. In diesem Protokoll haben wir ausdrücklich ein magnetisches bead Auswahl gewählt, da es auf die Zellen sanfter ist, und die gesamte Prozedur kann unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Ein weiterer wichtiger Vorteil dieses Isolierungsverfahren wie zum Auswachsen Verfahren gegenüber, ist, dass es relativ schnell ist, als 6-10 Tage bis zu einem Monat oder mehr für den Auswuchs Verfahren gegenüber. Drei bis fünf Tage nach der ersten Isolierung der mesenchymalen Bevölkerung ist bereit für CD146 + Sele<html> ction; Nach weiteren drei bis fünf Tagen die CD146 + Zellen sind bereit für Experimente verwendet werden oder kann für eine spätere Verwendung eingefroren werden. Die verringerte Zeit der Kultur verbessert die Qualität der Zellen als MSCs transdifferentiate Richtung Fibroblasten in Kultur verlängert ex vivo 19. Schließlich wegen der Art des Protokolls ist es möglich, dieses Verfahren auf andere Arten anzuwenden, indem einfach geeignete Antikörper oder sogar auf andere Organsysteme Auswahl durch die Wahl der Verdauungsenzyme und Inkubationszeit eingestellt wird. Ein detailliertes Protokoll dieser Isolierungsmethode ist unten angegeben, und eine schematische Übersicht über die Isolierung und anschließende Auswahl der CD146 + Subpopulation ist in 1A und 1B vorgesehen. Zusätzlich werden Details für die Passage enthalten, Einfrieren und diese Zellen aufgetaut. ad / 53782 / 53782fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung der Isolierung von Lungen mesenchymalen Zellen (A) und die anschließende CD146 + Zellauswahl (B) min = Minuten. EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; 2. Ab = Sekundärantikörpers; a-CD146 Ab = primäre anti-CD146-Antikörper; &amp; ndash; ve Zellen = CD146-negativen Zellen; + ve Zellen = CD146-positiven Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53782/53782fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Neutrale Protease</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS02104</td><td>Bereiten Sie sich am Tag der Isolierung vor und lagern Sie sie bei 4 Grad; C bis zur Verwendung</td></tr><tr><td>Kollagenase I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004196</td><td>Am Tag der Isolierung vorbereiten und bei 4 Grad lagern; C bis zur Verwendung</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>Am Tag der Isolierung vorbereiten und bei 4 Grad lagern; C bis zur Verwendung</td></tr><tr><td>Pentobarbital-Natrium (Euthanyl)</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin,</td> <td>Irland-Verwenden</td> <td>Sie 0,2 ml für Rattenbabys zwischen 20 und 30 g; größere Tiere benötigen möglicherweise mehr.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS + Natriumpyruvat + Glukose</td><td>Life Technologies</td><td>14287-072</td><td>Sehr wichtig für die Verwendung dieser Art von D-PBS, da das in diesem D-PBS enthaltene Calcium und Magnesium die enzymatische Verdauung erleichtern</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM (1,073 g/cm3)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5446-52</td><td>Medien mit Dichtegradienten. Um eine gute Interphase zu erhalten, ist es entscheidend, dass die Schichtung der Einzelzellsuspension bei einem >45°; Winkel bei sehr niedriger Geschwindigkeit und dass die anschließende Zentrifugation bei 19 °C durchgeführt wird.</td></tr><tr><td>&alpha; MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8042</td><td>Warm in 37°; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>100x Antibiotikum-Antimykotisch</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Penicillin/Streptomycin/Fungizone</td></tr><tr><td>M-280 Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>11205D</td><td>Magnetische Beads</td></tr><tr><td>biotinyliertes polyklonales Kaninchen-Anti-Maus-IgG</td><td>Dako, Agilent Technologies</td><td>E0464</td><td>Biotinylierter Sekundärantikörper, der mit dem unten beschriebenen Anti-Ratten-Antikörper CD146 übereinstimmt</td></tr><tr><td>DynaMag5-Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12303D</td><td>Magnet, der für die Verwendung mit Dynabeads empfohlen wird. HINWEIS: Der Magnet sollte auf der Grundlage des Herstellers ausgewählt werden. s Anleitung für die Magnetperlen der Wahl.</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Life Technologies</td><td>12605-028</td><td>Sanfte Alternative ohne Trypsin, verwenden Sie 1 ml TrypLE express/25 cm2 Oberfläche. Nach der Ablösung reichen 10 ml L-MSC-Kulturmedium aus, um 3 ml TrypLE</td></tr><tr><td>Anti-Ratten-CD146-Antikörper</td><td>Lifespan Biosciences Inc.</td> zu inaktivieren.<td>C35841</td><td>12,5 μm l pro 0,5 x 106 Zellen</td></tr><tr><td>Pentaspan (Pentastärkelösung)</td><td>Bristol-Myers Squibb</td> <td>Kanada-Kann</td> <td>über lokale Blutspendedienste oder Hämatologieabteilungen bezogen werden. Alternativ könnte man die PSI 20%ige Pentastärkelösung (Preservation Solutions, PST001) 1:1 verdünnt mit 0,9% NaCl verwenden.</td></tr><tr><td>Mr. Frosty Gefrierbehälter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Verbessert die Lebensfähigkeit beim Einfrieren von L-MSCs über Nacht bei -80 & Grad; C</td></tr></tbody></table>

isolierung von cd146<sup&gt; +</sup&gt; resident lung mesenchymalen stromazellen aus rattenlungen

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymalen Stromazellen (MSCs) werden zunehmend für ihr therapeutisches Potential in einem weiten Bereich von Krankheiten erkannt, einschließlich Lungenerkrankungen. Neben der Verwendung von Knochenmark und Nabelschnurblut MSCs für exogene Zelltherapie wird auch ein zunehmendes Interesse an der Reparatur und regenerative Potenzial ansässig Gewebe MSCs. Darüber hinaus haben sie wahrscheinlich eine Rolle bei der normalen Organentwicklung und haben Rollen in Krankheit zugeschrieben worden, insbesondere solche mit einer fibrotischen Natur. Die größte Hürde für das Studium dieser ansässig Gewebe MSCs ist das Fehlen einer klaren Marker für die Isolierung und Identifizierung dieser Zellen. Die Isolierung hier beschriebene Technik gilt mehrere Merkmale von Lungen ansässig MSCs (L-MSCs). Nach Opfer der Ratten, sind Lunge entfernt und mehrmals gewaschen, um Blut zu entfernen. Folgende mechanische Dissoziation von Skalpell werden die Lungen für 2-3 Stunden mit einer Mischung aus Collagenase Typ I, neutrale Protease und DNase Typ I. Die obtaine verdautd Einzelzellsuspension wird anschließend gewaschen und überlagert über Dichtegradienten-Medium (Dichte 1,073 g / ml). Nach der Zentrifugation werden die Zellen aus der Zwischenphase gewaschen und in Kulturflaschen behandelt plattiert. Die Zellen werden für 4-7 Tage in physiologischer 5% O 2, 5% CO 2 Bedingungen. Zu verarmen Fibroblasten (CD146 -) und eine Bevölkerung von nur L-MSCs (CD146 +), die positive Selektion für CD146 + Zellen gewährleistet ist, durch magnetische Perle Auswahl durchgeführt. Zusammenfassend ergibt dieses Verfahren zuverlässig eine Bevölkerung von Primär L-MSCs für weitere in vitro-Studie und Manipulation. Aufgrund der Natur des Protokolls kann es leicht zu anderen experimentellen Tiermodellen übersetzt werden.

Zwei der zuverlässigsten physikalischen Eigenschaften von MSCs, Dichte und Kunststoffadhärenz werden im ersten Teil dieses Protokolls verwendet, um die mesenchymale Zellfraktion der Lunge zu erhalten, das L-MSCs enthält. Obwohl der Dichtegradient Interphase wird Monozyten und Makrophagen neben Lungen mesenchymalen Zellen, die Kunststoffadhärenz gefolgt von 3-5 Tagen Kultur gewährleistet sind, dass nur die Lunge mesenchymalen Zellen bleiben. Tatsächlich diese Zellpopulation drückt die kla...

Dieses Protokoll beschreibt ein Isolationstechnik für primäre Lungen resident mesenchymalen Stromazellen von Ratten erhalten, durch die Verwendung von enzymatischen Verdauung, Dichtegradiententrennung, Kunststoff Haftung und CD146 + magnetisches Kügelchen Auswahl.

Isolierung von CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung mesenchymalen Stromazellen aus Rattenlungen

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, CD146-positive, im Lungengewebe vorkommende mesenchymale stromale Zellen oder MSCs, die aus der Ratte isoliert wurden, in vitro mittels einer Kombination aus enzymatischer Verdauung, Dichtegradiententrennung, Anheftung an Kunststoffoberflächen und magnetischer Zellsortierung zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Lungenerkrankungen zu beantworten, beispielsweise wie Lungen-MSCs bei Krankheiten infiziert werden und welche Rolle sie bei der Immunmodulation und Gewebereparatur spielen. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen in ihrer Schnelligkeit, Reproduzierbarkeit und einfachen Anwendbarkeit auf verschiedene Spezies von Versuchstieren oder Geweben.Die ersten Schritte des Verfahrens wird Arul Vadivel, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus meinem Labor, demonstrieren. Um die Lunge aus dem Thorax zu entfernen, halten Sie die Luftröhre mit einer kleinen Pinzette fest und trennen Sie die Luftröhre auf der rostralen Seite mit einer chirurgischen Schere ab. Ziehen Sie dann vorsichtig das Lungenpaket aus dem Thorax und durchtrennen Sie dabei das Bindegewebe auf der dorsalen Seite entlang des Rippenbogens.Schneiden Sie entlang des Zwerchfells, um die Lunge von Aorta und Speiseröhre zu trennen, und entfernen Sie vorsichtig mit Mulltüchern das verbliebene Blut aus dem Lungengewebe. Entfernen Sie mit einer Schere die Luftröhre und die Bronchien und legen Sie die Lungenlappen vorsichtig in ein 50-Milliliter-Gefäß, das 35 Milliliter kaltes CPDA-Antikoagulans und PBS enthält, um Blut und Ablagerungen zu entfernen. Überführen Sie die Lunge nach fünf Minuten in ein neues 50-Milliliter-Gefäß, das 35 Milliliter steriles PBS bei Raumtemperatur enthält.Und vorsichtig umdrehen, um das Citrat zu entfernen. Nach fünf Minuten spülen Sie die Lungen in einem neuen 50-Milliliter-Röhrchen, das 35 Milliliter sterilem Dulbecco's PBS bei Raumtemperatur mit Natriumpyruvat und Glukose enthält, und drehen das Röhrchen vorsichtig um. Anschließend überführen Sie die Lungen in ein anderes 50-Milliliter-Röhrchen und zerkleinern das Gewebe mit einem Skalpell fein, indem Sie es gegen die Wand des Röhrchens drücken.Es ist sehr wichtig, das Gewebe in sehr kleine Stücke zu schneiden, um eine maximale Zellausbeute sicherzustellen, und zügig zu arbeiten, um eine hohe Zellviabilität zu gewährleisten. Wenn das gesamte Gewebe zerkleinert ist, frisch zubereitete Enzyme in das Röhrchen geben und den Deckel fest verschließen.Anschließend werden die Gewebestücke für die geeignete Verdauungszeit bei 38 Grad Celsius unter leichtem Schütteln inkubiert. Am Ende der Inkubation wird der Verdau mit 200 Mikrolitern sterilfiltrierter EDTA gestoppt. 20 Milliliter PBS, ergänzt mit FBS, werden der Gewebesuspension zugegeben, und die gesamte Suspension wird durch einen 100-Mikron-Zellsieb in ein neues 50-Milliliter-Gefäß geleitet.Anschließend spülen Sie das Verdauungsrohr und den Zellsieb mit 10 Milliliter FBS/PBS und ziehen die Waschflüssigkeit mit einer filtrierten Probe ab. Nachdem die Zellen zweimal zentrifugiert wurden, resuspendieren Sie das zweite Pellet in vier Millilitern FBS/PBS bei Raumtemperatur. Und schichten Sie die Zellen langsam unter einem Winkel von mehr als 45 Grad über drei Milliliter Dichtegradientenmedium.Indem man in einem Winkel von mehr als 45 Grad zwischen der Zellsuspension und dem Dichtegradientenmedium klopft, verhindert man Scherkräfte, die die Zellen mit dem Gradientenmedium mischen könnten, wodurch die Schichten gebildet werden können. Tritt eine Mischung auf, entsteht kein Dichtegradient. Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation und sammeln Sie die Grenzphase. Waschen Sie anschließend die Lungen-MSCs in 10 Milliliter steriler PBS und resuspendieren Sie das Pellet in vorgewärmtem vollständigem Kulturmedium für Lungen-MSCs zur Aussaat.Um die CD146-positive Zellpopulation zu isolieren, beschichten Sie zuerst magnetische Kügelchen mit 10 Mikrogramm biotinyliertem sekundärem Antikörper pro 100 Mikroliter magnetische Kügelchen in einem sterilen, runden 2-Milliliter-Cryo-Gefäß unter sterilen Bedingungen. Inkubieren Sie die Kügelchen und den Antikörper 30 Minuten bei Raumtemperatur und 30 U/min auf einem rotierenden Probenvorrichtung. Anschließend resuspendieren Sie die mit Antikörper konjugierten Kügelchen in 1,5 Milliliter PBS, ergänzt mit BSA, und überführen die Kügelchen in ein rundbodiges 3-Milliliter-Flusszytometrie-Röhrchen.Spülen Sie die Kryoröhre mit weiteren 1,5 Millilitern BSA/PBS und ziehen Sie die Waschflüssigkeit zusammen mit den Perlen auf. Stellen Sie das Röhrchen für zwei Minuten auf einen geeigneten Magneten, bis sich alle Perlen an der hinteren Wand des Röhrchens anlagern und die Lösung klar wird. Entfernen Sie dann den Überstand und waschen Sie die Perlen noch zweimal mit jeweils drei Millilitern BSA/PBS.Spülen Sie die MSCs dreimal mit unergänztem PBS. Nach dem letzten Waschschritt behandeln Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit einer schonenden, nicht-trypsinhaltigen Lösung. Sobald sich alle Zellen gelöst haben, fügen Sie frisches Kulturmedium für Lungen-MSCs hinzu und zentrifugieren die Zellen.Suspendieren Sie das Pellet in PBS mit BSA und zählen Sie die Zellen. Überführen Sie anschließend die Zellen in ein dreimilliliterfassendes Reagenzglas, das den primären CD146-Antikörper enthält, verschließen Sie das Gefäß und inkubieren Sie die Zellen auf einem rotierenden Probemischer bei 15 U/min und vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit jeweils drei Milliliter PBS mit BSA und resuspendieren das zweite Pellet in drei Millimetern der mit sekundärem Antikörper konjugierten Perlen.Nach 30 Minuten auf dem rotierenden Probengefäßmischer bei vier Grad Celsius das Gefäß auf den Magneten stellen und mit einer sterilen Pasteur-Pipette langsam und vorsichtig die negativen Zellen entfernen. Danach, mit dem Gefäß vom Magneten entfernt, die Zellen in drei Milliliter PBS mit zugesetztem BSA resuspendieren und den Selektionsprozess insgesamt vier weitere Male wiederholen. Nach der letzten Entfernung der negativen Zellen die CD146-positiven Lungens-MSCs in vorgewärmtem Kulturmedium waschen.Resuspendieren Sie die mit Perlen konjugierten Zellen abschließend in frischem Kulturmedium für lungäre mesenchymale Stromazellen und geben Sie 5.000 Zellen pro Quadratzentimeter in ein entsprechend dimensioniertes Kulturgefäß. Die Anheftung an Kunststoff, gefolgt von einer Kultur über drei bis fünf Tage, bereichert die aus den Dichtegradienten-Trennung gewonnene Interphasenpopulation an CD90-, CD73- und CD146-positiven lungären MSCs.Außerdem weisen diese Zellen eine koloniebildende Einheitseffizienz von etwa 30 % auf, was deutlich höher ist als das, was allgemein für Knochenmark oder andere MSC-Teilpopulationen berichtet wird, die sich entlang der drei klassischen MSC-Linien differenzieren. Die positive Selektion der CD146-positiven Teilpopulation führt offensichtlich zu einer Zellpopulation, die stark angereichert an lungenspezifischen MSCs ist, wie durch einen höheren Prozentsatz an Zellen mit MSC-assoziierten Oberflächenmarkern gezeigt wird. Diese Zellen zeigen außerdem ein erheblich höheres Potenzial zur Koloniebildung und eine stärkere Differenzierungsreaktion, insbesondere in der chondrogenen Linie, verglichen mit der gesamten mesenchymalen Zellpopulation vor der CD146-Selektion.Bemerkenswert ist, dass diese lungenspezifischen MSCs nur sehr wenige echte Adipozyten bilden, sondern stattdessen deutlich mehr spindelförmige Zellen aufweisen, die mit kleinen Lipidvesikeln gefüllt sind, was möglicherweise die Lipofibroblasten-Linie widerspiegelt, die sowohl für die Lungenentwicklung als auch für die Unterstützung der alveolären Typ-II-Zellen von entscheidender Bedeutung ist. Wenn diese Technik einmal beherrscht ist, können innerhalb von sechs bis zehn Tagen CD146-positive lungenspezifische MSCs gewonnen werden, wobei die Ausbeute jedoch vom Alter und der Spezies des Tieres abhängt. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, schnell zu arbeiten, um die Zellviabilität zu erhalten.Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie die gemischte Lymphozytenreaktion oder Wundheilungs-SAs angewendet werden, um weitere Fragen zur Effizienz von MSCs bei der Hemmung der T-Zell-Proliferation und der Unterstützung der Wundheilung zu beantworten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man CD146-positive lungenspezifische MSCs mittels enzymatischer Verdauung, Dichtegradiententrennung, Plastikadhärenz und Kugelsortierung isoliert.

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Biologie

Rat MSCs wurden aus Oberschenkel-und Unterschenkelknochen isoliert und dann durch magnetische Zellsortierung angereichert. Sortiert Zellen wurden für die Expression der Oberflächenmarker durchflusszytometrisch bestätigt. Diese Zellen wurden auch bei klonaler Dichte kultiviert werden, um einzelne Kolonien bilden, und dann dieser Kolonien wurden durch Klonen Zylinder getrennt.

Isolierung und Anreicherung von Rat mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und Separation von Single-Kolonie Derived MSCs

In diesem Artikel zeigen wir die Isolierung von murinen Wohnsitz Lunge mesenchymalen Stammzellen (MSC Lunge), deren Expansion, Charakterisierung und Analyse der immunmodulatorischen Eigenschaften.

Isolation und Charakterisierung von Hoechst Low CD45 Negative Mouse Lung mesenchymalen Stammzellen

Ein hoch gereinigte Präparation von Mauslunge dendritischen Zellen beschrieben wird. Besonderer Nachdruck wird auf die Isolierung von konventionellen dendritischen Zellen Teilmenge gegeben.

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

In diesem Artikel wurden primäre Lungenendothelzellen aus neonatalen Mäusen isoliert und kultiviert.

Isolierung von primären Lungenendothelzellen der Maus

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus Fettgewebe aus Sprague-Dawley-Ratten.

Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe von Sprague-Dawley-Ratten

Mesenchymale Stammzellen aus dem Kieferknochenmark haben wichtige Funktionen bei der vielfältigen Differenzierung, Selbsterneuerung und Immunmodulation. Sie haben sich als wichtiges Reservoir für Vorläuferzellen in der Gentherapie, im Tissue Engineering und in der regenerativen Medizin erwiesen. Hier stellen wir eine einzigartige Methode zur Isolierung von mesenchymalen Stammzellen des Kieferknochenmarks bei Ratten vor.

Technik zur Isolierung und Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Kieferknochenmark von Ratten

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung lebender immuner und nicht-immuner Populationen aus der Lunge von Mäusen in einem stabilen Zustand und nach einer Influenzainfektion. Es bietet auch Gating-Strategien zur Identifizierung von epithelialen und myeloischen Zelluntergruppen.

Isolierung von lebenden myeloischen und epithelialen Zellpopulationen aus der Lunge der Maus

Das im Folgenden beschriebene Protokoll ist eine einfache und effektive Methode zur Isolierung von Retinoid-haltigen Zellen aus hochgradig heterogenen Lungenzellpopulationen unter Verwendung spezifischer Retinoid-Autofluoreszenz und unter Anwendung einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung.

Isolierung von Lungen-Retinoid-haltigen Zellen durch Zellsortierung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und anschließende Expansion von mesenchymalen Stromazellen und Endothelzellen Kolonie-bildenden Zellen, ohne die Verwendung von tierischen Serum autologen Paare für experimentelle Zwecke der Transplantation zu generieren.

Isolation und tierisches Serum Freie Expansion der menschlichen Nabelschnur Derived mesenchymale Stromazellen (MSCs) und Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (ECFCs)

Primäre Hepatozyten ein wertvolles Instrument, um biochemische, molekulare und metabolische Funktionen in einem physiologisch relevanten experimentellen Systems zu evaluieren. Wir beschreiben ein zuverlässiges Protokoll für Ratte in situ Leberperfusion, die konsequent erzeugt lebensfähigen Hepatozyten bis bis 1,0 ×...

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Erfahren Sie die Isolierung von CD146+ residenten mesenchymalen Stromazellen aus Rattenlungen mittels enzymatischer Verdauung, Dichtegradiententrennung und Magnetbead-Sortierung. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht Studien zur Immunmodulation und Geweberegeneration.

Isolierung von CD146

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